Name: カエノルハブ炎エレガンスにおける2-アラチドノイルグリセロールの定量のための過熱基準の合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: 学ぶ C. elegansにおける内因性2-AGの定量法。重水素標準試薬の合成からLC-ESI-MS/MSによる分析まで、コレステロール輸送研究に応用可能なロバストな手法を確立する。

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この研究は、アジェンシア・ナシオナル・デ・プロモシオン・シエンティフィカ・イ・テクノロジカ(ANPCyT, PICT 2014-3693)からの研究助成金によって支援されました。J.F.d.L.、G.P.、B.H.C.はコニストの仲間です。D.d.M.とG.R.L.は、コニストのリサーチキャリアのメンバーです。私たちは、LC-MS/MS分析と有益な議論のためのゴンサロ・ランベルト(INMET)に感謝しています。ビデオ撮影と編集は、ラミロ・オルテガとマリア・ソレダ・カサソラによって行われました ディレクシオン・デ・コムニカシオン・デ・ラ・シエンシア、ファカルタ・デ・シエンシア・ポリティカ・イ・レラシオネス・インターナショナル、ロサリオのナシオナル・デ・ロサリオ大学。

1. 1-AG-d5調製
注:定量アッセイの定量内部標準として1-AG-d5を取得する場合は、以下に説明するようにプロトコルに従ってください。
<ol><li>差動保護<ol>
<li>一次アルコールのみを保護するために、まずパスツールピペットを使用して10 mL反応管にグリセロールd8の38mgを追加し、磁気攪拌機を追加します。</li>
		<li>5 mLハミルトンシリンジを使用して無水ジクロロメタン(DCM)の5 mLを追加し、不活性な雰囲気を得るために乾燥N2でチューブを充填します。</li>
		<li>蒸留酢酸エチルで満たされた浅いデュワーフラスコを使用してお風呂を準備します。</li>
		<li>気密に閉じた反応管を浴中に入れ、溶媒が凍るまで酢酸エチルに液体N2をゆっくりと加えて冷却する。 注意:液体は室温(RT)で激しく沸騰し、目や皮膚に接触すると重度の火傷を引き起こす可能性があります。</li>
		<li>ハミルトン注射器を使用して54mgの無水コリジンを添加します。 注意:コリジンは揮発性であり、非常に強く、不快な香りを持っています。</li>
		<li>塩化テルトブチルジメチルシルを70mg加え、磁気攪拌機で-78°Cで3時間全体をかき混ぜます。</li>
		<li>3時間後、RTで温めるために反応を残し、さらに12時間撹拌し続けます。</li>
		<li>反応をクエンチするために塩水の2 mLを追加します。</li>
		<li>分離漏斗を用いて蒸留ジクロロメタンの2mLで溶液3xを抽出し、毎回有機抽出物を保存する。</li>
		<li>3つの有機エキスを組み合わせ、硫酸ナトリウムの上に乾燥させます。</li>
		<li>溶媒の突起を避けるために、真空ロータリーエバポレータで減圧下でジクロロメタンを慎重に蒸発させます。</li>
		<li>シリカゲルを静止相として使用し、100%ヘキサンから始まり、酢酸エチル100%で仕上げ、10%増加したヘキサン/酢酸エチルグラデーションを使用して、カラムクロマトグラフィーによって粗混合物を浄化します。</li>
		<li>製品含有画分を組み合わせ、真空ロータリーエバポレーターで減圧下で溶媒を除去し、無色液体として純粋な1-O,3-O-bis-(TBDMS)グリセロールd5を得ます。</li>
	</ol></li>
	<li>エステル<ol>
<li>1-O,3-O-bis(TBDMS)-グリセロール-d5(以前に合成)の10mgをパスツールピペットを使用して10mL反応管に加え、磁気攪拌機を添加する。</li>
		<li>5 mLハミルトンシリンジを使用して無水ジクロロメタンの2 mLを追加し、不活性な雰囲気を得るために乾燥N2でチューブを充填します。</li>
		<li>氷浴を使用して溶液を0°Cに冷却します。</li>
		<li>多体調節可能なマイクロピペットを使用してアラキドン酸の36mgを追加し、攪拌します。</li>
		<li>4-ジメチルアミノピリジンの15 mgを追加し、攪拌.</li>
		<li>多体調節可能なマイクロピペットを使用してN、N'-ジソプロピルカルボジミドの15mgを追加し、攪拌します。</li>
		<li>混合物を0°Cで3時間反応させます。</li>
		<li>3時間後、RTで温めるために反応を残し、さらに12時間撹拌し続けます。</li>
		<li>反応をクエンチするために水の2 mLを追加します。</li>
		<li>分離漏斗を用いて蒸留ジクロロメタン(DCM)の2mLで有機溶液3xを抽出する。</li>
		<li>3つの有機エキスを同じチューブに入れ、硫酸ナトリウムの上に乾燥させます。</li>
		<li>溶媒の突起を避けるために、真空ロータリーエバポレータで減圧下でジクロロメタンを慎重に蒸発させます。</li>
		<li>シリカゲルを静止相として使用し、100%ヘキサンから始まり、50%ヘキサン/50%酢酸エチルで仕上げ、10%増加ヘキサン/酢酸エチルグラデーションを使用して、カラムクロマトグラフィーによって粗混合物を浄化します。</li>
		<li>製品含有画分を組み合わせ、真空ロータリーエバポレータで減圧下で溶媒を除去し、黄色がかった液体として純粋な1-O、3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5を得ます。</li>
	</ol></li>
	<li>デプロテクション<ol>
<li>1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5(以前に合成)の15mgをパスツールピペットを使用して10mL反応管に加え、磁気攪拌機を添加する。</li>
		<li>5 mLハミルトンシリンジを使用して無水THFの2 mLを追加し、不活性な雰囲気を得るために乾燥N2でチューブを充填します。</li>
		<li>氷浴を使用して溶液を0°Cに冷却します。</li>
		<li>ハミルトン注射器を用いてTHFに1Mテトラブチラムモニウム溶液を150μL滴下に添加します。</li>
		<li>RTに反応を暖め、1時間かき混ぜます。</li>
		<li>1時間後、反応をクエンチするために水の2 mLを追加します。</li>
		<li>分離漏斗を用いて蒸留ジクロロメタンの2 mLで溶液3xを抽出する。</li>
		<li>3つの有機エキスを組み合わせ、硫酸ナトリウムの上に乾燥させます。</li>
		<li>真空ロータリーエバポレータ内の減圧下でジクロロメタンを蒸発させ、黄色がかった液体として純粋な1-AG-d-d5を得る。</li>
	</ol></li>
	<li>シリカゲル60 F254プレコーティングされたアルミニウムシート上で行われる薄層クロマトグラフィーによってすべての反応を監視します。4-アニサルデヒドのエタノール溶液で染色した後、254 nm UVランプの下のバンドを視覚化します。</li>
</ol>2. 標準在庫および測定ソリューションの準備
<ol><li>ACNの1mLに内部標準1-AG-d5の1mgを溶解し、1分間超音波処理し、1,000 ppmの標準ストック溶液を得る。</li>
	<li>ワームの定量に使用される1,000 ppb溶液を調べるために、まず10ppm溶液を調べ、ハミルトンシリンジを使用して10μLのストック溶液を取り出し、ACNの990 μLを加えて1mLの最終体積に希釈します。</li>
	<li>ハミルトンシリンジを使用してステップ2.2で生成された溶液から100μLを取り出し、ACNの900 μLを加えて1mLの最終体積に希釈し、定量に使用される1,000 ppb溶液を得ます。</li>
	<li>完全な可溶化を確保するために、各ステップの間に1分間超音波処理。基準の濃度と完全性を維持するために、-78 °Cで溶液を保管してください。標準的な溶液を使用した後、酸化を防ぐためにバイアルを閉じる前にいくつかの窒素を流します。</li>
</ol>3. C.エレガンスの成長と維持
注:大腸菌OP50で線虫成長培地(NGM)寒天プレートを播種し、これらのプレート上にワームを伝播します。
<ol><li>NaClの3gを寒天の17gと混ぜます。</li>
	<li>2.5gのペプトンを加え、H2Oの975 mLを加えます。</li>
	<li>オートクレーブを50分間冷却し、フラスコを55°Cに冷却します。</li>
	<li>以下を混合する:1 M CaCl2の1 mL、1 M MgSO4の1 mL、1M KH2PO4バッファーの25 mL(いずれも以前にオートクレーブされた)、およびエタノール中の5mg/mLコレステロールの1mLを混合する。</li>
	<li>無菌環境を維持しながら、NGM溶液を60mmペトリプレートに分配し、プレートを体積の3分の2に充填します。プレートを4°Cに保存します。</li>
	<li>-80 °CグリセロールストックからLB寒天プレートに大腸菌細菌培養剤をストリークします。それは37 °Cで一晩プレート上で成長してみましょう。</li>
	<li>攪拌で37°Cで一晩液体LBの100 mLを接種するために単一のコロニーをピックアップします。 注:この株は、この時間の間に静止した段階に達することができるので、O.D.をチェックする必要はありません。</li>
	<li>保存されたNGMプレートを取り外し、層流フードの蓋を取り外し、プレートから余分な水分を蒸発させるために開いたままにしておきます。</li>
	<li>プレートを乾燥させたら、パスツールピペットを使用して、広がることなくプレートの中心にOP50大腸菌の100 μLを追加します。</li>
	<li>OP50大腸菌の芝生を放置し、RTまたは37°Cで8時間一晩成長します。</li>
	<li>次亜塩素酸塩処理または「漂白」(セクション4)によって得られた所望の数のワーム胚を加える。 注:ワームを追加する前に、RTにプレートを冷却します。</li>
</ol>4. Cエレガンス培養を同期させる漂白技術
<ol><li>6 cm NGM プレートに種子とチャンクワーム。</li>
	<li>プレート上の卵と灰色の大人の十分な数を得るために2〜3日間成長するワームを残します。</li>
	<li>十分な卵/大人ができたら、プレートにM9の5 mLを注ぎます。</li>
	<li>ガラスピペットを使用して15 mL遠心チューブにワームを転送します。</li>
	<li>2,000 x gでチューブを遠心分離し、ワームをペレットします。</li>
	<li>M9の大部分を吸引し、ワームペレットの乱れを回避する。</li>
	<li>漂白液の3 mLを加える(NaOH:NaOCl:H2Oの2:1比)。</li>
	<li>溶液を5分間、または無傷の成虫の数が減少するまで、穏やかに反転します。 注意:5分以上漂白しないでください。</li>
	<li>2,000 x gで1分間遠心分離機を吸引し、ワームペレットを邪魔することなく漂白液のほとんどを吸引する。</li>
	<li>M9の15 mLを追加し、よく混ぜます。</li>
	<li>1分間2000 x gで再び遠心分離機。</li>
	<li>ワームペレットを邪魔することなく、M9の大部分を吸引する。</li>
	<li>手順 4.10-4.12 をもう 1 回または 2 回繰り返します。</li>
	<li>新鮮なM9の5 mLを追加し、攪拌します。</li>
	<li>卵は穏やかな揺れで一晩孵化してみましょう。</li>
</ol>5. ワームサンプル調製
<ol><li>漂白手順により得られたN2胚をM9バッファー(15mL遠心管中5mL)で一晩孵化させ、20°Cで行う。</li>
	<li>2,000 x gで2分間チューブを遠心分離することによって同期L1を収穫する。</li>
	<li>M9バッファー1xでワームを洗浄し、ライブL1ワームの数を定量化します。</li>
	<li>約10,000匹のミミズをNGMプレート(直径10cm)に種をまき、1mLのOP50大腸菌(以前に乾燥)する。</li>
	<li>ワームがL4段階に達するまで、20°Cで48時間プレートをインキュベートします。</li>
	<li>15 mL遠心管で冷たいM9バッファーを使用してワームを収穫し、それらを1倍に洗浄し、1.5 mLチューブに移します。</li>
	<li>2,000 x gで1分間遠心分離してワームをペレットし、上清の大部分を除去し、液体窒素にチューブを浸し、-80°Cで保存します。</li>
</ol>6. 脂質抽出
<ol><li>氷上でN2に属する凍結ワームペレットを約100μLで解凍し、1.3mLのメタノールを加え、4分間超音波処理します。</li>
	<li>クロロホルムの2.6mL、および0.5M KCl/0.08 MH 3PO4の1.3mLを最終比1:2:1、内部標準1-AG-d5の1,000ppb、および50μg/mLの最終濃度で抗酸化剤としてブチル化ヒドロキシトルエンを添加する。</li>
	<li>超音波水浴で1分間サンプルを渦にし、氷の上で15分間超音波水浴で超音波処理します。</li>
	<li>2,000 x gで1分間サンプル2xと遠心分離を2倍、遠心分離を行い、位相分離を誘導します。</li>
	<li>下相を回収し、きれいなチューブに集め、窒素の下で乾燥させ、ACNの100μLで固体残渣を再中断します。</li>
</ol>7. HPLC-MS/MSによるエンドカンナビノイド分析
<ol><li>ESI三重四重極質量分析計と組み合わせた液体クロマトグラフィーを使用して、線虫サンプルから2-AGを検出して定量します。</li>
	<li>逆相 HPLC には次の比率を使用します: 0.0-0.5 分 H2O:ACN (40:60), 0.5-6.5 分 H2O:ACN (40:60) から (25:75) 6.. 5-7.5 分 H2O:ACN (25:75), 7.5-8.0 分 H2O:ACN (25:75) から (40:60), 8.0-12.0 分 H2O:ACN (40:60)</li>
	<li>カラム温度を40°Cに保ち、オートサンプラートレイ温度を10°Cに設定します。</li>
	<li>次のイオン化条件を設定します: 正イオンモード;乾燥ガス (N2)温度 = 300 °C;乾燥ガス流量 = 10 L/分;ネブライザー圧力 = 10 UA;とキャップ。電圧 = 4 kV。</li>
	<li>アナリテ検出では、2-AG の場合は 379.2 m/z から 289.2 m/z までの MRM を使用します。1-AG-d5の場合は 384.2 m/z から 289.2 m/z まで。</li>
</ol>8. ワームにおけるエンドカンナビノイド定量
<ol><li>過量化内部標準 1-AG-d5を使用し、内部標準に対するアナリテのピーク面積比を計算します。</li>
	<li>2-AG の場合は、384.2 m/z から 287.2 m/z の遷移を使用します。1-AG-d5の場合は 379.2 m/z から 287.2 m/z まで。</li>
	<li>標準の濃度値を用いて、過熱規格のピーク面積比と比較して内因性2-AGの濃度を算出する。</li>
</ol>

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<li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine%2C+N-oleoylethanolamine%2C+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li>
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著者は利益相反を宣言しない。

エンドカンナビノイドは、C.エレガンス7におけるダウアー形成の調節に関与している脂質のクラスである。より具体的には、多価不飽和脂肪酸(PUFA)の合成は、コレステロールの密売およびワームの生殖発達にとって重要である。2-AG、エンドカンナビノイドを含むアラキドン酸は、コレステロール代謝を損なったワームの通常のサイクルにダウアー幼虫を回復させる責任があることがここで明らかにされた7.
最近発見されたコレステロールの人身売買および他の生物学的プロセスの増強における2-AGの重要性と、脂質がこのプロセスにどのように影響するかについてほとんど知られていないことを考えると、この内因性カンナビノイドの信頼性の高い検出方法が必要である。この単純で堅牢な合成法の開発に成功し、このプロトコルでは、低級アナログ1-AG-d5を得ることが重要なステップです。
モノアシルグリセロールを定量化する報告された方法のほとん...

エンドカンナビノイドは、様々な生物の中で複数の生物学的プロセスを調節し、脂質メディエーター1を保存している。最初に発見され、最もよく特徴付けられたエンドカンナビノイドは、アナンダミド(アラキドノエレタノールアミド、AEA)および2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)である。エンドカンナビノイドは、脳報酬システムだけでなく、薬物中毒、記憶、気分、代謝プロセス2に関与するものを含む多くの重要な役割を果たしています。AEAおよび2-AGは必要なときだけ合成され、短い寿命を持ち、輸送タンパク質の再取り込みおよび加水分解3によって分解される。
カエノルハブ炎エレガンス(C.エレガンス)のような動物モデルの使用は、アポトーシス、細胞シグナル伝達、細胞周期、細胞極性、遺伝子調節、代謝、老化を含む多種多様な生物学的プロセスを研究することが重要になっています。と性決定4,5.さらに、C.エレガンスは多価不飽和脂肪酸(PUFA)の生理的役割を研究するための優れたモデルです。AEAはC.エレガンスで同定され、食事制限6の下で減少する。この欠乏は、内因性カンナビノイドの補充によって抑制することができる食事制限メカニズムを介して線虫の寿命を延ばす.最近、2-AGとAEAがC.エレガンス7におけるコレステロール密売の規制において基本的な役割を果たしていることが判明した。さらに重要なことは、外因性2-AGによる補充は、ニーマンピックタイプC1 C.エレガンス変異体におけるコレステロールの密売障害によって引き起こされるダウアー逮捕を救うことができると判断された。
線虫内のコレステロールの密売やその他の生物学的プロセス(すなわち、単一アミノ化作動性シグナル伝達、非cicepepingおよび移動)との2-AGの関係をより深く理解するためには、この内因性代謝産物とその方法を研究することが重要である。特定の環境および食事条件の下で影響を受ける8,9,10,11,12,13.したがって、異なる分野の科学者、特にこれに関連して線虫の行動を研究する人にとって使いやすいC.エレガンスの内因性2-AGを検出し、定量する方法を設計し、最適化することが不可欠です。エンドカンナビノイド。
2008年、レトネンと同僚は、LC-MS分析方法14を用いてC.エレガンスの2-AGおよびAEAを同定することに成功した。2011年に、彼らは他のエンドカンナビノイド15にこの技術を拡大することができました。より最近の研究は、質量分析およびGC-MS16、17、18を含むC.エレガンスにおけるエンドカンナビノイドの検出と定量化に成功した他の分析方法を示しており、同様の分析方法が他のモデル19に拡張できることも報告されている。
生物学的試料中の2-AGを定量するために使用される以前に報告された分析方法は、通常、商業的に取得され、購入20、21の可用性を必要とする過形規格の使用を伴う。エンドカンナビノイドのLC-MS/MS定量のための多くの分析基準は、異なるプロバイダから市販されています。それにもかかわらず、それらは高価であり、敏感であり、複数の二重結合の存在のために、時間の経過とともに酸化される。これらの標準の最も一般的なバージョンは、オクタ割溶化アラキドン酸に基づいており、同位体希釈LC-MS/MS14、22による定量に適しています。また、これらの標準のほとんどは、グリセロールの位置2に置き換え、彼らはアシル移行19、23に傾向があるので、ほとんどの条件下で不安定になります。
これらの過熱規格のコストおよび安定性に関連する困難を克服するために、グリセロールd5に基づいて分析標準を調製するための便利で簡単な方法が提示される。ペンタ割り当て標準を調製する順序は、標準の1-AG-d5をもたらす3段階の手順を必要とし、これは安定しており、アシル移行を受けていない(2-モノアシルグリセロールの合成を目指す場合の主な問題)。
ここでの主な目的は、分析的過熱規格の合成、線虫サンプルの調製と抽出、LC-MS/MSによる分析を含む、C.エレガンスにおける2-AGを研究するための簡単で再現性の高い方法を示す(図1)).この合成手順は、高度な有機合成知識や特殊な装置なしで達成可能であり、内因性カンナビノイドの影響下でC.エレガンスの行動を研究している異なる分野の科学者に適しています。この方法は他のスタディモデルにも拡張可能で、異なるターゲットに役立ちます。ここで報告されているように、この規格は、再現可能な方法で2-AGの効果的な検出と定量を可能にする高速で信頼性の高いクロマトグラフィー法の開発に成功するために適用されています。

<table><tbody><tr><td>4-ジメチルアミノピリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107700</td><td>試薬グレード、99%</td></tr> <tr><td>抗酸化剤 BHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W21805</td><td></td></tr><tr><td>アラキドン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10931</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール-d8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>447498</td><td></td></tr><tr><td>質量検出器 トリプル四重極</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>TSQ Quantum Access Max</td></tr><tr><td>N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125407</td><td></td></tr><tr><td>NMR 分光計</td><td>Bruker</td><td></td><td>Avance II 300 MHz</td></tr><tr><td>逆相 HPLC カラム</td><td>Thermo Fisher</td><td>25003-052130</td><td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td></tr><tr><td>tert-Butyldimethylsilyl Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190500</td><td>試薬グレード、97%</td></tr><tr><td>フッ化テトラブチルアンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216143</td><td>1.0M in THF</td></tr><tr><td>UHPLC システム</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td></tr><tr><td>ワーム N2 ブリストル</td><td>Caenorhabditis 遺伝学センター (CGC)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

カエノルハブ炎エレガンスにおける2-アラチドノイルグリセロールの定量のための過熱基準の合成

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

本研究では、液体クロマトグラフィー・エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法(LC-ESI-MS/MS)により、2-アラキドノールグリセロール(2-AG)を定性的かつ定量的に分析する分析基準を作成する方法を提示する。エンドカンナビノイドは、様々な生物の複数の生物学的プロセスを調節する保存脂質メディエーターです。C.エレガンスでは、2-AGは、ダウアー形成およびコレステロール代謝の変調を含む異なる役割を有することが見出されている。本報告では、2-AG定量に必要な過量規格のコストと安定性に関連する困難を克服する方法について説明する。標準の合成のためのプロシージャは簡単で、有機合成の専門知識または特別な装置の必要性なしであらゆる実験室で行うことができる。さらに、C.エレガンス培養から過熱基準を抽出するフォルチ法の改変について説明する。最後に、安定な同位体標識アナログ1-AG-d5を用いて2-AGを検出する定量的および分析的方法について説明し、高速クロマトグラフィー実行で信頼性の高い結果を提供する。この手順は、異なる生物における代謝産物の他の研究にも適用可能である一方で、C.エレガンスにおける2-AGの複数の役割を研究するのに有用である。

同位体標識されたアナログを、3段階合成法を用いて市販のd8-グリセロールおよびアラキドン酸から合成することに成功した(図2、図3)。これらのステップは簡単で、洗練された装置、特別に制御された条件、または高価な試薬を必要としない。したがって、この方法は堅牢であり、異なる脂肪酸を含むモノアシルグリセリドを合成するために正常に拡張されてもよい。
1-AG-d5は、核磁気分光法を用いて構造的に特徴付けられた。1H NMRは、アラキドノイル鎖の8つのビニル陽子と2.40ppmのトリプレットを統合する5.44ppm〜4.93 ppmの特徴的な多重を示し、カルボニル基に対するα位置の2つの陽子に相当する。2DNMRでは、グリセロール部の5重水素に割り当て可能な2...

本研究では、C.エレガンスにおけるエンドカンナビノイド2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)を検出し、定量する堅牢でわかりやすい方法について述べている。同位体希釈および液体クロマトグラフィー-エレクトロプレーメントイオン化タンデム質量分析法(LC-ESI-MS/MS)による2-AGの定量に使用した分析的過熱規格です。

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

エンドカンナビノイドは、様々な生物の複数の生物学的プロセスを調節する保存された脂質メディエーターである。最初に発見されたエンドカンナビノイドは、アナンアミドおよび2-アラキドノイルグリセロール、2-AGである。線虫C.elegansは、多種多様な生物学的プロセスを研究するための強力な動物モデルです。最近、C.elegansにおけるコレステロールの密売の調節において、2-AGが基本的な役割を果たしていることを発見しました。これが、C.elegansでの検出と定量化によって内因性2-AGを研究する方法を設計し、最適化することが不可欠となった理由です。生物学的サンプルにおける2-AGを定量化する以前に報告された分析方法は、通常、商業的に取得された重水素規格の使用を含み、それらを購入可能にする必要がある。それにもかかわらず、それらは高価であり、複数の二重結合の存在のために、時間の経過とともに酸化されるに敏感である。標準の最も一般的なバージョンは、液体クロマトグラフィー、および後質量分析法による同位体希釈法による定量に適したオクタード化アラキドン酸に基づいています。2-AGを定量化するための重水素規格のコストと安定性に関連する困難を克服するために、我々は重水素-5-グリセロールに基づく分析標準を調製するために便利で簡単な方法を用いた。ペンデュート規格を準備するためのシーケンスには、3つの手順が必要です。必要になるまで保護された形で保管することが可能であること。この研究の主な目的は、C.elegansにおける2-AGを分析的な重水素規格の合成から線虫サンプルの調製と抽出、そして最後に液体クロマトグラフィーと質量分析による分析まで、完全な方法を示す。定量アッセイのための重水素化された内部標準として重水素化1-AGを得るためには、3段階のプロトコルに従う。一次アルコールのみを保護するために、まずパスツールピペットを使用して10ミリリットル反応管に重水素化グリセロール38ミリグラムを加え、磁気スターラーを加えます。次に、5ミリリットルのハミルトンシリンジを使用して無水DCMを5ミリリットル加え、チューブに乾燥窒素を充填して不活性雰囲気を与えます。蒸留した酢酸エチルを充填した浅いデュワーフラスコを使用してお風呂を準備します。密閉反応チューブを槽内に充填し、溶媒が凍結するまで酢酸エチルに液体窒素をゆっくりと加えて冷却します。注意,液体は室温で激しく沸騰し,眼や皮膚に接触すると重度のやけどを引き起こす可能性があります。次に、ハミルトン注射器を使用して無水コリジンの54ミリグラムを追加します。注意,コリジンは揮発性であり、非常に強く不快な臭いを有する。70ミリグラムのテルブタイルジメチルセチルクロリドで、磁気スターラーでマイナス78度で3時間攪拌します。反応を消すために2ミリリットルのブラインを加えます。2ミリリットルの蒸留ジクロロメタンを2ミリリットルずつ抽出し、毎回有機抽出物を保持する分離された漏斗を使用します。次に、3つの有機抽出物を組み合わせ、亜硫酸ナトリウムを乾燥させます。シリカゲルを定常相として用いたカラムクロマトグラフィーと、100%ヘキサンから始まる10%上昇した酢酸エチル勾配で粗混合物を精製し、100%酢酸エチルで仕上げる。このエステル化ステップでは、パスツールピペットを使用して10ミリリットル反応チューブに記載された製品の10ミリグラムを追加し、磁気攪拌機を追加します。5ミリリットルのハミルトンシリンジを使用して2ミリリットルの無水DCMを加え、チューブに乾燥窒素を充填して不活性雰囲気を与えます。氷浴を使用して溶液をゼロ度に冷却します。Ad 36 マルチボリューム調整可能なマイクロピペットを使用してアラキドン酸のミリグラムとかき混ぜる.その後、 15 40-メチルアミノピリジンのミリグラムを追加し、かき混ぜる.マルチボリューム調整可能なマイクロピペットを使用してジアシルプロピルカルボジミドの15ミリグラムを追加し、かき混ぜます.2ミリリットルの水を加え、反応を焼き付け、分離漏斗を使用して2ミリリットルの蒸留DCMで溶液を3回抽出します。3つの有機抽出物を亜硫酸ナトリウムで乾燥し、シリカゲルを静止相として使用して粗混合物を精製し、その後100%ヘキサンから始まり、50 50%ヘキサン酢酸エチルで仕上げます。最後に、脱保護工程のために、パスツールピペットを使用して10ミリリットル反応管に、以前に合成された生成物の15ミリグラムを加え、磁気攪拌機を加えます。5ミリリットルのハミルトン注射器を使用して無水テトラヒドロフランを2ミリリットル加え、チューブに乾燥窒素を充填して不活性雰囲気を与えます。その後、氷浴を使用してゼロ度に溶液を冷却します。ハミルトンシリンジを使用してTHFでフッ化テトラブチラムモニウムの1モル溶液の150マイクロリットルのドロップワイズを追加します。1時間後、反応を消すために2ミリリットルの水を加えます。分離漏斗を使用して2ミリリットルの蒸留DCMで溶液を3回抽出する。3つの有機抽出物を組み合わせ、亜硫酸ナトリウムの上に乾燥させます。漂白手順では、種付き6センチメートルNGMプレートにワームを回します。皿の上に卵とグラビッド大人がたくさんあるように、ワームが2〜3日成長することを許可します。卵と大人がたくさん入ったら、5ミリリットルのM9をプレートに注ぎます。ガラスピペットを使用して、ワームを15ミリリットルのハヤブサチューブに移します。2,000Gでチューブを2分間遠心分離し、ワームをペレットします。M9の大部分を、ワームペレットを邪魔することなく吸引します。漂白液を3ミリリットル加え、約5分間反転するか、無傷の成虫の数が減少するまで、溶液を穏やかに混ぜます。ほとんどの体が溶解したら、遠心分離機は2,000 Gで1分間行います。ワームペレットを乱すことなく、漂白液のほとんどを吸引します。チューブにM9の15ミリリットルを追加し、よく混ぜます。2,000Gで再び遠心分離機を1分間行う。M9の大部分を、ワームペレットを邪魔することなく吸引します。ワームサンプル調製の場合、漂白手順によって得られたN2胚を20度のM9緩衝液中に一晩入れさせた。次いで、2,000 Gでチューブを2分間遠心してL1sを収穫し、M9バッファでワームをもう一度洗浄し、生きたL1の数を定量化する。播種約10,000虫を、以前に乾燥したOP 50大腸菌の1ミリリットルでNGMプレートに入る。ワームがL4段階に達するまで、少なくとも20度でプレートを48時間インキュベートします。50ミリリットルのハヤブサチューブに冷たいM9バッファーを使用してワームを収穫します。もう一度洗って、1.5ミリリットルのチューブに移します。2,000Gで1分間遠心分離により虫をペレット化する。上清のほとんどを排除します。その後、チューブを液体窒素に浸し、マイナス80度で攪拌します。N2に属する約100マイクロリットルの凍結ワームペレットを解凍し、1.3ミリリットルのメタノールを加えます。その後、サンプルを4分間超音波処理します。超音波処理の後、1,000ppbの内部重水素標準、2.6ミリリットルのクロロホルム、0.5モルの塩化カリウム、0.08モルの蛍光体を1対1の最終比に加えます。1分間サンプルを渦出し、氷の上で15分間超音波水浴でそれらを超音波処理します。再び2回2回試料を1分間渦化し、2,000Gで10分間遠心分離して相分離を誘導する。低相をきれいなガラス管に集め、窒素の下で乾燥させ、100マイクロリットルのアセトニトリルで再懸濁します。内因性2−AGの定量化を成功させるためには、3段階法を用いて飽和アナログを合成する必要があった。その後、ワームサンプルに添加し、高速液体クロマトグラフィーによって抽出および分析し、質量分析に結合した。内部標準として使用され、合成重水素化1-AGは内因性代謝産物を定量化するツールであった。この方法は、2-AGの遷移とグリセロール分子が失われる重水素化1-AGの遷移を用いて最適化された。C.elegansサンプルからの2-AG内因性は、質量分析に結合した高速液体クロマトグラフィーを用いて化学的に合成されたデュータナイズされた1-AGで同位体希釈によって検出され、定量化された。サンプル1は、重水素化標準1-AGで調製し、一方、サンプル2は標準を除く。試料1及び3個の除行標準の元の濃度は1,000ppbずつであったため、ピーク面積比から試料3の場合は340ppbの試料中の2-AGの内因性濃度を計算し、サンプル3に360ppbの平均を与える。この比率は、2−AGのピーク領域と重水素化1-AGの間の品質として、それぞれ2つの単離されたサンプルについて計算した。重水素化された標準との両方が抽出に前に追加した。コレステロールの密売の強化における2-AGの最近発見された重要性と、脂質がそのプロセスに及ぼす影響の情報の欠如を考えると、このエンドカンナビノイドには信頼できる検出方法が必要であった。このプロトコルの重要なステップは、ここで報告された単純で堅牢な合成方法の開発に成功し、重水素化アナログ2-AGを得ることが重要なステップでした。報告されたモノアシルグリセロールを定量化するほとんどの方法は、通常の貯蔵条件下で高価で不安定である市販の分析基準の使用を含み、低予算の実験室では到達不能になります。しかし、この方法は、よりアクセスしやすい出発材料を用いて標準の合成を提案することによってこれを解決する。合成方法は、高度な条件が必要なくまっすぐに進み、低予算であっても、最小限の装置と反応物へのアクセスで任意の実験室で行われることが理想的です。要約すると、この新しい手順は、C.elegansのコレステロール密売におけるこれらのエンドカンナビノイドの役割の説明の後に提起されたいくつかの質問に答えるのに役立つ2-AGを検出し、定量化する簡単で再現可能な方法を説明する。

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