Name: 自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 学ぶNAPPAタンパク質マイクロアレイを用いたキナーゼ阻害剤のハイスループットスクリーニング法。ヒト由来の無細胞タンパク質合成系で活性キナーゼを発現し、イマチニブやイブルチニブの選択的阻害効果を複数キナーゼ間で比較評価できる新規創薬プラットフォームです。

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著者たちは、プロジェクトの開発中に彼らの助けと批判のためにLaBaerの研究室のすべての人に感謝したいと思います。このプロジェクトは、NIH助成金U01CA117374、U01AI077883、バージニアG.パイパー財団によって支援されました。

<ol><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting protein kinases.</a> Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).</li>
<li>Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases.</a> Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).</li>
<li>Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA-approved+small-molecule+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacological+Sciencies%22%5BJournal%5D)">FDA-approved small-molecule kinase inhibitors.</a> Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).</li>
<li>Heinrich, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+c-kit+receptor+tyrosine+kinase+activity+by+STI+571%2C+a+selective+tyrosine+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor.</a> Blood. 96 (3), 925-932 (2000).</li>
<li>Stagno, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+frontline+treatment+and+long-term+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+Anticancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes.</a> Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).</li>
<li>Ben Ami, E., Demetri, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+safety+evaluation+of+imatinib+mesylate+in+the+treatment+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinions+in+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor.</a> Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).</li>
<li>Ramachandran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein microarrays.</a> Science. 305 (5680), 86-90 (2004).</li>
<li>Festa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+microarray+production+of+freshly+expressed+proteins+in+a+human+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu.</a> Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).</li>
<li>Rauf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+inhibition+of+ERBB4+reduces+cell+growth+in+a+WNT5A-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner.</a> Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).</li>
<li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarray+signature+of+autoantibody+biomarkers+for+the+early+detection+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer.</a> Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Autoantibodies+Associated+with+Basal-like+Breast+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prevention%22%5BJournal%5D)">Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).</li>
<li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+Antibody+Immunome+in+Type+1+Diabetes+Using+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays.</a> Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Antibody+Targets+for+Tuberculosis+Serology+using+High-Density+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Autoantibody+Responses+between+Lung+Adenocarcinoma+and+Benign+Pulmonary+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules.</a> Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).</li>
<li>Montor, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+Pseudomonas+aeruginosa+outer+membrane+protein+immunogenicity+using+self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays.</a> Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).</li>
<li>Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+Protein-Protein+Interactions+Using+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+%28click+chemistry%29-based+detection+of+global+pathogen-host+AMPylation+on+self-assembled+human+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).</li>
<li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody+signature+for+the+serologic+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).</li>
<li>Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+B-cell+receptor+signaling+pathway+as+a+therapeutic+target+in+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL.</a> Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).</li>
<li>Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+in+B+lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib in B lymphoid malignancies.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).</li>
<li>Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cloning+and+expression+library+creation+for+functional+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics.</a> Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).</li>
<li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNASU+plasmid+and+PSI%3ABiology-Materials+repositories%3A+resources+to+accelerate+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しない。

変更とトラブルシューティング NAPPAアレイ上のキナーゼ活性の最適化段階では、観察された背景および低ダイナミックレンジの主なソースの1つは、印刷ミックスで使用されるBSAでした。BSAはアミノシラン表面との架橋に必要な一次アミンを提供し、DNAと捕捉抗体をその場で捕捉した。しかし、BSAはリン酸化が非常に高く、バックグラウンドノイズの上のアレイ上の自動リン酸化信号の検出が困難です。この問題を解決するために、印刷ミックス内のBSAのいくつかの代替案を試験し、ポリリジンが良好な代替として同定された。ポリリジンは、任意のリン酸化部位を欠いている;したがって、非表現配列の背景は非常に最小限です。さらに、ポリリジンで印刷されたマイクロアレイは再現性が高く、良好なレベルのタンパク質を表示します(図2)。
標準的なNAPPAアッセイに対して行われた次の重要な修飾は、ホスファターゼ/DNase処理ステップの添加であった。ホスファターゼを用いたマイクロアレイの処理により、タンパク質合成および捕捉時にIVTTミックスで発生したリン酸化物の除去が可能になります(図3)。このリン酸化の源は、本質的な自動リン酸化活性またはIVTTミックス中に存在するキナーゼの活性からである可能性がある。すべてのリン酸化後発現の除去により、活性であり、自動リン酸化を受けることができるキナーゼの容易な同定が可能となった(図3)。
プロトコル内の重要な手順 NAPPA は堅牢なテクノロジですが、予想どおり、いくつかの重要な手順があります。第1は、適切な濃度で高品質のDNAを獲得することです。品質の悪いDNAや低濃度のDNAを使用すると、いくつかの特徴が適切なレベルで発現および表示されない低品質のマイクロアレイを生成し、アレイ上で分析されるタンパク質の数を減少させます。第2の重要なステップは、マイクロアレイ上のタンパク質の発現です。高レベルの機能性タンパク質を発現するIVTTシステムの使用は、アレイ上のキナーゼ活性を研究するために不可欠です。
TKI スクリーニングの次の重要なステップは、マイクロアレイの処理方法です。マイクロアレイは、プロトコルのどのステップでも乾燥させるべきではなく、バックグラウンド信号を増加させる傷を防ぐために穏やかな取り扱いが推奨されます。実験全体の配列は互いに比較されるので、すべてのインキュベーションステップがすべてのスライドにわたって均等であることを保証することが重要です。たとえば、20 個の配列のバッチを処理して、配列間のインキュベーションの長さの違いを防ぐには、1 つの配列で 1 つのステップを実行するのに必要な時間を考慮する必要があります。
最後に、実験の設計と正と負の両方のコントロールを含めることは、品質管理とデータ分析に不可欠です。コントロールの最初のセットは、各配列に印刷されるもので、負のコントロール(すなわち、空のスポット(印刷された材料なし)、水または空のベクトル(タグのみを発現する)、および正のコントロール(すなわち、精製されたIgG、によって検出される)二次抗体であり、リン酸化レベルの変化に不活性である)。集合的に、マイクロアレイのバックグラウンドレベル、印刷中の持ち越しが可能、検出方法の信号強度を測定します。
コントロールの次のセットは、薬物スクリーニング制御であり、(DMSOの有無に)脱リン酸化および自動リン酸化マイクロアレイを含む。前述のように、脱リン酸化マイクロアレイは、ホスファターゼ処理後のリン酸化のレベルを測定し、したがって、他のすべての実験のベースラインレベルを測定します。ベースラインレベルが低いほど、アッセイのダイナミックレンジが高くなります。自動リン酸化アレイは、すべてのアレイの最大リン酸化レベルを示し、信号は強く明確でなければなりません。これは、データ分析だけでなく、すべての反応がアレイ上で正常に実行されたことを制御として使用されます。
技術の限界 現時点では、ここで提示される薬物スクリーニングの制限の1つは、自動リン酸化することができるタンパク質キナーゼのみをスクリーニングする能力である。これを克服する1つの可能な方法は、同じ場所にキナーゼと既知の基板を印刷することです。2つの異なるタンパク質のDNAの共同印刷は15に成功し、このアプローチの実現可能性を示唆した。さらに、アレイに表示されるタンパク質が正しく折りたたまれないと、不活性なタンパク質が生じる可能性があります。人間ベースの発現システムの使用は、アレイ上で測定されたキナーゼ活性を有意に改善した。しかし、一部のタンパク質は、その非活性のためにアレイ上でまだ分析することができません。
第2の制限は、パン抗ホスホチル抗体を用いたリン酸化の測定である。リン酸化部位のモチーフに関する非特異性にもかかわらず、すべての測定されたリン酸化はチロシン残基で起こり、セリンとスレオニンおよびそれぞれのキナーゼを残した。現在までに、インキュベーションと洗浄条件を最適化する試みが何度か試みられたにもかかわらず、10以上のパンホスホサー/Thr抗体が成功せずに試験されています。抗体に依存しない新しい検出システムは、薬物阻害のためにスクリーニングできるタンパク質キナーゼの数を拡大する最良の選択肢である可能性がある。このコンテキストでは、クリック結合などの放射能や化学的アプローチを含むいくつかのオプションを使用できます。バックグラウンド信号を最小限に抑え、アッセイに良好なダイナミックレンジを提供するには、一連の最適化が必要です。
3 つ目の制限は、アレイに印刷する cDNA クローンの取得です。cDNAクローンは、クリエイターやゲートウェイ23などのサイト固有の組み換えシステムを含む任意のクローン作成技術を使用して生成することができます。もう一つのオプションは、<https://dnasu.org/DNASU/Home.do>で見つかったDNAsuライブラリからクローンを購入することです。.
第4の制限は、すべての実験室が独自のNAPPAアレイを製造し、スクリーニングするための適切な機器が装備されていないことです。このプロトコルは、ハイスループット機器を必要とせずにマイクロアレイ上に印刷するDNAを生成する代替方法と、すべてのハイブリダイゼーションステップを手動で実行するプロトコルを提供します。ただし、アレイアレイスキャナとマイクロアレイスキャナへのアクセスは依然として必要です。この問題を克服する1つのオプションは、カスタマイズされたNAPPAマイクロアレイを非営利の学術価格で配布するNAPPAコアサービスと施設を使用することです。最後に、任意のスクリーニング方法論の時点で、配列上で得られたデータはアーティファクト(正または負のいずれか)に影響を受けやすいため、直交アッセイを使用して検証する必要があります。
既存の方法に関する意義 タンパク質キナーゼのスクリーニングのためにいくつかのプラットフォームが市販されています。日常的に使用されるアプローチの1つは、タンパク質断片、キナーゼドメイン、キナーゼドメインおよび一部の調節領域を有するより大きなタンパク質断片、さらには全長タンパク質で行うことができる結合アッセイです。タンパク質は、通常、発現および精製プロトコルのコストと簡潔さのために細菌系で発現される。目的の薬物とタンパク質との相互作用は、例えば、蛍光またはタグの存在のような何らかのタイプのレポートアッセイで測定される。このアプローチの主な制限は、タンパク質が薬物との相互作用中に必ずしも活性ではないという事実であり、偽陽性および偽陰性相互作用の同定をもたらす可能性がある。タンパク質断片は、特に立体構造の変化や活性の欠如に対して脆弱であり、得られたすべてのデータは、好ましくは全長の形態で、活性タンパク質を使用して検証されるべきである。一部のプラットフォームのもう 1 つの制限は、ATP アナログのみをスクリーニングする機能で、全体的な使用を制限することです。
酵素ベースのアプローチを使用してTKIのスクリーニングのために市販されているサービスのほとんどは、関心のあるキナーゼの野生型バージョンのみを使用し、時には選択された少数の変異体のみを使用します。薬剤耐性がTKIで治療された患者において非常に一般的であることを知ることは、最も適切な阻害剤の選択のために、異なる変異体における薬物応答を測定できることが重要である。NAPPAの性質上、キナーゼ変異体のスクリーニングは簡単で簡単に行うことができ、必要な唯一のツールは、例えば、サイト特異的変異体によって行うことができるNAPPA cDNAコレクションにキナーゼ変異体を組み込むことです。
今後のアプリケーション キナーゼ阻害剤を用いたがん治療における治療の最も一般的な形態の1つは、治療コース中の薬物標的における変異の獲得である。キナーゼ阻害剤に対する応答に関するこれらの変異体のスクリーニングは、各患者に対する個別化された治療を達成するために、TKIの第2/第3世代の選択にとって極めて重要である。ここで提示される薬物スクリーニングアプローチは、ヒトゲノムに存在するチロシンキナーゼのパネルに対して任意のチロシンキナーゼ阻害剤を試験することができる公平なスクリーニングプラットフォームを提供する。NAPPAアレイに表示されるタンパク質は、スライドに印刷されたcDNAからインビトロで発現されるので、任意の変異変異体は、配列に表示されるcDNAコレクションに容易に組み込むことができます。NAPPA技術のハイスループットパワーと組み合わせて、アレイ上でキナーゼ変異体を生成・発現できる施設は、キナーゼ変異体の研究と薬物に対する応答に特有の環境を提供し、NAPPAを適当なものにします。精密医療の目標の一つであるパーソナライズされた薬物スクリーニング。

タンパク質キナーゼは、その標的のリン酸化を担い、多くの細胞機能(すなわち、細胞増殖、分化、細胞死および生存)を制御する複雑な分子経路を調節することができる。キナーゼ活性の自由化は400以上の疾患に関連しており、キナーゼ阻害剤は、癌、心血管および神経疾患、炎症性疾患を含むいくつかの疾患の治療に利用できる薬物の主要なクラスの1つである。および自己免疫疾患1,2,3.
精密医療の出現により、新しい治療法、特にキナーゼ阻害剤の同定は、薬学的および臨床的に大きな魅力を持っています。キナーゼ阻害剤のデノボ設計や既存のFDA承認薬の新しい標的の同定など、キナーゼ/キナーゼ阻害剤の可能な新しいペアの同定にはいくつかのアプローチを使用できます。診療所でこれらの薬剤を実装するために必要な時間とお金は、以前の臨床試験データの可用性のために大幅に削減されているので、後者は、特に魅力的です。キナーゼ阻害剤の転用の正規例は、イマチニブであり、当初はBCR-Ablの阻害を通じて慢性骨髄性白血病(CML)の治療のために設計され、c-Kit過剰発現の治療にも成功する消化管間質腫瘍 (GISTs)4,5,6,7.
キナーゼ阻害剤のスクリーニングは、結合アッセイまたは酵素ベースのアッセイで行うことができる。アッセイの最初のクラスは、タンパク質と薬物の相互作用に焦点を当て、ライゲーション部位や親和性などの情報を提供することができます。これらのアッセイ時のキナーゼの活性は不明であるため、タンパク質の立体構造変化により多くの相互作用が見逃されたり、誤って同定されたりする可能性があります。一方、酵素ベースのアッセイでは、タンパク質キナーゼが活性であり、阻害剤が酵素活性に及ぼす影響に関する貴重な情報を提供する必要がありますが、このタイプのスクリーニングは一般的に時間と費用がかかります。現在、両方のタイプのアッセイは、いくつかのソースから市販されています。彼らは、いくつかの制限を持つキナーゼ阻害剤のスクリーニングのための信頼性の高いオプションを表します: I) 方法のほとんどは、個々の複数のキナーゼのテストを含む, これは、タンパク質の大規模なセットのスクリーニングを高価にすることができます;II)試験されるキナーゼのセットは、事前に選択された野生型キナーゼおよびいくつかのよく知られた変異バージョンのいくつかのキナーゼのリストに限定され、多くの新しい変異型アイソフォームの試験を妨げる。
この文脈では、タンパク質マイクロアレイは、市販の技術によって提示される限界のいくつかを克服することができる強力なプラットフォームです。目的の任意の配列の全長、活性タンパク質を使用してハイスループットスクリーニングで酵素ベースのアッセイを行うのに適しています。マイクロアレイは、NAPPA(核酸プログラマブルタンパク質アレイ)のような自己組み立てアプローチによって生成され、アッセイに間に合うようにタンパク質が発現され、アレイに表示されるものが実際に活性である可能性が高くなります。NAPPAに表示されるタンパク質は、自然な折りたたみおよび活性の可能性を改善するために、ヒト由来のリボソームおよびシャペロンタンパク質を使用して産生される。
タンパク質は、最初に、捕捉タグと融合した目的の遺伝子のコードをマイクロアレイ表面に印刷することによってプログラムされます。その後、インビトロ転写および翻訳(IVTT)システムを使用してマイクロアレイ上でタンパク質が生成され、新たに発現されたタンパク質は捕捉剤によってマイクロアレイ表面に固定化されます。発現されたNAPPA配列は、アレイに表示されるタンパク質の研究に、公平で高スループットの方法8,9で使用することができる。
以前は、NAPPAアレイに表示されるタンパク質が既知のパートナーと相互作用するために適切に折り畳まれたことが示されていました10;さらに、その酵素活性は2018年に初めて利用され、タンパク質キナーゼがマイクロアレイ自動リン酸化11に表示されることが示された。現在までに、NAPPAの方法論は、バイオマーカー発見12、13、14、15、16、17を含む多くの異なるアプリケーションに使用されてきました。タンパク質-タンパク質相互作用10、18、基質同定19、および薬物スクリーニング11。その柔軟性は、各アプリケーションへの適応を可能にするプラットフォームの主要な特性の1つです。
ここでは、自己組み立てNAPPAアレイにおけるチロシンキナーゼ阻害剤のスクリーニングのためのプロトコルが提示される。このプラットフォームは、活性ヒトタンパク質キナーゼの表示および低バックグラウンドおよび高ダイナミックレンジのタンパク質キナーゼ活性の分析に最適化されています。キナーゼ阻害剤のスクリーニングにNAPPAを使用するために実装された修飾の中には、すなわち、印刷化学の変化、II)キナーゼ阻害剤スクリーニング前のタンパク質マイクロアレイの脱リン酸化、およびIII)の検出の最適化が含まれる。アレイ上のリン酸化タンパク質。このプロトコルは、その種の最初であり、NAPPAマイクロアレイにおけるキナーゼ研究に関するユニークな情報を提供します。

<table><tbody><tr><td>試薬/材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>364ウェルプレート(アレイ用)</td><td>Genetix</td><td>x7020</td><td></td></tr><tr><td>800 &micro;L 96ウェル収集プレート</td><td>Abgene</td><td>AB-0859</td><td></td></tr><tr><td>96ピンデバイス</td><td>Boekel</td><td>140500</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>ミリポアシグマ</td><td>1.00066</td><td></td></tr><tr><td>アセトン 99.9%</td><td>ミリポアシグマ</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート用アルミシール</td><td>VWR</td><td>76004-236</td><td></td></tr><tr><td>アミノシラン(3-アミノプロピルトリエトキシシラン)</td><td>ピアス</td><td>80370</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td><td>Millipore Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal)</td><td>Millipore Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>ATP 10 mM</td><td>Cell Signaling</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>&β;-Glycerophosphate 二ナトリウム塩水和物</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>細菌学的寒天</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>37535</td><td></td></tr><tr><td>Brij 35</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>BP345-500</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (ビススルホスクシンイミジル)</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>BSA (ウシ血清アルブミン)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>DeepWell Block, case of</td><td>50 ThermoFisher/AbGene</td><td>AB-0661</td><td></td></tr><tr><td>DEPC water</td><td>Ambion</td><td>9906</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA-intercalating dye</td><td>Invitrogen</td><td>P11495</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ミリポアシグマ</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ミリポアシグマ</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ミリポアシグマ</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 200 プルーフ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>フィルタープレート</td><td>ミリポアシグマ</td><td>WHA77002804</td><td></td></tr><tr><td>ガス透過性シール、50 個入り</td>ボックス <td>ThermoFisher/AbGene</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>ガラスボックス</td><td>ウィートン</td><td>900201</td><td></td></tr><tr><td>スライド グラススライド</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl (塩酸)</td> <td>ミリポアシグマ</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 緩衝液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>ヒトベースのIVTTシステム</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>88882</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoPure Mouse IgG 全分子</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>31202</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>KCl (塩化カリウム)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4(リン酸カリウム一塩基性)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>キナーゼ緩衝液</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9802</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (酢酸カリウム)</td> <td>ミリポアシグマ</td><td>P1190</td><td></td></tr><tr><td>ラムダタンパク質ホスファターゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>リフタースリップ、24 x 60 mm</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25X60I24789001LS</td><td></td></tr><tr><td>金属 30 スライドラック、ハンドルなし</td><td>ウィートン</td><td>900234</td><td></td></tr><tr><td>ミリ><></td><<td>ポアシグマ</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na<サブ>3</サブ>VO<サブ>4 </サブ>サバナジン酸ナトリウム)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (塩化ナトリウム)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaOAc (酢酸ナトリウム)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (水酸化ナトリウム)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.10 / 740414.10</td><td></td></tr><tr><td>Nucleoprep Anion II</td><td>Macherey Nagel</td><td>740503.1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸</td><td>Millipore-Sigma</td><td>79617</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Solution (0.01%)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>A-005-C</td><td></td></tr><tr><td>Protein Phosphatase (Lambda)</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)</td><td>ミリポアシグ</td><td>マL6026</td><td></td></tr><tr><td>SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>05030</td><td></td></tr>シーリングガスケットグレース<tr><td></td><td>バイオラボス</td><td>株式会社44904</td><td></td></tr><tr><td>シリカパケット</td><td>VWR100489-246</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シングルウェルプレート</td><td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム (3M, pH 5.5)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>TB 培地 (Terrific Broth)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T0918</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>IBI scientific</td><td>IB70144</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipments</td><td>Maker/モデル</ストロング></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プログラマブルチリングインキュベーター</td><td>トーリーパインズIN30インキュベーター、</td>バクテリア増殖用冷却<td></td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td>付き <td>ATR マルチトロンシェーカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体廃棄物トラップ付き真空マニホールド</td><td>MultiScreen真空マニホールド 96ウェル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル オートピペット/リキッドハンドラー</td><td>GenmateまたはBiomek FX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体ディスペンサー</td><td>Wellmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAマイクロアレイ</td><td>Genetix QArray2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動ハイブリダイゼーションステーション</td><td>Tecan HS4800 Pro ハイブリダイゼーションステーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロアレイスキャナー</td><td>Tecan PowerScanner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロアレイデータ定量</td><td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

キナーゼ阻害剤のスクリーニングは、薬物の特性をよりよく理解し、臨床的に影響を及ぼす可能性のある新しい標的の同定のために重要である。このようなスクリーニングを達成するためにいくつかの方法論が報告されている。しかし、それぞれに独自の制限があります(例えば、ATP類似体のみのスクリーニング、精製キナーゼドメインの使用の制限、一度に数個以上のキナーゼの試験に関連する多大なコスト、およびタンパク質キナーゼのスクリーニングにおける柔軟性の欠如新しい突然変異)。ここでは、これらの制限の一部を克服し、キナーゼ阻害剤の公平なスクリーニングに使用することができる新しいプロトコルが提示される。この方法の強みは、異なるキナーゼまたは同じキナーゼの異なる変異体間で、複数のタンパク質にわたってキナーゼ阻害剤の活性を比較する能力です。ヒトベースのインビトロ転写および翻訳システム(IVTT)によるタンパク質キナーゼの発現によって生成される自己組み立てタンパク質マイクロアレイが採用されている。マイクロアレイに表示されるタンパク質は活性であり、キナーゼ阻害剤の効果の測定を可能にする。次の手順では、マイクロアレイの生成とスクリーニングからデータ分析まで、プロトコルステップについて詳しく説明します。

自己組織化されたNAPPAマイクロアレイは、バイオマーカーの発見、タンパク質とタンパク質の相互作用、基板同定、薬物スクリーニング10、11など、多くの異なる用途に使用できる固体プラットフォームを提供します。,12,13,14,15,16,17,18,19,20.
NAPPAマイクロアレイ上のチロシンキナーゼ阻害剤のキナーゼ活性およびスクリーニングの研究に採用された全体的な方法論は、図1に概略的に表される。まず、NAPPAマイクロアレイは、コーティングされたマイクロアレイ上にcDNAおよび捕捉剤を固定することによって生成される。cDNは、ヒトベースのIVTTシステムを使用してタンパク質の転写および翻訳のテンプレートとして使用され、新たに合成されたタンパク質は捕捉剤9によって固定化される。印刷されたマイクロアレイの品質は、アレイに表示されるDNAのレベル(一貫した印刷を確認する)またはタンパク質(タンパク質発現および捕捉を確認する)によって監視することができる。図 1)バックグラウンド信号を減少させ、実験のダイナミックレンジを増加させるために、マイクロアレイは1)ラムダホスファターゼで処理され、Ser/Thr/Tyr残基からリン酸化を除去し、その後2)DNaseでその場での化学を簡素化し、減少させる。背景 (図 1)
次のステップは、ATP(負対照アレイ、脱リン酸化マイクロアレイと呼ばれる)が存在しない場合にキナーゼバッファーでマイクロアレイをインキュベートし、キナーゼバッファーをATP(陽性対照、正対照)で補う自動リン酸化反応です。自動リン酸化アレイ)またはATP +DMSO(車両制御)と呼ばれます。この手順では、キナーゼは追加されません。したがって、マイクロアレイに表示される各キナーゼの本質的活性は、パン抗ホスホチロシン抗体を用いてそのリン酸化レベルの測定を通じて定量され、続いてcy3-labbeled二次抗体が続く(図1)。
4ドルプリケートで印刷されたヒトタンパク質キナーゼのパネルを表示するNAPPA-キナーゼ配列の品質管理を図2に示す。固定化されたDNAのレベルはDNA染色によって測定され、マイクロアレイ全体に均一なシグナルを示し、アレイに印刷されたDNAの量が均一であることを示唆した。また、DNA染色なしでいくつかの特徴を観察することも可能である。これらの機能は、DNAが印刷ミックスから省略されたいくつかのコントロールに対応しています[すなわち、空のスポット(何も印刷されなかった)、水の斑点、精製されたIgGスポット(ポリリジン、架本リンカーおよび精製IgG)、印刷ミックスのみ(完全な印刷ミックス:ポリリジン)プラスクロスリンカーおよび抗フラグ抗体、任意のDNAなし)。.NAPPA-キナーゼマイクロアレイに表示されるタンパク質のレベルは、抗タグ抗体を用いたIVTT反応後に評価した。
キナーゼスクリーニングでは、フラグを選択のタグとして使用し、マイクロアレイに表示されるタンパク質のレベルを抗フラグ抗体を用いて測定した。図示すように、cDNAを含むスポットの大半は、検出可能なタンパク質レベルを正常に表示しました。cDNAを持たない対照スポットの一部は、抗フラグ抗体を用いたシグナルを明らかにした:IgGスポット(二次抗体の活性を検出するために使用される)および空のベクタースポット(タグのみのcDNAコード)(図2)。NAPPA-キナーゼマイクロアレイは、0.88より高い異なる印刷バッチ間のタンパク質表示レベルの相関を用いて、スライド間で良好な再現性を示した(図2)。同じバッチ内の相関はさらに高く、0.92に近い(データは示されていない)。
次に、アレイに表示されるタンパク質のキナーゼ自動リン酸化活性を、抗ホスホチロシン抗体を用いて測定した(図3)。アレイに表示されるタンパク質は、発現後の高レベルのタンパク質リン酸化を示した(図3、左)が、配列に表示されるタンパク質の固有のキナーゼ活性またはIVTTミックス中に存在する活性キナーゼによって引き起こされる可能性がある。このリン酸化はラムダホスファターゼ処理で完全に除去され、これらのマイクロアレイはキナーゼアッセイに使用された。脱リン酸化後、ATPなしで行われた自動リン酸化反応は、予想通り有意なレベルのリン酸化を示さなかったが、ATPの存在下でキナーゼバッファーでインキュベートされたマイクロアレイは、タンパク質リン酸化を15分(同15分と示した)図 3)薬物スクリーニングのために、キナーゼ活性を60分後に自動リン酸化反応の後に測定し、試験したキナーゼの数を最大化した。
タンパク質発現直後にリン酸化レベルを測定したマイクロアレイ(図3、左)と自動リン酸化反応の60分後(図3、右)の比較を示した: i) タンパク質リン酸化のみ発現後、IVTTミックスに存在するタンパク質によって外因性リン酸化され得ることを示唆するが、自動リン酸化はできない。ii)タンパク質は、自動リン酸化反応の後にのみリン酸化され、これらのタンパク質はタンパク質発現後に活性でないこと、およびキナーゼバッファーに存在する必要な共因子が活性であることを示唆した。またはiii)両方のアレイ上でリン酸化されたタンパク質は、両方の設定で活性であったことを示唆している(図3)。
NAPPA-キナーゼ配列上のチロシンキナーゼ阻害剤のスクリーニングのために得られた結果の一例として、タンパク質キナーゼ間で明確な選択性を持つ3つのキナーゼ阻害剤が使用された:スタウロスポリン、イマチニブおよびイブルチニブ。すべてのスクリーニングについて、脱リン酸化NAPPAマイクロアレイは、自動リン酸化反応中にTKI(100nMから10uMまで)の濃度を増加させたインキュベートした。最初に試験されたTKIは、グローバルタンパク質キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンであり、事実上すべてのキナーゼを試験した11を超えるマイクロアレイ上で強力なキナーゼ阻害を示した。
次に、イマチニブを試験し、慢性骨髄性白血病および消化管間質腫瘍4、5、6、7の治療に用いられるABLおよびc-Kit阻害剤を用いて行った。NAPPA-キナーゼアレイでは、イマチニブはAbl1およびBCR-Abl1活性の有意な減少を示したが、他のキナーゼはほとんど影響を受けなかった(図4A)。キナーゼ活性のデータ定量は、脱リン酸化配列に対して正規化され、正対制御マイクロアレイのパーセンテージとして表された(車両のみ)。TNK2 (非関連キナーゼ)、Abl1 および BCR-Abl1 のデータを図 4Bに示します。予想通り、イマチニブはAbl1およびBCR-ABl1に対する選択的阻害を示した。c-Kit のデータは、正のコントロールアレイのアクティビティが不足しているため、決定的ではありませんでした。
最後に、ブルトンのチロシンキナーゼ(BTK)のFDA承認共価阻害剤であるイブルチニブを試験した。イブルチニブは現在、慢性リンパ球性白血病(CLL)、マントル細胞リンパ腫、およびウォルデンストロームのマクログロブリン血症21、22を含む、過活動BTKを有するいくつかの血液関連癌の治療に使用されている。図4Cは、イブルチニブスクリーニングのために得られた典型的な結果を代表する。ABL1(非関連キナーゼ)およびBTK(正規標的)およびERBB4(潜在的な新しい標的)のキナーゼ活性を図4Dに示す。データは、ERBB4が用量特異的な方法でイブルチニブによって阻害されうる可能性を示唆している。この阻害は、インビトロおよび細胞ベースのアッセイ11で確認され、このプラットフォームの力を実証した。
まとめると、NAPPA-キナーゼマイクロアレイプラットフォームは、TK阻害剤の公平なスクリーニングに使用できることを示唆している。さらに、スクリーニングは速く、目的のタンパク質キナーゼのあらゆる変化を含むように容易にカスタマイズすることができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> 図1:NAPPAアレイにおけるチロシンキナーゼ阻害剤の品質管理とスクリーニングの概略表現NAPPAアレイは、タグと捕捉抗体と融合した目的のタンパク質に対するcDNAコードで印刷されます。インビトロ転写および翻訳反応(IVTT)の間に合成されたタンパク質は捕獲抗体によってタグを通してマイクロアレイ表面に捕獲される。アレイの品質管理(QC)は、蛍光DNAインターカリング色素を用いてスライド上に印刷されたDNAのレベルと、タグ特異的抗体を用いてアレイに表示されるタンパク質のレベルの測定によって行われます。キナーゼスクリーニングの場合、マイクロアレイはDNaseおよびホスファターゼで処理され、IVTT反応後、タンパク質合成中に生じた可能性のある印刷されたDNAおよび全てのリン酸化を除去する。脱リン酸化アレイは、薬物スクリーンに使用する準備が整いました。各アッセイでは、(I)脱リン酸化配列の3つのコントロールセットが日常的に使用され、自動リン酸化反応はATPなしで行われます。(II)自動リン酸化マイクロアレイは、ATPの存在下で自動リン酸化反応が行われる。(III)DMSO処理アレイ(車両)は、ATPおよびDMSOで自動リン酸化反応が行われる。異なる濃度のキナーゼ阻害剤で処理されたスライドは、DMSO処理アレイに使用される全く同じプロトコルに従います。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> 図2:自己組み立てNAPPA-キナーゼアレイの品質管理の代表的な結果蛍光DNAインターカレート色素(左)と抗フラグ抗体(中央)によって測定されたマイクロアレイ上に表示されるタンパク質のレベルによって測定されたDNA含有量が示されている。右側には、別々のバッチで印刷された2つのNAPPA-キナーゼ配列に表示されるタンパク質のレベルの相関プロットがあります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> 図3:NAPPA-キナーゼ配列におけるキナーゼ活性の代表的な結果四足歩行でタンパク質キナーゼを表示するマイクロアレイは、抗pTyr抗体を用いたタンパク質リン酸化の測定を通じてアレイ上のタンパク質キナーゼ活性を研究するために使用され、続いてcy3標識抗マウス抗体が続いた。ホスファターゼ/DNase処理を伴わず、自動リン酸化反応中にATPを使用せずに対照配列を使用し、タンパク質発現後のバックグラウンドリン酸化(ポスト発現)を測定した。残りのマイクロアレイをホスファターゼ/DNAで処理し、自動リン酸化反応はATP(脱リン酸化マイクロアレイ、陰性対照)またはATP(自動ホスホリン化マイクロアレイ)なしで行った。自動リン酸化マイクロアレイの場合、オートリン酸化反応は、図に示すように15分、30分、45分、または60分間行った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> 図4:NAPPA-キナーゼアレイ上のチロシンキナーゼスクリーンからの代表的なデータ。(A)ホスファターゼ/DNase処理NAPPA-キナーゼアレイは、自動リン酸化反応中にイマチニブの濃度を増加させる中でインキュベートし、キナーゼ活性を抗ホスホチル抗体で測定した。(B)イマチニブに曝露されたNAPPA-キナーゼアレイ上で観察されたキナーゼ活性の定量化。データは、負の対照アレイの信号に対して正規化された(脱リン酸化)、陽性対照アレイのパーセンテージとして示される(DMSOの存在下で行われる自動ホスポリル反応)。同様のデータは、イブルチニブ(C,D)のスクリーニングのために示されている。この図は、ラウフら11から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1.自動ハイブリダイゼーションステーションを用いたNAPPAアレイにおけるチロシンキナーゼ阻害剤のスクリーニングのための代替プロトコル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

キナーゼ阻害剤のスクリーニングのための自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイの生成のための詳細なプロトコルが提示される。

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPAは、タンパク質活性と機能の研究に公平な高スループット方式で使用できる強力なタンパク質マイクロアレイプラットフォームです。NAPPA上に表示されるタンパク質は、天然の折り畳みおよび活性の可能性を向上させるために、ヒト由来リボソームおよびシャペロンを用いたヒトベースの発現系で生成されます。キナーゼ阻害剤のスクリーニングのためのNAPPAアレイの使用は、新薬および臨床的に関連するキナーゼ突然変異のテストのための新しいプラットフォームを提供する。NAPPAの方法論によって生成されるタンパク質マイクロアレイは、バイオマーカー発見、タンパク質とタンパク質相互作用、基質同定、薬物スクリーニングなど、多くの異なる用途に使用できます。途中で品質管理の手順を実行します。DNA調製、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイの品質をテストします。何らかのステップで品質が良くない場合は、最初からやり直してください。手順を実証することは、私の研究室の技術者リサ・ミラーです。家の高い効率のミニ準備のための細菌の成長を準備するために、最初に96ウェル形式でオーガープレートの細菌を接種し、16時間成長させます。翌日、抗体アンピシリンを添加した1.5ミリリットルの素晴らしいスープ培地で深井戸プレートの各井戸を充填します。抗体はプラスミド上の選択マーカーに依存する。その後、80%エタノールと炎で96ピン装置を殺菌する。滅菌96ピン装置を使用して、一晩のインキュベートされた寒天プレートからコロニーを選び、深い井戸プレートの井戸に沈んで培養を接種する。ブロックにガス透過性シールを覆い、シェーカーで37°C、300〜800rpmで22〜24時間インキュベートします。その後、ペレット培養し、原稿に従って培養を再中断する。溶解する細菌は、各ウェルに200マイクロリットルの溶液を加え、プレートをアルミニウムシールで密封し、5回反転します。細胞を正確に5分間インキュベートします。溶液を中和するには、溶液3の200マイクロリットルを加え、アルミニウムシールでプレートを密封し、5回反転します。次いで、プレートを3800G、摂氏4度で回転させ、30分間回転させて、上澄み糖をクリアします。アニオン交換樹脂プレートを調製するには、まず、アニオン交換スラリーを混合し、スラリーをガラストラフに注ぎます。深い井戸の版の上に積み重ねろめろ、廃棄物回収容器として機能する。次に、ワイドボードP1000チップを使用して、スラリーを混合し、450マイクロリットルのスラリーをフィルタープレートの各ウェルに移します。遠心分離機とフロースルーを破棄します。さて、樹脂板と深い井戸ブロックのスタックに溶草上清を移します。積み重ねられたプレートを30倍Gで5分間回転させ、速度を遅くしてフロースルーを破棄します。カラムを洗浄するには、400マイクロリットルの溶液N3洗浄バッファーを各ウェルに加えます。洗浄バッファーを除去するために、樹脂板を真空マニホールドに移します。洗浄工程を3回繰り返し、残りのワッシャーバッファーを30回の短い5分間回転で取り除き、DNAを溶出G.To、樹脂板をきれいな800マイクロリットルの回収プレートに置きます。各ウェルに300マイクロリットルの溶液N5を加え、室温で10分間座らせます。その後、積み重ねられたプレートを20倍Gで5分間回転させ、ゆっくりとランプアップ速度を233倍Gに1分間回転させます。使用前にマイナス20°Cでプレートを保管してください。まず、スライドをラックに置き、2%アミノシラン試薬を含むガラスリザーバにスライドをアセトンに沈めます。スライドを15分間揺らす。その後、スライドをアセトンですすい、その後に水で最後のすすがりします。次に、圧力をかけた空気を使用してスライドを乾燥させます。すべての水滴が除去されるまで、約3分間、すべての角度からそれらを吹き飛ばす。コーティングされたスライドを密閉された箱の中の金属製のラックに室温で保管します。さて、原稿に記載されているようにDNAを沈殿させる。その後、20マイクロリットルの超純水でDNAペレットを再懸濁し、1000rpmで2時間振る。アレイサンプルを調製するには、各DNAサンプルに抗体、架橋剤、ポリリシンを含む、10マイクロリットルの新しいプリンティングミックスを加えます。アルミニウム箔でプレートをシールし、室温で90分間1000rpmで振ります。プレートを摂氏4度で一晩保管してください。印刷日には、簡単に渦を回転させ、プレートを回転させます。各サンプルの28マイクロリットルを384ウェルプレートに移します。アミノシランコーティングスライドと384ウェルプレートをアレイアデッキに配置し、マイクロアレイ印刷プログラムを開始します。印刷が完了したら、マイクロアレイにラベルを付けます。マイクロアレイは、さらに使用されるまで数ヶ月間保存することができます。DNAのレベルを測定するには、スライドをピペットボックスに入れ、50ミリリットルのブロッキングバッファーでそれらをブロックします。室温でロッキングシェーカーのスライドを1時間インキュベートします。次いで、溶液を廃棄し、20ミリリットルのブロッキングバッファーと33マイクロリットルの蛍光DNAインターカレーティング色素を添加する。攪拌で15分間インキュベートします。インキュベーションが終わったら、スライドを超純水で素早くすすい、圧力をかけた空気で乾かします。マイクロアレイをスキャンする準備が整いました。マイクロアレイを表現するには、先に示したようにスライドをブロックし、超純水ですすいで、ろ過された圧縮空気で乾燥させます。各スライドにシーリングガスケットを取り付けます。130ミリリットルのインビトロ転写と翻訳ミックスをスライドに加え、インビトロ転写と翻訳ミックスが広がり、気泡なしでアレイの全領域を覆うように、シールガスケットを穏やかにマッサージします。両方のポートに小さな丸いポート シールを適用します。タンパク質発現のために摂氏30度で90分間インキュベートし、続いて摂氏15度で30分ずつインキュベートし、クエリタンパク質を固定化します。その後、ガスケットを取り出し、スライドをそれぞれ15ミリリットルTBSTで5分間3回洗浄し、同じ溶液中で1時間ブロックします。アレイ上のタンパク質の検出のために、ミルクでTBSTを取り除き、グリッドプレートにスライドを置き、一次抗体の600マイクロリットル、マウス抗旗、希釈1〜200、および5%ミルクを加えた1x TBSTを適用します。室温で1時間インキュベートする。スライドを1x TBSTの50ミリリットルで洗浄し、揺れるシェーカーで5%ミルクを3回5分間洗います。二次抗体に対して手順を繰り返します。1時間のインキュベーションが終わったら、揺れるシェーカーの1x TBSTでスライドを3回5分間洗います。その後、スライドを超純水で素早くすすぐすまい、加圧空気を用いて乾燥させます。スライドをスキャンする準備ができました。ホスファターゼ及びDNase処理を行うために、原稿に記載されているように3%BSAを補足したTBSTで発現したスライドを洗浄し、ブロックする。次に、スライドをグリッドプレートに置き、200マイクロリットルのホスファターゼDNase溶液を塗布します。蒸発を避けるために、マイクロアレイカバースリップを上に置きます。オーブンで1時間30分間摂氏30度でインキュベートします。その後、揺れるシェーカーに1x TBSTと0.2モルの塩化ナトリウムをそれぞれ5分間3回洗浄します。薬物処理とキナーゼ反応を行うには、スライドをグリッドプレートに置き、200マイクロリットルの薬物キナーゼ溶液を塗布する。蒸発を避けるためにカバースリップを上に置きます。オーブンで摂氏30度で1時間インキュベートします。再現可能なデータの鍵は、スライド間で一貫したインキュベーション時間です。これはキナーゼ反応の間に特に重要である。各スライドの処理に必要な時間を考慮する必要があります。その後、揺れるシェーカーに1x TBSTと0.2モルの塩化ナトリウムをそれぞれ5分間3回洗浄します。TBSTで1~100に希釈した一次抗体ホスホチロシン抗体として使用したタンパク質検出を繰り返し、3%ウシ血清アルブミンを補った。1x TBSTおよび3%ウシ血清アルブミンを一次抗体でのインキュベーション後の洗浄に使用し、二次抗体によるインキュベーション後の洗浄にはTBSTを使用する。以前のように洗って乾燥させます。画像取得の場合は、マイクロアレイをスライドホルダーマガジンにロードします。マガジンをマイクロアレイスキャナーにロードします。最適化された設定ですべてのマイクロアレイをスキャンし、実験全体で画像を比較するときに自動ゲインをオフにすることを忘れないでください。画像を定量化ソフトウェアに転送し、グリッドをスポットに合わせ、マイクロアレイ上の各機能の信号強度を定量化します。統計分析を進めます。本研究では、マイクロアレイは、相補的なDNAを含むスポットの大部分が、タンパク質の検出可能なレベルを正常に表示したことを示した。NAPPAキナーゼマイクロアレイは、スライド間で良好な再現性を示し、異なる印刷バッチ間のタンパク質表示レベルの相関は0.88を超えた。NAPPAキナーゼアレイにおけるキナーゼ活性の代表的な結果は、発現後に高レベルのタンパク質リン酸化を示した。ホスファターゼ処理直後にリン酸化レベルを測定したマイクロアレイと、60分間の自己リン酸化反応の後、アレイ上に活性タンパク質キナーゼが存在することが示唆された。NAPPAキナーゼアレイでは、イマチニブはABL1およびBCR-ABL1活性の有意な減少を示したが、他のキナーゼはほとんど影響を受けなかった。脱リン酸化アレイに対して正規化し、陽性制御マイクロアレイの割合として表されるキナーゼ活性は、ABL1およびBCR-ABL1に対するイマチニブの選択的阻害を示した。イブルチニブスクリーニングで得られた典型的な結果は、ABL1非関連キナーゼのキナーゼ活性が影響を受けずであることを示した。BTKの正規標的、およびERBB4潜在的新標的は、イブルチニブの存在下で活性の低下を示した。データは、ERBB4が用量特異的な方法でイブルチニブによって阻害することができることを示唆している。タンパク質マイクロアレイスクリーニングの成功は、マイクロアレイ自体の品質に大きく依存しています。適切なデータ分析を可能にするために、いくつかの正および負の制御機能を使用する必要があります。NAPPAキナーゼアッセイはスクリーニングプラットフォームであり、そのため、得られたデータは、インビトロキナーゼアッセイ、または細胞ベースのアッセイを含む可能性のあるフォローアップアッセイで検証されるべきである。プロトコルはcDNAから始まるので、任意のキナーゼの変異や変動をマイクロアレイに簡単に組み込み、高スループットで研究することができます。アニオン交換樹脂スラリーやプレートの調製時には、樹脂粒子の吸入を防止するためにマスクを使用することが推奨される。

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学ぶNAPPAタンパク質マイクロアレイを用いたキナーゼ阻害剤のハイスループットスクリーニング法。ヒト由来の無細胞タンパク質合成系で活性キナーゼを発現し、イマチニブやイブルチニブの選択的阻害効果を複数キナーゼ間で比較評価できる新規創薬プラットフォームです。

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

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