Name: ウイルス感染のライブイメージングと定量化のためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 学ぶルシフェラーゼ蛍光デュアルレポーターインフルエンザウイルスBIRFLUを用いたウイルス感染のライブイメージングと定量化法。マウスを用いたin vivo・in vitro両方の解析が可能で、抗ウイルス薬や免疫応答の評価に応用できます。

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LM-S研究所におけるインフルエンザウイルスに関する研究は、ニューヨークインフルエンザセンター(NYICE)(NIH 272201400005C)によって部分的に資金提供され、NIAIDインフルエンザ研究・サーベイランスセンター(CEIRS)契約No.HHSN27201400005C (NYICE) と国防総省 (DoD) ピアレビュー医療研究プログラム (PRMRP) 助成金 W81XWH-18-1-0460.

著者は何も開示していない。

研究者は、ウイルス複製と病因の現在の理解を理解し、拡大するための重要な分子ツールとして組換えレポーター発現ウイルスに依存しています26,27,28,29歳,30歳,31歳,32歳,33歳,34歳,35歳,36歳,37歳,38歳,39歳,40歳,41歳,54.最も一般的に好まれるレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼと蛍光タンパク質であり、主に同定の技術進歩、改良された変異体の開発、およびイメージング技術による検出43,44歳,45歳,46歳,47歳,48.組換えレポーターウイルスは、ウイルス学的アッセイを加速し、インビトロおよびインビボでウイルスのダイナミクスを研究し、現在承認されているまたは新しいワクチンおよび治療アプローチの有効性をテストするためにしばしば使用される26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54.残念ながら、IAVの場合、過去の研究は単一のレポーター遺伝子の発現に限定され、26、27、28、29を行うことができる研究のタイプを妨げる,30歳,31歳,32歳,33歳,34歳,35歳,36歳,37歳,38歳,39歳,40歳,41歳,54.この制限を回避するために、Nlucルシフェラーゼと金星蛍光タンパク質(BIRFLU)を発現する複製有能なバイレポーターIAVを生成しました。
本報告では、BIRFLUのインビトロ特性と、IAV感染のマウスモデルを用いて生体内のウイルス感染を追跡するためにBIRFLUを用いた実験的アプローチについて述べた。BIRFLU Nlucと金星発現はウイルスのチターと相関した。さらに、BIRFLUは安定したままで、感染したマウスの肺から回収された後も両方のレポーター遺伝子を発現し続けた。このアプローチは、IAV感染症の治療のための新しい治療選択肢の同定と開発を含む、培養細胞および動物モデルにおけるIAVを研究する絶好の機会を研究者に提供する。
BIRFLUはPR8のバックボーンを用いて生成されたが、異なるタイプ、サブタイプまたはウイルス株のバックボーンを使用して他の組換えIAVを同じ実験的アプローチを使用して生成することができる。同様に、本報告では、IAVのマウスモデルにおけるBIRFLUの使用に関する実験手順について説明した。しかし、BIRFLUは他の動物モデルにおけるIAV感染を評価する貴重な技術である可能性がある。

インフルエンザA型ウイルス(IAV)は、オルソミキソビリダ科1、2、3の封入された一本鎖陰性陰性セグメントRNAウイルスである。世界保健機関(WHO)は、年間3~500万人のインフルエンザ患者と、世界で25万人以上のインフルエンザによる死亡者数を推定しています 4,5,6.特にインフルエンザに対して脆弱なグループには、高齢者、免疫不全者、および小児7、8、9、10、11が含まれる。ワクチンは利用可能であり、ウイルス感染に対する最も一般的かつ効果的な介入を表すが、IAVは急速に進化し、既存の免疫3、12、13を脱出することができる。14歳,15.2009年のパンデミックH1N1株の再出現と病原性IAVの出現は、世界中の人間の公衆衛生に対する絶え間ない脅威を繰り返し述べています 4,16.
流行やパンデミックの間に、新たに単離されたウイルスの病原性と透過性を迅速に決定することが重要です。ウイルスを検出するための現在利用可能な技術は時間がかかり、時にはこれらの分析の完了を遅らせることができる面倒なアプローチの使用を必要とします17,18,19,20.さらに、現在のウイルスアッセイはスケールアップが困難であり、発生時に必要になる可能性があります。最後に、マウス、モルモット、フェレットなどの感染の検証済み動物モデルの使用は日常的に使用され、インフルエンザ感染、免疫応答、および新しいワクチンおよび/または抗ウイルス薬の有効性を研究する上で不可欠です。しかし、これらのモデルは、リアルタイムでウイルスのダイナミクスを観察することができないため、制限されています。これは、ウイルス感染の静的イメージングに研究を制限します21,22,23,24,25.これらのアッセイで使用される動物はまた、ウイルス負荷を決定するために安楽死させ、したがって、これらの研究を完了するために必要な動物の数を増加させる26。これらすべての制限を回避するために、多くの研究者は、組換え複製能力のあるレポーター発現IAVの使用に依存しており、ウイルス学的アッセイを加速し、リアルタイムで生体内のウイルス負荷と普及を検出することができます26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41.重要なことに、これらのレポーター発現IAVは、細胞培養および感染33、42の動物モデルにおいて野生型(WT)IAVと同様に複製することができる。
蛍光タンパク質と生物発光タンパク質は、その感度、安定性、使いやすさのために研究者が一般的に使用する2つのレポーターシステムです。また、蛍光および生物発光タンパク質検出技術43、44、45、46、47、48に多大な支持と進歩があります。.蛍光タンパク質とルシフェラーゼは、それらが発光することを可能にする異なる特性を有し、特に励起状態が生成される方法と発光が検出される方法が異なり、43、44、45、 46、47、48。蛍光タンパク質は、まずエネルギーを吸収することによって励起され、その後、分子が低エネルギー状態に減少するにつれて、異なる波長で光として放出される43。一方、生物発光は、光45を生成するために基板、酸素、および時にはATPを含む化学的興奮反応に由来する。これら2種類のレポータータンパク質の特性が異なるため、目的の研究に応じて他方よりも有利な可能性があります。蛍光タンパク質は細胞の局在化28、41を観察するために広く使用されているが、生体内シグナルは強度が不十分であり、生組織49における自己蛍光によってしばしば隠されている。したがって、研究者は、生体中のウイルスダイナミクスを評価するためにルシフェラーゼに依存しているが、蛍光タンパク質は、ex vivo研究50、51、52、53に好ましい。蛍光タンパク質とは異なり、ルシフェラーゼは生体内研究に適しており、非侵襲的アプローチ26、27、28、29、30でより適用可能です。,31歳,32歳,33歳,34歳,35歳,36歳,37歳,38歳,39歳,40歳,41歳,54.最終的には、研究の種類に基づいて、研究者は、蛍光またはルシフェラーゼレポータータンパク質を読み出しとして使用するか、機能性と感度のトレードオフに彼らの研究を対象とし、厳しく選択する必要があります。組換えレポーターウイルスの有用性を制限します。また、蛍光またはルシフェラーゼ系を用いた異なるレポーター遺伝子の発現とウイルス複製または普及との相関関係に関する懸念があり、得られたデータの解釈を危険にさらす可能性がある。レポーター表現IAV。
我々は、同じウイルスゲノム55内の蛍光およびルシフェラーゼタンパク質の両方にコードする組換え複製有能なバイレポーターIAV(BIRFLU)を生成することによって、この制限を克服した(図1)。ここでは、小さくて明るい生物発光タンパク質であるNanoLucルシフェラーゼ(Nluc)は、インフルエンザA/プエルトリコ/08/1934 H1N1(PR8)24、33、インフルエンザA/プエルトリコのウイルスHAセグメントにヘマグルチニン(HA)配列の上流に挿入された。 40、55、56、57.加えて、頻繁に使用される単光蛍光タンパク質である金星は、非構造(NS)ウイルスセグメント32、33、36、41、55に挿入した。BIRFLUは蛍光およびルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方にコードするので、レポータータンパク質シグナルのいずれかを読み出しとして使用して、インビトロまたはインビボ55におけるウイルス複製および普及を決定することができる。BIRFLUの生成とインビトロまたはインビボ特性に関する追加情報は、最近の出版物55で見つけることができます。BIRFLUは、新規蛍光および生物発光系微小中和アッセイ55を介して抗ウイルス薬または中和抗体の有効性を試験するために使用することができる。さらに、BIRFLUは、感染55のマウスモデルにおけるウイルスダイナミクスを評価するためにも使用することができる。本原稿では、VIVFLU55をインビトロで特徴付ける手順と、生体内またはヴィーナスex vivoにおけるNlucの検出のための生体内発光イメージングシステムを用いたマウスにおけるBIRFLU感染の研究方法について述べた。
分子生物学、動物研究、イメージング技術の最先端の技術の組み合わせは、ウイルス宿主相互作用、ウイルス感染のダイナミクスの研究を含むIAV研究のためにBIRFLUを使用するユニークな機会をもたらします。IAV感染症の治療治療または他の病原体感染症の治療のためのワクチンベクターとしてのIAVの潜在的な使用のための新しいワクチンアプローチの開発。

<table><tbody><tr><td>12ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td>このソフトウェアは3.1.10で使用されています。および4.4.7</td></tr><tr><td>Bovin Albumin solution (BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>4 °Cで保存。C</td></tr><tr><td>ボビン 血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>細胞培養皿100mm</td><td>グライナーバイオワン</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MPイメージングシステム</td><td>BioRad</td><td></td><td>この機器は、室温で4.4.7</td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C581-100</td><td>ストア</td></tr>で使用されます ダウン<tr><td>スティッシュグラインダートーマス</td><td>サイエンティフィ</td>ック<td>7722-7</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ '修正されたイーグル」s medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>4 °で保管;C</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>-20 °C で保管。C</td></tr><tr><td>5 〜 7週齢の女性 BALB/c マウス</td><td>国立がん研究所 (NCI)</td><td>555</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>1001936040</td><td>室温での保存</td></tr><tr><td>IVIS スペクトル</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td>この機器は、生体内イメージング (4.2 および 4.3)</td></tr> <tr><td>IX81 電動倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>オリンパス IX81</td><td></td></tr><tr><td>生きた画像 4.7.2 に使用されますソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>この機器は、生体内イメージング(4.2および4.3)</td></tr><tr><td>Lumicount</td><td>Packard</td><td></td><td>この機器は、ルシフェラーゼ活性(3.2.6)</td></tr><tr><td>Madin-Darby犬腎臓(MDCK)上皮細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗体抗NPインフルエンザAウイルスHB-65</td><td>ATCC</td><td>H16-L10-4R5</td><td>-20 >C</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>この試薬は、Nluc活性の測定に使用されます。-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>中性緩衝ホルマリン 10%</td><td>EMD</td><td>65346-85</td><td>RT</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>に保存 Thermo Fisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (PS) 100x</td><td>Corning</td><td>30-00-CI</td><td>-20 °Cで保存。C</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>-20 °C で保管。C</td></tr><tr><td>Retiga 20000R Fast1394 カメラ</td><td>Qimaging</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td>スキャナー</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テキサス レッド標識抗マウス -</td>ウサギ二次抗体 <td>ジャクソン</td><td>715-075-150</td><td>-20 &deg;C</td></tr><tr><td>トシルスルホニルフェニルラニルクロロメチルケトン (TPCK) 処理トリプシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>-20 °CC</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>J.T.ベイカー</td><td>X198-07</td><td>RT</td></tr><tr><td>Vmaxで保管 キネティックプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ウイルス感染のライブイメージングと定量化のためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

インフルエンザA型ウイルス(IAV)は、健康と経済的に重大な影響を伴うヒト呼吸器疾患を引き起こす。他のウイルスと同様に、IAVを研究するには、感染細胞および/または感染の動物モデルにおけるウイルスの存在を検出するために、面倒な二次的アプローチを使用する必要があります。この制限は、容易に追跡可能な蛍光または生物発光(ルシフェラーゼ)レポータータンパク質を発現する組換えIAVの生成によって最近回避されている。しかし、研究者は、外来配列を含むIAVゲノムの制限容量のために蛍光またはルシフェラーゼレポーター遺伝子を選択することを余儀なくされています。この制限を克服するために、我々は、インビトロおよびインビボでのIAV感染を容易に追跡するために、蛍光およびルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方を安定的に発現する組換え複製有能なバイレポーターIAV(BIRFLU)を生成した。この目的のために、インフルエンザA/プエルトリコ/8/34 H1N1(PR8)のウイルス非構造(NS)およびヘマグルチニン(HA)ウイルスセグメントを、蛍光金星および生物発光ナノルシフェラーゼタンパク質をそれぞれコードするように修飾した。ここでは、IAV感染のマウスモデルにおけるBIRFLUの使用と、インビボイメージングシステムを用いて両レポーター遺伝子の検出について説明する。特に、レポーターとウイルス複製の両方の表現との間に良好な相関関係が見られた。分子生物学、動物研究、イメージング技術の最先端技術の組み合わせは、ウイルス宿主の相互作用とダイナミクスの研究を含むインフルエンザ研究のためにこのツールを使用するユニークな機会を研究者に提供します。ウイルス感染。重要なことは、異なるウイルスセグメントから2つの外来遺伝子を発現させるためにウイルスゲノムを遺伝的に改変する可能性は、(i)新規IAVワクチンの開発、(ii)組換えIAVの生成にこのアプローチを使用する機会を開きます。他のヒト病原体感染症の治療のためのワクチンベクターとして使用することができる。

インビトロでのBIRFLUの生成と特性化(図1、図2)
2つの異なるレポーター遺伝子(BIRFLU)を発現する組換え複製可能なIAVは、最先端の分子生物学とプラスミドベースの逆遺伝学技術を用いて構築された(図1)。ここでは、その小さなサイズ、ATP独立性、より大きな強度、および最適化された基板48、60を含む他のルシフェラーゼに対するいくつかの利点のためにNlucを使用することを選択しました。Nlucは、IAV PR8のHAセグメントにクローニングされ、続いてHAの開いた読み取りフレーム(ORF)の前にブタテショウイルス(PTV)2A切断部位(2A)が続いた(図1)。HAのORFは、元のパッキング信号を除去し、可能な組み換えを避けるためにサイレント変異を含み込んだ。完全なHA包装信号をNlucの前に加え、同じウイルスRNAセグメントからのvirionおよびNlucおよびHA発現への改変HAセグメントの適切な組み込みを可能にした(図1)。さらに、蛍光タンパク質金星は、単一の転写物32、36、41、54から2つのウイルスタンパク質NS1およびNEPをコードする修飾IAV PR8 NSセグメントにクローニングされた。 57.そのために、金星はNS1のC端子に融合され、NEP ORF全体がNS1-ヴィーナスとNEP配列の間に置かれたPTV 2A切断部位の下流にクローン化された(図1)。最終的に、これら2つの改変HAおよびNSウイルスプラスミド構造体は、BIRFLU(図1)を生成するためにIAV PR8逆遺伝学プラスミドの残りの部分と組み合わせて使用された。BIRFLUのインビトロおよびインビボ特性化は、前述の55.
図2では、蛍光および間接免疫蛍光アプローチを用いて金星、Nluc、およびNP発現レベルを決定することにより、ビトロBIRFLUで特徴付けた(図2A,B)。MDCK細胞のコンフルエント単層は、WTまたはBIRFLU PR8ウイルスで模擬感染または感染(MOI 0.1)を有し、感染後18時間で、金星発現を蛍光顕微鏡を用いて直接評価した(図2A,B)。Nluc(図2A)およびNP(図2B)発現は、各タンパク質に特異的な抗体を用いて間接免疫蛍光により可視化した。予想通り、金星およびNluc発現はBIRFLUに感染した細胞でのみ検出され、WT PR8ウイルスに感染した細胞では検出されなかった。さらに、間接免疫蛍光顕微鏡は、WTおよびBIRFLU PR8感染細胞の両方におけるNP発現を明らかにした。模擬感染細胞では、金星、Nluc、NPの発現は検出されなかった(図A,B)。
インビトロでNluc発現レベルを評価するために、MDCK細胞をWTまたはBIRFLU PR8ウイルスおよびNluc活性を組織培養上清で感染させた(MOI 0.001)、感染後24、48、72および96hで評価した(図2C)。BIRFLUに感染したMDCK細胞の組織培養上清においてNluc活性のみが検出された(図2C)。組織培養上清におけるNluc活性は、感染後96時間でより高い発現レベルを有する24時間後感染の早い時期に検出された、おそらくウイルス感染中に誘発された細胞障害効果(CPE)が保持されたNlucタンパク質を放出するためである。セルに。培養細胞におけるBIRFLUの適合性を評価するために、WTおよびBIRFLU PR8ウイルスの増殖運動学も評価し(図2D)、組織培養上清における感染性ウイルスの存在を免疫焦点アッセイ(図2D)で決定した(図2D)).特に、BIRFLU複製動態はWT PR8ウイルスの複製に匹敵するが、BIRFLU複製はわずかに遅れ、WT PR8と同じウイルス性チターに到達しなかった。しかし、BIRFLUは5 x 107 PFU/mL(図2D)の有数に達することができ、ウイルスゲノム中の2つのレポーター遺伝子の発現がMDCK細胞におけるBIRFLU複製を有意に妨げなまないことを示した。
マウスにおけるBIRFLU感染の追跡(図3および図4)
図3は、IAV感染のマウスモデルにおけるBIRFLUダイナミクスの評価のための概略的なフローチャートである。5~7週齢の雌BALB/Cマウスは、1x PBSで模擬感染したか、またはBIRFLUの1 x 106 PFUに感染した。感染後3日目に、マウスをイゾフランで麻酔し、次いでNluc基板をレトロ軌道に注入した。全てのマウスを直ちにIVIS器具に入れ、NlucシグナルをIVISを用いて生体内で評価した。次に、マウスを安楽死させ、肺を採取した。次いで、取り出した肺をインビボイメージャーを用いてexvivoを分析し、金星発現を介して蛍光強度を決定した。最後に、マウスの肺を均質化し、ウイルス力と安定性をプラークアッセイによって決定した。プラークは、金星の直接蛍光によって、Nlucに特異的な抗体を用いた免疫染色および結晶紫色染色によって評価された。
前述の複製有能なレポーター発現IAVは、ウイルス感染および複製の代理として、蛍光または生物発光タンパク質のいずれかの単一のレポーター遺伝子を発現する。しかしながら、BIRFLUは、ウイルス感染時に両方のタイプのレポーター遺伝子を発現することができる。BIRFLU感染後の生物発光(インビボイメージング)と蛍光(エクスビボイメージング)の相関関係を評価するために、5~7週齢の雌BALB/cマウスを1x PBSで模擬感染させたり、BIRFLU(106 PFU)を眼内に接種した。.Nluc活性(図4A)は、生体内イメージング器具を用いて感染後3日間にレトロ軌道に注入したNluc基板の投与により評価した。以前の研究では、PR8を含むIAV複製が感染後24日目から4日目の間にピークを迎えることが示されたため、3日目に生物発光を評価することを選択しました。生物発光をモニターし(図4A、上)、平均総フラックス(フラックス(log10 p/s))を算出するために使用した(図4A、下)。予測通り、BIRFLUに接種したマウスは高い生物発光活性を示したが、模擬感染マウスではシグナルは検出されなかった。その後、感染したマウスの肺を採取し、ex vivoイメージングを用いて金星発現を評価した(図4B、上)。また、蛍光平均放射効率を算出した(図4B、底部)。駆除されたマウス肺も同質化し、生体内におけるBIRFLUのウイルス性電質および遺伝的安定性を決定した(図4C,D)。BIRFLUの遺伝的安定性は、マウスの肺および蛍光顕微鏡(Venus,top)、免疫染色(Nluc、中央)および結晶紫染色(底)から単離されたウイルスを用いてプラークアッセイを用いて分析した。マウス肺から回収されたBIRFLUは、プラークを形成し、両方のレポーター遺伝子を安定的に発現することができた(図4C)。特に、バイオルミネッセンスと蛍光シグナルとウイルス複製との良好な相関関係を観察した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> 図1:IAV PR8 WTおよびBIRFLUビリオン構造およびゲノムセグメントの概略表現。IAVは、ヘマグルチニン(HA;黒)およびノイラミニダーゼ(NA;青色)の2つの主要なウイルス糖タンパク質を含む脂質二層層に囲まれている。IAV には、8 つの一本鎖、負感、RNA セグメント(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、および NS)が含まれています。各ウイルスセグメントには、3'および5'の端(ブラックボックス)に非符号化領域(NCR)が含まれています。また、ウイルス(v)RNAの3'および5'末端には、vRNAを新生ビリオン(白い箱)に効率的に封入するパッケージング信号が含まれています。IAV PR8 HA および NS ウイルスセグメントおよび製品は黒で示されています。Nluc、金星、およびPTV 2Aの配列は、それぞれ赤、緑、縞模様のボックスで示されています。BIRFLUでは、Nlucと金星をそれぞれ表す改変されたHAセグメントとNSセグメントの概略図も示されている。この図は、ノガレスら55から適応されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> 図2:BIRFLUのインビトロキャラクタライゼーション。(A, B)直接蛍光と免疫蛍光によるタンパク質発現の解析MDCK細胞は、PR8 WTまたはBIRFLUウイルスを用いた模擬感染または感染(MOI 0.1)であった。感染細胞を18時間後に固定し、直接蛍光顕微鏡で金星発現を直接可視化し、特定の抗体と間接免疫蛍光を用いてNluc(A)およびウイルスNP(B)発現を可視化した。核はDAPIで染色した。代表的な画像(20倍倍)を示す。スケールバー = 100 μm。(C, D)PR8 WTおよびBIRFLUの成長運動学。WTおよびBIRFLUPR8ウイルスに感染したMDCK細胞(MOI 0.001)からの組織培養上清におけるNluc活性(C)およびウイルスチター(D)は、感染後の示された時間で評価した。データは三点三度の平均±SDを表す。ウイルス力体は、免疫焦点アッセイ(FFU/mL)によって決定した。点線は検出限界(200 FFU/ml)を示します。この図は、ノガレスら55から適応されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> 図3:マウスにおけるBIRFLUの研究のための概略表現。NlucおよびVenusレポーター遺伝子の発現は、生体内またはex vivoイメージングを用いてBIRFLUの1 x 106 PFUに感染したマウスで評価した。簡単に言えば、1日目に、5〜7週齢の雌BALB/cマウスを模擬感染(1x PBS)または1x 106 PFUで接種した。感染後3日目に、マウスをイゾフランを用いて軽度に麻酔し、Nluc基板をレトロ軌道に注入した。Nlucシグナルは、生体内イメージングを用いて直接評価した。イメージング直後、マウスを安楽死させ、全開き肺における金星の発現をex vivoイメージングを用いて分析した。回収したマウス肺を均質化し、プラークアッセイによるウイルス複製および安定性を評価した。矢印は、蛍光(金星)、免疫染色(Nluc)および結晶紫色染色との相関を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> 図4:生体内生物発光および蛍光発現中。雌の5~7週齢のBALB/cマウスは、模擬感染(1x PBS)またはBIRFLUの1 x 106 PFUを眼内接種した。感染後3日目に、マウス全体におけるNluc活性(A)が決定された。輝度スケールを示す単一のマウスの代表的な画像(p/秒/cm2/sr)。生物発光輝度値を定量し、平均総フラックスを示した(Flux(Log10 p/s)。Nlucイメージング後、肺は、外生画像(B)のために採取した。肺全体からの代表的な写真が示されている。金星発現を定量するために、対象領域(ROI)の平均値を模擬感染マウスから肺自動蛍光に正規化し、折り畳み変化を算出した。生体内におけるBIRFLUの遺伝的安定性を解析するために、マウス肺から回収したウイルスを、蛍光顕微鏡(Venus,上)、免疫染色(Nluc、中央)および結晶紫色染色(下)を用いてプラークアッセイにより分析した( C)。1匹のマウスの代表的な画像が表示されます。ウイルス複製を評価するために、全肺はイメージング後に均質化され、MDCK細胞に感染し、プラークアッセイ(PFU/mL)(D)によってウイルス力中電圧を決定するために使用された。矢印は、蛍光(金星)、免疫染色(Nluc)、および結晶紫色染色との相関を示す。バーは、肺ウイルス量高の平均±SDを表す。この図は、Logales et al.55から適応されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>組織培養培養培養培養剤とソリューション</td>
			<td>組成</td>
			<td>ストレージ</td>
			<td>使用</td>
		</tr>
<tr>
<td>
組織培養培地:ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)、10%胎児ウシ血清(FBS)、1%ペニシリン連鎖筋菌-L-グルタミン(PSG)(DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

インフルエンザA型ウイルス(IAV)は、毎年の流行や時折のパンデミックを引き起こす伝染性呼吸器病原体です。ここでは、新規組換えルシフェラーゼおよび蛍光発現バイレポーターIAV(BIRFLU)を用いて生体内のウイルス感染を追跡するプロトコルについて説明する。このアプローチは、研究者に生体内でIAVを研究するための優れたツールを提供します。

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

研究者たちは以前、蛍光性または生物発光タンパク質レポーターのいずれかを発現する組換えインフルエンザウイルスを生成しました。インフルエンザウイルスにおけるレポーター遺伝子の単一発現の一部は、実験における使用を著しく制限しています。我々のプロトコルは、蛍光感と生物発光レポーター遺伝子の両方を発現するバイレポーターインフルエンザウイルスの使用を記述し、したがって、その限界を克服する。この技術の主な利点は、インビトロおよびインビボ研究のための単一の組換えインフルエンザウイルスの使用である。この技術を行う場合、基質が速やかに代謝されるため、ルシファーゼ基質の迅速な注入およびマウスの取り扱いの適切な計画が重要である。また、生物発光シグナルの検出を改善するためにマウスのシェービングが推奨される。マウスに感染するには、まず1X PBSでBIRFLUを調製する。接種まで氷の上にウイルスを維持します。つま先ピンチ反射がないかどうかを確認して、マウスが麻酔されていることを確認し、準備されたBIRFLU希釈で鼻腔内に接種します。すべてのマウスがケージに戻す前に適切に呼吸していることを確認してください。イメージングソフトウェアを開いて[初期化]を押し、イメージングに使用するパラメータを設定します。BIRFLUに感染したマウスをモニタリングするには、胸を剃って生物発光シグナルの検出を改善する。マウスを麻酔したら、22ゲージ針を用い、100マイクロリットルのNlucルシメラーゼ基質をレトロに投与し、PBSで1~10に希釈した。注射の直後に、胸を上に向けて隔離チャンバーに動物を置きます。次に、撮像器に隔離チャンバーを置き、ドアを閉め、画像を取得します。イメージングの後、マウスをケージに戻し、完全に回復するまで監視します。イメージングソフトウェアROIツールを使用して、対象領域を指定して測定をクリックすることで、取得した生物発光データを分析します。マウス肺のex vivoイメージングを行うために、原稿の方向に従って肺を収集し、画像取得ソフトウェアを起動し、イメージング用のパラメータを設定する。機械が初期化されたら、肺を黒い背景トレイに入れ、組織が互いに分離されていることを確認します。トレイをイメージャーに取り込み、ドアを閉じて画像を取得します。イメージング後、すぐに組織を取り除き、サンプルが同じ日に処理される場合は摂氏4度で氷の上に保管してください。後で処理する場合は、ドライアイスのチューブに素早く凍結し、摂氏80度で保管してください。画像を処理するには、ROI ツールを選択し、各肺の周囲に関心のある領域を描画し、測定をクリックします。BIRFLUは、感染細胞におけるヴィーナス、ヌルク、NP発現レベルを決定することによって、インビトロで特徴付けられています。金星とヌルクの発現はBIRFLUに感染した細胞でのみ検出され、NPは野生型PR8およびBIRFLU感染細胞の両方で発現する。模擬感染細胞では発現は認められない。さらに、Nluc活性は、感染後24、48、72、および96時間の組織培養上清において測定されている。感染後24時間で早くも検出され、発現レベルは96時間で増加する。また、BIRFLUの複製動態が野生型PR8ウイルスに匹敵することを実証することもできる。BIRFLUは蛍光および生物発光レポーター遺伝子の両方を発現する能力を有し、これら2つの間の相関は、マウス肺のin vivoおよびex vivoイメージングを用いて評価することができる。BIR蛍光に感染したマウスの肺は、生体内および蛍光ex vivoにおいて高い生物発光を示した。ウイルス力素および生体内のBIRFLUの遺伝的安定性も決定されている。マウス肺からのウイルスに関するプラークアッセイは、ウイルスがプラークを形成し、両方のレポーター遺伝子を発現できることを示した。BIRFLUは、インフルエンザに対する抗ウイルスおよび中和抗体の有効性を評価するためにも使用できる。これらのアッセイからの出力はすべて互いに相関しており、迅速かつ簡単に行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

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ウイルス感染を追跡するためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

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ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

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レポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量

学ぶルシフェラーゼ蛍光デュアルレポーターインフルエンザウイルスBIRFLUを用いたウイルス感染のライブイメージングと定量化法。マウスを用いたin vivo・in vitro両方の解析が可能で、抗ウイルス薬や免疫応答の評価に応用できます。

ウイルス感染のライブイメージングと定量化のためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

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