アンカー多重ポリメラーゼ連鎖反応を用いた腫瘍性遺伝子融合検出、次世代シーケンシング

このプロトコルは、患者の腫瘍サンプルに関する重要な有益な遺伝子融合の検出に使用されます。数十個の遺伝子の融合状態を、1回のアッセイで同時に評価します。この技術の利点は、製剤固定によって処理された腫瘍サンプルから融合パートナーの同一性に関係なく遺伝子融合を同定できることである。

臨床腫瘍サンプルにおける特定の遺伝子融合の検出は、多くの癌タイプにおける診断、予後および治療選択を直接知らせる。解析アルゴリズムによって呼び出される多くの融合がアーティファクトであることを理解することが重要です。データを分析する際の最も困難なタスクは、アーティファクトと実際のフュージョン呼び出しを区別することです。

まず、全核酸を希釈して、所望のRNA濃度を達成します。各サンプルに対して、希釈液の20マイクロリットルを、冷やされたアルミニウムブロック内のランダムプライミング試薬ストリップチューブに移し、6〜8回上下にピペットで混合します。サンプルを簡単にスピンダウンし、ボリューム全体を96ウェルPCRプレートに移し、プレートシーラーフィルムでシールします。

プレートをサーモサイクラーに挿入し、圧縮パッドで覆い、蓋を閉めます。摂氏65度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、ランダムプライミング製品の全容を第1ストランド試薬ストリップチューブに移す。

上下にピペットを入れ、短時間スピンダウンして混ぜます。96ウェルPCRプレートに全ボリュームを移し、RTフィルムでシールします。プレートをサーモサイクラーに挿入し、原稿の指示に従って反応を実行します。

第2鎖cDNA合成を行い、修復し、原稿の方向に従って第1のライゲーションステップを行い、第2のライゲーションステップに進む。分子バーコードまたはMBCアダプタストリップチューブに番号を付けるには、チューブをヒンジを背部に水平に配置し、永久マーカーを使用します。第1のライゲーションステップからビーズ精製プレートを取り、各サンプルの40マイクロリットルをMBCアダプターストリップチューブに移し、ビーズペレットを乱さないよう注意してください。

ピペットで試薬を混合し、チューブをスピンダウンし、リゲーションステップ2試薬ストリップチューブに全容を移します。サンプルを混ぜて回転させ、サーモサイクラーブロックに入れます。加熱した蓋を外し、サーモサイクラーを摂氏22度で5分間走らせ、続いて摂氏4度のホールドを実行します。

次に、それらをボルテックスし、PCRストリップチューブの新しいセットに50マイクロリットルを追加することによって、ライゲーションクリーンアップビーズを準備します。磁石を1分間インキュベートし、上清を捨てます。磁石からストリップチューブを取り出し、上下にピペット処理して50マイクロリットルのライゲーションクリーンアップバッファでビーズを再懸濁します。

第2のライゲーションステップから、サンプル全体をライゲーションクリーンアップビードストリップに移します。混合し、10分間室温でそれらを残すためにサンプルを渦。インキュベーションの途中でサンプルを一度渦を出す。

その後、サンプルを渦を出し、それらを回転させ、磁石で1分間インキュベートします。上清を捨て、200マイクロリットルの新鮮なライゲーションクリーンアップバッファーを追加します。渦は再中断し、スピンダウンし、磁石の上に1分間置きます。

2回の洗浄後、緩衝液の代わりに超純水を用いて3回目の洗浄を行う。ビーズを20マイクロリットルの5ミリメートルの水酸化ナトリウムに再懸濁し、サンプルを96ウェルPCRプレートに移します。プレートを圧縮パッド付きのサーモサイクラーに入れ、摂氏75度で10分間実行し、続いて摂氏4度のホールドを実行します。

サンプルが摂氏4度まで冷却されたら、プレートを磁石の上に3分以上置き、最初のPCRに進みます。最初のPCR試薬ストリップの各ウェルにGSP1プライマーを2マイクロリットル加えてPCR反応を準備します。第2のライゲーション・クリーンアップ製品の18マイクロリットルを第1のPCR試薬ストリップチューブに移し、上下にピペットを入れ、混合します。

サンプルをスピンダウンし、96ウェルPCRプレートに移します。サーモサイクラーに入れ、原稿の指示に従ってPCRを実行します。20マイクロリットルのPCR製品を、1ウェルあたり24マイクロリットルの精製ビーズで充填したU-底板に添加することにより、ビーズ精製を進めます。

ピペットを上下に混ぜ、プレートを室温で5分間放置し、マグネットのプレートを2分間インキュベートします。ビーズからスーパーナントを捨て、200マイクロリットルの70%エタノールで2回洗浄します。最後の洗浄後、エタノールをすべて取り除き、サンプルを2分間乾燥させます。

磁石からプレートを取り出し、10ミリトリスHClとpH 8.0の24マイクロリットルでビーズを再懸濁します。磁石を3分間インキュベートし、プレートを磁石に2分間戻します。2番目のPCR産物の1~5個の希釈液を10ミリメートルTris-HClで調製して、ライブラリ定量を開始します。

10ミリメートルのトリス-HClで1:199、1:199、および20:80の連続希釈でこれに従ってください。光学96ウェルプレートの各ウェルに6マイクロリットルのマスターミックスを加え、その後に適切な希釈または標準の4マイクロリットルを加えることによって、キーPCRを設定します。プレートを回転させ、qPCR装置にロードします。

原稿の指示に従ってqPCRを行います。ライブラリの定量が完了したら、すべてのライブラリを10ミリメートルTris-HClで2ナノモルに希釈します。1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに各正規化されたライブラリの10マイクロリットルを組み合わせることによって、ライブラリプールを作ります。

次に、変性アンプリコンライブラリ、またはDALプールを、10マイクロリットルのライブラリプールと10マイクロリットルの通常の水酸化ナトリウムを組み合わせ、室温で5分間混合物をインキュベートして調製する。インキュベーション後、pH 7.0で200ミリトリス-HClの10マイクロリットルを加えて、HT1ハイブリダイゼーションバッファーの970マイクロリットルを加えます。300マイクロリットルのHT1、20ピコモルPhiXの25マイクロリットル、DALプール675マイクロリットルを組み合わせて、最終的なロードチューブを作ります。

シーケンサー試薬カートリッジのサンプルウェルにロードチューブの全容を加え、シーケンサーにカートリッジを積み込みます。陽性対照サンプルを選択して開始し、期待される融合と発がんアイソフォームがすべて検出され、強力な証拠タブにリストされていることを確認します。各サンプルについて、GSP2 コントロール値ごとの平均一意の開始サイトを調べ、各潜在的な融合のサポートリードを視覚化するリンクをクリックして、個々の融合をサポートする個々の融合の積み重ねの Web ベースの JBrowse ビューに移動します。

読み取りはほとんど不一致が含まれ、読み取りの 30 塩基以上が融合パートナーと一致していること、および遺伝子とプライマー結合部位の間のブレークポイントに隣接する配列が挿入または欠損を含まないことを確認します。すべての呼び出しフュージョンは、一般的にミスアライメントがなく、読み取りのかなりの部分がフュージョンパートナーに合致するようにすることが重要です。このプロトコルは、肺腺癌サンプルにおける遺伝子融合状態を調べるのに用いられてきた。

サマリーは強力なエビデンスの融合を示し、統計の読み取りページにはサンプルのメトリックが表示されます。このサンプルは良好なRNA品質を示すため、融合が見つからなかった場合に否定的な結果が報告されます。正当な融合呼び出しには、サポートする読み取り数が多く、融合をサポートするプライマーからの読み取りの割合が高く、開始サイトの数が多い。

読み取りの視覚化は、融合パートナーの大きな領域に良好な位置合わせを示す。逆に、アーティフィファクトフュージョンコールは、パートナーにマッピングする際に、サポート指標が低く、高いエラー率を持っています。分析アルゴリズムによって行われた実際の融合呼び出しは一般的です。

すべての呼び出しを手動で検査して、患者サンプル内の実際の遺伝子融合を表すことを確認することが重要です。