Name: 癌における広範な非遺伝的転写伸長欠損(TE)を研究する慢性CDK9阻害のマウス細胞株ベースモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶCDK9阻害によるマウス細胞株モデルで、転写伸長欠損を模倣し免疫療法抵抗性を研究する方法。がん免疫相互作用の新たな治療戦略を探索できます。

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この作品は、NCI(CA193549)とCCHMCリサーチイノベーションパイロット賞のカカジャン・コムロフ賞、国防総省(BC150484)がナヴニー・シンに授与されました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立がん研究所または国防総省の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に何の役割も持ちはありませんでした。

<ol><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).</li>
<li>Margaritis, T., Holstege, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poised+RNA+polymerase+II+gives+pause+for+thought%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Poised RNA polymerase II gives pause for thought.</a> Cell. 133 (4), 581-584 (2008).</li>
<li>Modur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+transcription+elongation+in+a+subset+of+cancers+confers+immunotherapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance.</a> Nature Communications. 9 (1), 4410(2018).</li>
<li>Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+inducible+gene+expression+by+signal-dependent+transcriptional+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation.</a> Cell. 138 (1), 129-145 (2009).</li>
<li>Adelman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+mediators+of+the+inflammatory+response+are+poised+for+gene+activation+through+RNA+polymerase+II+stalling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).</li>
<li>van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+CTLs+Require+a+Single+Brief+Period+of+Antigenic+Stimulation+for+Clonal+Expansion+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li>
<li>Gilchrist, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+regulators%3A+the+pervasive+effects+of+Pol+II+pausing+on+stimulus-responsive+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks.</a> Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).</li>
<li>Danko, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+differentially+affect+RNA+polymerase+II+initiation%2C+pausing%2C+and+elongation+rate+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells.</a> Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).</li>
<li>Nechaev, S., Adelman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol+II+waiting+in+the+starting+gates%3A+Regulating+the+transition+from+transcription+initiation+into+productive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+modifies+the+activity+of+CDK9+to+phosphorylate+serine+5+of+the+RNA+polymerase+II+carboxyl-terminal+domain+during+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).</li>
<li>Palancade, B., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+RNA+polymerase+II+carboxyl%E2%80%90terminal+domain+%28CTD%29+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

RNA Pol II伸長制御は、悪性細胞5、7、8の利益に対する刺激応答性遺伝子発現を調節するための決定的なレバーとして出現した。伸びに対するプロモーター近位休止を克服し、その後のmRNA産生は、P-TEFb9、10、11のキナーゼ活性を必要とする。我々のモデルは、本質的なサイクリン依存性キナーゼCDK9の阻害剤であるフラボピリドール(25 nM)を利用して、TEのPol II伸長中に観察された欠陥を模倣する間違いなく癌(我々のグループによって発見された癌の未知の表現型)を模倣する。以前の3.
CDK9キナーゼ活性は、長い間、Pol IIの大サ...

ほぼすべての活性遺伝子の発現における重要な速度制限ステップは、プロモーター近位休止から生産的な伸び1、2へのRNAポリメラーゼII(RNA Pol II)の遷移である。転写伸びのエピジェネティックな調節がTEと定義された複数のヒト悪性腫瘍の進行を確実に助長することを考えると、反応不良に相当する炎症性反応経路における最適でないシグナル伝達を引き起こす免疫療法3への結果は、このプロトコルの包括的な目標は、癌におけるこれらの広範な非遺伝的転写異常を研究するために有用なインビトロモデルを確立することです。この点において、CDK9の慢性薬理学的阻害の使用は、転写伸長およびmRNA処理欠陥における非遺伝的広範な破壊の全身化可能なモデルを作成するための有効な戦略である。慢性CDK9阻害を用いた根拠は、RNA Pol IIのC末端反復ドメイン(CTD)上のセリン2残基のリン酸化を緩和し、したがって、生産的な転写伸びへのRNA Pol IIの放出を抑制する。また、TEは、我々のグループ3によって前述した、間違いなく癌は、任意の特定の体細胞変異下に分類されない。したがって、非遺伝的(薬理学的)モデルは有利であり、それらに観察される広範な転写およびエピジェネティックな欠陥を最もよく模倣する。本明細行の方法は、マウス癌細胞の慢性フラボピリドール治療モデルの生成および特徴付けについて詳述する。この方法は、TNF/NF-κBおよびインターフェロン/STATシグナル伝達のような、より長いゲノム長さによって特徴付けられた遺伝子に沿った転写伸長を実証的に破壊し、そのレベルで深く制御される。転写伸長3,4,5.全体的に、転写伸び欠陥のこの最適化されたマウス細胞ラインモデルは、新たに記述されたTE間違いなく腫瘍を研究する我々の知識に対する唯一のモデルであり、抗腫瘍免疫攻撃に対する耐性を駆動し、悪用する有用なシステムをレンダリングし、がんにおけるコア転写機械における非遺伝的欠陥の脆弱性を調べる。

<table><tbody><tr><td>hhis6FasL</td><td>Cell Signaling</td><td>5452</td><td></td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>12 well plates</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>20% methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash;18% SDS ポリアクリルアミドゲル</td><td>Bio-Rad</td><td>4561086</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>5% 粉ミルク</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>7-メチルグアノシン抗体</td><td>BioVision</td><td>6655-30T</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Cellstar</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AF647-標識マウス CD8</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100727 抗生物質および抗真菌薬</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>抗 His 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2366&thinsp;P</td><td></td></tr><tr><td>抗ラビット</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7074</td><td>希釈 1:5000</td></tr><tr><td>抗ラット</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7077S</td><td>希釈 1:5000</td></tr><tr><td>ブラッドフォードアッセイキット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>5000121</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ACROS Organics</td><td>24040-0100</td><td></td></tr><tr><td>BV421標識マウス CD45</td><td>バイオレジェンド</td><td>109831</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット</td><td>シグマ</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ギブコ</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ダイナビーズ オリゴ (dT)25</td><td>アンビオン</td><td>61002</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ギブコ</td><td>45015</td><td></td></tr><tr><td>固定可能なライブ/デッド染色色素 e780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>フラボピリドール</td><td>セレッケム</td><td>S1230</td><td></td></tr><tr><td>H3K36ME3</td><td>アブカム</td><td>ab9050</td><td>希釈 1:2000</td></tr><tr><td>IFN-&alpha;</td><td>R&Dシステム</td><td>12100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&ガンマ;</td><td>R&D systems</td><td>485-MI-100</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td></td></tr><tr><td>NF-&kappa;B</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>8242s</td><td>希釈 1:1000</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>p-NF-&kappa;B</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3033s</td><td>希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>p-Ser2-RNAPII</td><td>活性モチーフ</td><td>61083</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>p-Ser5-RNAPII</td><td>活性モチーフ</td><td>61085</td><td>希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>p-STAT1</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7649s</td><td>希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>RiboMinu 真核生物キット</td><td>Ambion</td><td>A10837-08</td><td></td></tr><tr><td>RIPA バッファー</td><td>Santa Cruzバイオテクノロジー</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>RNAPII</td><td>アクティブ モチーフ</td><td>61667</td><td>希釈 1:1000</td></tr><tr><td>STAT1</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9175s</td><td>希釈 1:1000</td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td>R&D systems</td><td>410-MT-010</td><td></td></tr><tr><td>total H3</td><td>Cell Signaling</td><td>4499</td><td>Dilution 1:2000</td></tr><tr><td>Tri reagent</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AA Hoefer</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin</td><td>Cell Signaling</td><td>12620S</td><td>Dilution 1:5000</td></tr><tr><td>&beta;-ME</td><td>Gバイオサイエンス</td><td>BC98</td><td></td></tr></tbody></table>

癌における広範な非遺伝的転写伸長欠損(te)を研究する慢性cdk9阻害のマウス細胞株ベースモデル

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdeff) in Cancers

我々は以前に、癌のサブセットは、mRNA転写伸長(TE)の広範な欠陥を伴う世界的な転写規制緩和によって定義されていると報告しました- 我々は間違いなくTEとしてそのような癌を呼び出します。特に、TE間違いなく癌は、インターフェロン/JAK/STATおよびTNF/NF-B経路などの大きな遺伝子群における偽の転写および欠陥のあるmRNA処理によって特徴付けられ、その抑制につながる。腎細胞癌および転移性黒色腫患者における腫瘍のTEは間違いなく免疫療法における不十分な応答および結果と相関する。TEの間違いなく癌を調査することの重要性を考えると、免疫療法に対する重大な障害を引き起こすので、このプロトコルの目的は、これらの広範な非遺伝的研究を研究するために、インビトロTE間違いなくマウスモデルを確立することです。癌の転写異常と新しい洞察を得る, 既存の薬剤のための新しい用途, またはそのような癌に対する新しい戦略を見つける.RNAポリメラーゼII(RNA Pol II)のC末端反復ドメイン(CTD)上のセリン2残基のリン酸化を損分化する慢性フラボピリドール媒介CDK9阻害の使用を詳述し、RNA Pol IIの放出を生産的な転写に抑制する。伸長。TEは間違いなく特定の体細胞変異に分類されていないことを考えると、薬理学的モデルは有利であり、それらに観察される広範な転写およびエピジェネティックな欠陥を最もよく模倣する。フラボピリドールの最適化された亜致死量の使用は、転写伸長およびmRNA処理欠陥における非遺伝的広範な破壊の一般化可能なモデルを作成する唯一の有効な戦略であり、臨床的に観察されたTEを密接に模倣する間違いなく特性。したがって、TEのこのモデルは間違いなく、免疫媒介細胞攻撃に抵抗するそれらを可能にする、細胞自律的な因子を解剖するために利用することができる。

ここでは、25nMでフラボピリドールを使用した慢性サブ致死(図2)治療により得られたTE確実細胞モデルを確立するための詳細なスキーム(図1)を提供する。図3では、フラボピリドールによる3日間の治療において、B16 OVA細胞はTEの部分特性を明らかにしたが、治療の1週間後、B16/F10 OVA細胞はRNA Pol IIのCTD上のセリン2位置におけるリン酸化の重大な損失を示す。H3K36me3の有意な減少を伴う-エキソン境界の定義に関与するヒストン修飾と逃げ出す不可解な転写の阻害剤。その結果、TEは間違いなく細胞モデルが不適切にキャップされ、非ポリアデニル化mRNAの比が明らかに増加した重要なmRNA処理欠陥を示す(図4A、B)。また、...

このプロトコルは、非遺伝的欠陥転写伸びのインビトロマウス癌モデルを詳述する。ここで、CDK9の慢性阻害は、全癌型の約20%に存在する臨床的に過剰なTE間違いなく現象を模倣し、研究するために、炎症反応遺伝子に沿ったRNA Pol IIの生産的な伸びを抑制するために使用される。

癌における広範な非遺伝的転写伸長欠損(TE)を研究する慢性CDK9阻害のマウス細胞株ベースモデル

We have previously reported that a subset of cancers is defined by global transcriptional deregulations with widespread deficiencies in mRNA transcription ...

TEdeffがんが免疫療法に対する重要な障害であることを考えると、当社の薬理学的モデルは、このような癌で観察される広範な転写およびエピジェネティック欠陥を適切に模倣し、これらの非遺伝的異常を研究して新しい洞察を得たり、既存の薬物の新しい用途を見つけたり、そのような癌に対する新しい戦略を見つけることができるので、有利なツールです。これは、がんの転写伸長欠損を研究するための容易で一般化可能なモデルであり、インビトロとインビボの両方で腫瘍免疫相互作用を研究することを可能にする。この方法は、ヒト癌株にも適用することができる。T47DとCAL51で短期間テストを行い、同様のTEdeffのような特性を生み出しました。ここで説明するプロトコルは、慢性CDK9阻害によるTEdeff様特徴の生成に重要な既知の変数を最小限に抑えるための基本的なフレームワークを提供する。しかし, 他のマウスラインのフラボピリドールの正確な亜死量を最適化するために注意する必要があります。.細胞めっき密度の変動の影響、培養条件、サイトカイン刺激条件は、異なる細胞マウス株に応じて変化し得る。オリゴdT磁気ビーズを使用して、以前リボソームRNA枯渇サンプルの半分からポリA陽性RNAを抽出することから始めます。バイアル内のビーズを30秒間ボルテックスして再懸濁し、200マイクロリットルのビーズをチューブに移します。同じ量のバインド バッファを追加し、内容を混ぜます。チューブを磁石に1分間入れ、上清を捨てます。次いで、マグネットからチューブを取り出し、洗浄したビーズを100マイクロリットルの結合バッファーに再懸濁した。リボソーム RNA で枯渇したサンプルの体積を 100 マイクロリットルに調整し、pH 7.5 で 10 ミリモルトリス-HCl を使用します。100マイクロリットルの結合バッファーをサンプルに加えます。混合物を摂氏65度に2分間加熱して二次RNA構造を破壊し、すぐに氷の上に置きます。洗浄されたビーズの100マイクロリットルにRNAの合計200マイクロリットルを加え、ローターで5分間十分に混ぜます。チューブをマグネットに1~2分間置き、慎重にすべての上清を取り出し、マグネットからチューブを取り出し、200マイクロリットルの洗浄バッファーを加えます。サンプルを数回上下にピペットして慎重に混ぜ、チューブを磁石に1分間戻し、上清を取り除きます。次いで、分光光度計を用いて、単離されたビーズ結合mRNAの純度および濃度を測定する。リボソームRNA枯渇サンプルの残りの半分をプロテインAカラムへの入力として使用し、モノクローナル7-メチルグアノシン抗体を有する5素数のキャップ付きRNAを免疫沈降させます。メーカーのプロトコルに従ってRIPキットからタンパク質A磁気ビーズを洗浄し、ビーズに抗体を事前結合し、7-メチルグアノシン抗体をビーズに対して100マイクロリットルの洗浄バッファーに懸濁します。低温で回転しながら、室温で30分間インキュベートします。その後、チューブを短く遠心し、磁気セパレータに置きます。上清を取り出して捨て、次にチューブを磁気セパレータから取り出し、500マイクロリットルの洗浄バッファーでビーズを再懸濁します。チューブをボルテックスし、遠心分離し、磁気セパレータに戻し、再び上清を捨てます。その後、抗体結合ビーズにリボソームRNAを120ナノグラム加え、RNase阻害剤を1マイクロリットルずつ加え、穏やかな攪拌で60〜90分間室温で混合物をインキュベートします。インキュベーション後、サンプルを300回gで10秒間回転させ、上限のないmRNAを用いた上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。洗浄バッファーを100マイクロリットルでさらに2回繰り返し、回収した上清をプールします。ビーズからキャップされたmRNAを、原稿の指示に従って調製した300マイクロリットルの尿素溶菌バッファーを加え、混合物を摂氏65度に2〜3分間加熱することによって、ビーズから溶出する。溶出したサンプルの300マイクロリットルをフェノールの300マイクロリットルと組み合わせる:クロロホルム:イソアミルアルコール、反転して混合し、10分間放置します。サンプルをもう一度軽く混ぜ、遠心分離機を2分間緩やかに混ぜます。最上層を新鮮なチューブに慎重にピペットし、底層を捨てます。サンプルに300マイクロリットルの2-プロパノールと3モル酢酸ナトリウム30マイクロリットルを加え、数回反転し、マイナス20度に20時間入れます。インキュベーション後、摂氏4度で10分間サンプルを遠心分離します。上清を慎重に捨て、ペレットを室温で5分間乾燥させます。ヌクレアーゼを含まない水中のペレットを再懸濁し、分光光度計でRNAの純度と濃度を測定します。原稿の方向に従ってCD8陽性細胞を単離し、次いで市販の磁気分離システムバッファー内の細胞を再懸濁させる。1ミリリットルの細胞に100マイクロリットルの抗体カクテルを加え、氷の上で細胞を15分間インキュベートします。その後、抗体カクテル100マイクロリットルごとに100マイクロリットルの磁気ビーズを加え、さらに15分間氷の上に細胞を残します。インキュベーションの後、細胞に7ミリリットルの磁気分離バッファーを加え、新鮮なチューブに3〜4ミリリットルをアリコートし、チューブを磁気上に5分間置きます。CD8陽性細胞で液体を氷の上の新鮮なチューブにデカントします。次に、残りの3~4ミリリットルのセルを磁気ビーズに加え、マグネット上にチューブを5分間置きます。CD8陽性細胞の第2バッチを第1のバッチでチューブにデカントする。種子は、24ウェルプレートでウェルあたり75,000細胞で共刺激分子と一緒に付着線維芽細胞を設計し、37°C、5%炭酸加湿インキュベーターで培養した。24時間後、APC単層をIscoveの改変ダルベッコの培地で1回洗浄し、原稿の指示に従って補足される培地の2ミリリットルの6つのナイーブセルに0.5倍の10を加えます。細胞を20時間培養し、次いで培地を回収し、191回gで細胞を2分間ペレットすることにより、非接着性のOT-I細胞を穏やかに収穫する。細胞を数え、B16/F10、未処理のB16/F10-OVA、およびフラボピリドールで前処理されたB16/F10-OVA細胞との共培養で1対1の比率で播種する。細胞を摂氏37度で20時間培養し、5%炭酸ガスを加湿インキュベーターで培養し、次いでOT-I CD8陽性細胞を除去し、その後、付着性B16/F10-OVA細胞をPBSで洗浄する。付着した細胞の3つのグループをトリプシンで05%EDTAにトリプシンし、191回gで5分間ペレットします。採取したB16/F10-OVA細胞を生育性染料および関連する標識抗体を用いて冷たいPBSでインキュベートし、次にフローサイトメトリーで生存率を分析する。このプロトコルは、RNAポリメラーゼIIのC末端反復ドメイン上のセリン2位におけるリン酸化の深い損失とH3K36me3の有意な減少を示す転写伸長欠陥細胞モデルを確立するために使用され、これはエキサポン境界の定義および暴走不可解な転写の阻害に関係する。細胞は、不適切にキャップされたmRNAおよび非ポリアデニル化mRNAの比率を増加させる重大なmRNA処理欠陥を示す。さらに、主要な炎症反応経路遺伝子およびFasL媒介細胞死の特異的抑制が、この細胞モデルにおいて観察される。細胞モデルが細胞傷害性T細胞攻撃に対する耐性を与えるかどうかをテストする探索的アッセイは、慢性フラボピリアイドル誘発転写伸長欠陥が抗腫瘍免疫攻撃からの脱出手段を与えることができることを示している。OVA遺伝子を安定的に過剰発現するフラボピリドール処理B16/F10細胞は、OVA発現細胞に対して選択的毒性を有するCD8陽性細胞傷害性T細胞の影響を受けにくい。フラボピリドールで前処理されなかった細胞は大きな細胞死を経験し、OVA抗原を発現しない親B16/F10は生存した。25ナノモルフラボピリドール処理におけるホスホセリン2およびH3K36トリメチル化レベルの低下は、phopsho-STAT1およびホスホ-NF-κBレベルの両方の低下を保証しないことを覚えておくことが重要です。各マウス癌の線は独特であり、JAK1およびCCNT1はフラボピリドールの効果を救うかもしれない。さらに、このモデルは、先天性および適応性抗腫瘍免疫応答に対してTEdeff癌によって提供される耐性を監視するために生体内で使用することができる。例えば、抗アシアロ治療はNK細胞の活性を調節するために使用することができ、免疫チェックポイント療法はTEdeff腫瘍を持つマウスに投与することができる。腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)負荷は、免疫療法の成功の指標です。私たちのモデルは、免疫療法の前後のTEdeffがん微小環境におけるTLの活性化と疲労の程度を探求する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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miRNA の治療には、癌の進行を調節する重要な可能性があります。ここに示す解析的アプローチ、組合せ miRNA...

組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析

頭頸部癌患者で変異した特定の遺伝子を有するマウスモデルの開発は、新生物の理解のために必要とされる。ここでは、アデノ関連ウイルス-Cas9系を用いた原発マウス舌細胞の体外変換に関するプロトコルを提示し、特定のゲノム改変を有するマウスHNC細胞株を生成する。...

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

このプロトコルでは、 in vitro/in vivo...

分子および計算研究のためのツールとしてのマウス乳腺腫瘍からの癌関連線維芽細胞

学ぶCDK9阻害によるマウス細胞株モデルで、転写伸長欠損を模倣し免疫療法抵抗性を研究する方法。がん免疫相互作用の新たな治療戦略を探索できます。

癌における広範な非遺伝的転写伸長欠^損(TE)を研究する慢性CDK9阻害のマウス細胞株ベースモデル

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