Name: MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 学ぶ ゲル精製とオープンソースバイオインフォマティクスツールを用いたマイクロRNAの分離・シーケンス解析法。疾患メカニズムと遺伝子治療の定量化に応用可能な再現性の高いプロトコルです。

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アンドリュー・ファイアとマーク・ケイの研究室のメンバーに指導と提案を感謝します。

<ol><li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metazoan+MicroRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li>
<li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li>
<li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li>
<li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li>
<li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li>
<li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321(2018).</li>
<li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+Registry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li>
<li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li>
<li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li>
<li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li>
<li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118(2018).</li>
<li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331(2018).</li>
<li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li>
<li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing%3A+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352(2015).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141(2011).</li>
<li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969(2011).</li>
<li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li>
<li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li>
<li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants%3A+improved+tools+for+RNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72(2011).</li>
<li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs%3A+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li>
<li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

20年以上前の13年以上前にマイクロRNAを同定したにもかかわらず、マイクロRNAシーケンシングのプロセスは依然として骨の折れるものであり、特殊な装置を必要とし、研究室が社内プロトコル14を日常的に採用するのを妨げている。他の技術は、マイクロRNAマイクロアレイや多重発現パネルのようなマイクロRNAを同時に評価することができます。ただし、これらのアプローチは、プローブ セットに存在するマイクロRNAのみを定量化する場合に限られています。このため、彼らは、新しいマイクロRNAの同定のような小さなRNAシーケンシングの重要な特徴を見逃し、マイクロRNAアイソフォーム - 重要な生物学的機能を持つことができるヌクレオシド変化6、7、15.
新しい実験を開始する場合、テクニカル サポートと使いやすさを提供するた...

1993年1月に初めて発見され、現在では2000マイクロRNA近くがヒトゲノム2に存在すると推定されている。マイクロRNAは、典型的には21〜24ヌクレオチド長い小さな非コードRNAである。それらは遺伝子発現の転写後調節因子であり、多くの場合、タンパク質発現を抑え、mRNAを分解する標的遺伝子の3非翻訳領域(3-UTR)の相補部位に結合する。マイクロRNAの定量化は、遺伝子発現に関する貴重な洞察を与えることができ、いくつかのプロトコルは、この目的のために開発されています 3.
当社は、小型RNAシーケンシングおよびオープンソースバイオインフォマティクスツールを使用して正規化された読み取りを分析するための、定義された、再現性のある、長年にわたるプロトコルを開発しました。重要なことに、我々のプロトコルは、内因性マイクロRNAと外因的に送達されたマイクロRNAの両方を同時に同定し、リボソームRNAを含む他の小さなRNA種への読み取りを最小限に抑え、その読み取りを最小限に抑えることが可能です。rRNA)、RNA由来の小RNA(tsRNA)、反復由来の小RNA、およびmRNA分解産物を転写する。幸いなことに、マイクロRNAは5リン酸化および2-3ヒドロキシレート4であり、これらの他の小さなRNAおよびmRNA分解産物からそれらを分離するために利用することができる特徴である。マイクロRNAのクローニングとシーケンシングには、多くの場合、より迅速かつ簡単に多重化できるいくつかの商用オプションが存在します。しかし、キット試薬の独自の性質とその頻繁な変更は、サンプルランの比較を困難にします。当社の戦略は、アクリルアミドとアガロースゲル精製ステップを通じて、マイクロRNAの正しいサイズのみを収集するように最適化します。このプロトコルでは、オープンソースツールを使用してシーケンス読み取りをmicroRNAに合わせる手順についても説明します。この一連の命令は、私たちのライブラリの準備方法や商用方法を使用しているかどうかにかかわらず、初心者の情報学のユーザーに特に役立ちます。
このプロトコルは、いくつかの公開された研究で使用されています。例えば、ダイサー酵素がステムループ構造の内部ループから2つのヌクレオチドの距離で小さなヘアピンRNAを切断するメカニズムを同定するために使用された-いわゆる「ループカウントルール」5。我々はまた、これらの方法に従って、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAV)から発現される送達された小さなヘアピンRNA(shRNA)の相対的な存在量を同定し、肝臓の前に許容できるshRNA発現の閾値を同定した。過剰なshRNA発現に関連する毒性6.このプロトコルを用いて、我々はまた、このマイクロRNA7の分解パターンを特徴付けながら、高度に発現した肝マイクロRNAであるマイクロRNA-122の不在に応答する肝臓のマイクロRNAを同定した。私たちは、多くの実験で一貫してプロトコルを使用してきたので、我々は縦方向にサンプル調製物を観察することができ、識別可能なバッチ効果がないことを確認しました。
このプロトコルを共有する上で、私たちの目標は、手頃な価格の機器や試薬、および無料のバイオインフォマティクスツールを使用して、事実上あらゆる組織または細胞株で高品質で再現可能なマイクロRNAの定量を生成できるようにすることです。

<table><tbody><tr><td>100 bp DNAラダー</td><td>NEB</td><td>N3231</td><td></td></tr><tr><td>19:1 ビスアクリルアミド</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>25 bp DNAステップラダー</td><td>プロメガ</td><td>G4511</td><td></td></tr><tr><td>酸性フェノール/クロロホルム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミドRNAローディング色素</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーR0641</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム(APS)</td><td>Biorad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>バイオアナライザー機器</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>RNAの品質と濃度の評価用</td></tr><tr><td>クロロホル</td><td>ム フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(100%)</td> <td>シグマ</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングバッファー II</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM8547</td><td></td></tr><tr><td>グリコブルー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9516</td><td>青色はペレットの視覚化に役立ちます</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td><td>Genesee</td><td>45-109</td><td></td></tr><tr><td>miRVana microRNA isolation kit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>miSeq system</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>small RNA sequencing data</td></tr> <tr>の生成用<td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Nusieve低融点アガロース</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm (実験室用シーリングフィルム)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Poly-ethylene glycol 8000</td><td>NEB</td><td>included with M0204</td><td></td></tr><tr><td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td><td>NEB</td><td>E6560S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33226</td><td>DNA濃度の定量化用</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-331</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNAリガーゼ 1</td><td>NEB</td><td>M0204</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA リガーゼ 2, 切り捨て K227Q</td><td>NEB</td><td>M0351S</td><td></td></tr><tr><td>テープステーション</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>RNAの品質と濃度の評価用</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Biorad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース pH 7.5</td><td>シグマ</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Tris緩衝型EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Universal miRNA Cloning Linker</td><td>NEB</td><td>S1315S</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr></tbody></table>

micrornaを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

すべての人間の転写物の半分は、マイクロRNAによって調節されると考えられている.したがって、マイクロRNA発現の定量化は、疾患状態の根本的なメカニズムを明らかにし、治療標的およびバイオマーカーを提供することができる。ここでは、マイクロRNAを正確に定量する方法について詳しく述べる。簡単に言えば、この方法では、マイクロRNAの分離、ハイスループットシーケンシングに適したアダプターへのライゲーション、最終製品の増幅、サンプルライブラリの作成について説明します。次に、得られたシーケンシング読み取りをマイクロRNAヘアピンに合わせる方法を説明し、その微分発現を定量化、正規化、および計算する方法を説明する。多目的で、強い、この結合された実験ワークフローおよびバイオインフォマティクスの分析はユーザーがティッシュの抽出から始まり、マイクロRNAの定量で終わることを可能にする。

ライブラリの準備に関わるステップの概略図 小さな RNA 抽出、シーケンス、および位置合わせの全体的な概略を図2に概説します。 1匹のオスと1匹の雌マウスからの肝臓サンプルを採取し、液体窒素中で凍結した。全RNAを抽出し、品質と濃度について評価した。
小さなRNAシーケンシングは、シーケンシングに十分なRNAを得る 2つの独立したRNA抽出からのRNAの3 μgは、小さなRNAシーケンシングの開始材料として使用した。サンプルをアクリルアミドゲル上で実行し、RNAの17〜28ntに対応するサイズマーカー間で切り取った(図1A)。サンプルをRNA単離(図1B)の断片に切り刻み、低保持1.5mL遠...

ここでは、小型RNAを分離し、マイクロRNAを強化し、ハイスループットシーケンス用のサンプルを準備するためのステップバイステップの戦略について説明します。次に、オープン ソース ツールを使用して、シーケンスの読み取りを処理し、マイクロRNA に整列する方法について説明します。

MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

我々は、小さなRNAシーケンシングとオープンソースバイオインフォマティクスツールを用いた正規化された読み取り解析を分析するための、定義された、再現性のある、そして長年のプロトコルを開発しました。当社の戦略の主な利点は、ゲル精製を通じてマイクロRNAを正確に収集し、マイクロRNAの収集方法に関係なくバイオインフォマティクス分析を適用できることです。マイクロRNAの高スループットシーケンシングは、疾患メカニズム、マイクロRNAの処理、および小さなRNAを提供する遺伝子治療アプローチの正確な定量化に関する洞察を明らかにすることができます。RNaseフリーの環境で動作し、手順を通してすべてのRNA製品を氷の上に保つようにしてください。ゲル切削ステップを視覚化することで、下流アプリケーションに必要な製品の正しいサイズを見極めるのに役立ちます。3つの素数アダプターライゲーションの場合、11マイクロリットルのRNAを1.5マイクロリットルのATPフリー10X T4RNAリガーゼ反応バッファー、ポリエチレングリコール1マイクロリットル、3つのプライムリンカーの0.5マイクロリットルと組み合わせます。サーモサイクラーで95°Cでサンプルを30~40秒間加熱し、氷の上で1分間冷却します。T4RNAリガーゼ2の1マイクロリットルを加え、2時間室温で反応をインキュベートします。サンプルがインキュベートされている間に、プラスチック鋳造で0.8ミリメートル分離ガラス板の間に15%ポリアシリルアミドゲルを注ぎ、櫛を挿入します。ゲルが固まったら、タンクに0.5 5X TBEを加え、ピペットを激しく加えて残留尿素のウェルを洗浄します。ポリアクリルアミドゲルを375ボルトで25分間前走した後、各サンプルの間に少なくとも1車線を残してサンプルをロードする。20マイクロリットルのマーカーを非対称パターンにロードして、ゲルの向きを追跡し、一定の375ボルトでゲルを実行します。15分後、残りの走行のために一定の425ボルトに増加し、約2時間ゲルを実行します。実行の最後に、プレートセパレータを使用してガラス板からゲルを取り除き、ゲルをプラスチックページプロテクターに置きます。5マイクロリットルのエチジウム臭化物を500マイクロリットルの蒸留水で希釈し、トップライトブルーマーカーのすぐ上のマーカーレーンに染料を加えます。次に、きれいなカミソリの刃を使用して、紫外線下の各レーンの上部から下のマーカーにゲルをカットし、実験室のシーリングフィルムの4センチメートル四方に作品を移します。ゲルを水平に約3カット、垂直に2カットで切り、12個の小さな正方形を作り出します。400マイクロリットルの0.3モル塩化ナトリウムを封止フィルムに加え、ゲル片を1.5ミリリットルのシリコンチューブに導きます。一晩摂氏4度でヌテーターのサンプルを攪拌します。翌朝、各上清の400マイクロリットルを新しいチューブに移します。100%エタノールの1ミリリットルと1ミリリットルの15ミリグラムの1ミリリットルを1本のグリコーゲン共沈殿物をチューブあたりに加えます。その後、マイナス80度で1時間チューブを保存します。5つのプライムリンカーライゲーションの場合、まず解凍したサンプルをスピンダウンし、ペレットを水中に再懸濁させます。次に、0.5マイクロモル5プライムリンカー、T4RNAリガーゼバッファー1マイクロリットル、1マイクロリットルの10ミリモルATP、および各サンプルにポリエチレングリコール1マイクロリットルを加えます。反応を氷の上に置く前に、摂氏90度で30秒間加熱します。次に、各チューブにT4RNAリガーゼ1マイクロリットルを加え、室温で2時間反応をインキュベートします。逆転写の場合は、遠心分離によってサンプルを収集し、空気乾燥ペレットを8.25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で再懸濁します。100マイクロモル逆転写酵素プライマーの0.5マイクロモル逆転写酵素と相補的なDNA合成キットから2X逆転写酵素反応ミックスの5マイクロリットルを追加します。摂氏42度で3分後、サーモサイクラーで摂氏42度で30分間インキュベーションするために、各サンプルに10倍の逆転写酵素1.5マイクロリットルを加えます。中和後、29.5マイクロリットルの水、5マイクロリットルの10X taqバッファー、1マイクロリットルのヌクレオシド三リン酸、25マイクロモルフォワードプライマーの2マイクロリットル、25マイクロモル逆プライマーの2マイクロリットル、taqポリメラーゼの0.5マイクロリットル、および10マイクロリットルの逆転分解DNAを用いてPCR反応を調製する。次に、2 つの PCR 反応を実行します。アガロースゲル精製の場合、低融解アガロースを含む4%アガロースゲルを調製し、40マイクロリットル以上のPCR産物をローディング色素と100塩基対および25塩基対サイズマーカーでゲルにロードします。ゲルを実行した後、125塩基対バンドの上にバンドをカットし、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用します。適切な装置を使用して最終的なシーケンスライブラリを定量化する前に、ゲルバンドを室温でバッファーに溶解させます。次に、適切なオープンソースバイオインフォマティクスツールを使用して、シーケンスデータを分析します。この代表的なPCR反応では、低メルトアガロースゲルに対して、得られたリンカー産物と不飽和対飽和サンプルと比較して正しいクローン生成物の獲得が観察できる。ヒトマイクロRNAヘアピンにアライメントした後、各反復におけるマイクロRNA読み取りカウント間の強い一致が観察される。マイクロRNA 122にマッピングする読み取りの数が最も多い合計306種のマイクロRNAが検出された。マイクロRNAの正確な回復を可能にするために、ゲルを適切なサイズで切断することを忘れないでください。マイクロRNAをシーケンシングした後、ユーザーは、関心のある組織内のマイクロRNAの分布を特徴付けるためにバイオインフォマティクス分析を適用することができます。この技術は、マイクロRNAがどのように処理され、特定の癌でどのマイクロRNAのセットが変化するかを特定するために使用されてきた。臭化エチジウムを取り扱う際や、紫外線下でゲルを見る際には、必ず注意してください。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

MicroRNA(miRNA)は、広く保存された調節分子のクラスです。ここでは、2つの強力なライゲーションステップとそれに続くハイスループットシーケンシングに依存するmiRNAクローニング法について説明します。私たちの方法は、miRNAの正確なゲノムワイド定量を可能にします。...

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

私たちは、増幅を必要とせずに生物学的基質中の分子をバーコード化し、カウントすることにより遺伝子発現を定量化するマルチプレックスハイスループット遺伝子発現プラットフォームの使用について説明します。このプラットフォームを使用して、過敏性腸症候群の有無にかかわらず、全血中のマイクロRNA(miRNA)発現を定量しました。...

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

このプロトコルは、小さな RNA ライブラリーの構築と次世代シーケンシングのための細胞培養媒体からマイクロ Rna は細胞を浄化する方法を示します。さまざまな品質管理のチェックポイントは、exRNAs...

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

ここで肺式を評価する方法について述べる予測される miRNAs...

肺のマイクロ Rna 発情周期にわたってプロファイリングのオゾン暴露マウスの

バイオインフォマティクスパイプライン、すなわちmiRDeep-P2(略してmiRDP2)は、植物miRNA基準とオーバーホールされたアルゴリズムを備えており、特に複雑で大きなゲノムを持つ種に対して、植物のマイクロRNA転写物を正確かつ効率的に分析することができました。...

植物におけるマイクロRNA転写物を正確かつ効率的に分析するバイオインフォマティクスパイプライン

我々は、標準的な方法よりもバイアスが少ない詳細な小さなRNAライブラリー修復プロトコルと2'-O-メチルRNAの感度の増加を提示する。このプロトコルは、コストを節約するために自家製試薬を使用するか、便宜上キットを使用して従うことができます。...

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

ここでは、1)既知および新規のmiRNAをより正確に同定でき、2)完全に自動化され、自由に利用できる新しい完全に自動化されたmiRNAパイプラインmirMachineを紹介します。ユーザーは、短い送信スクリプトを実行して、完全に自動化された mirMachine...

mirMachine:植物miRNAアノテーションのワンストップショップ

本プロトコールは、ダニ唾液腺および精製された細胞外小胞からのマイクロRNAの単離を記載する。これは、一般的に使用される試薬と消耗品を組み合わせた普遍的な手順です。この方法はまた、少数のダニの使用を可能にし、容易に配列決定することができる高品質のマイクロRNAをもたらす。...

ダニ Ex Vivo 唾液腺培養物および細胞外小胞からのマイクロRNAの単離

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

単一細胞配列決定は、高解像度でゲノムの変化に対処するため、ますます人気とアクセス可能なツールです。我々は、単一の細胞内のコピー数の変化を識別するために、単一細胞の配列決定を使用するプロトコルを提供します。...

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

学ぶ ゲル精製とオープンソースバイオインフォマティクスツールを用いたマイクロRNAの分離・シーケンス解析法。疾患メカニズムと遺伝子治療の定量化に応用可能な再現性の高いプロトコルです。

MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

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