Name: ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶRIPiT-Seq法によるRNAタンパク質複合体の足跡同定技術。2段階の免疫沈殿で組成特異的複合体を精製し、哺乳類細胞におけるRNA結合タンパク質の機能解析と疾患関連研究に活用できます。

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著者は何も開示していない。

ここでは、RIPiT を正常に実行するための重要な考慮事項について説明します。何よりも、個々の IP を最適化して、各ステップで可能な限り高い効率を実現する必要があります。ここで説明する細胞の入力数に対するFLAGアガロースビーズの量は、我々がテストしたタンパク質の広い範囲に対して堅牢であることが証明されています。パートナータンパク質のほんの一部のみがFLAGタンパク質と共免疫沈殿しているので、効率的な第2のIPに必要な抗体の量は通常低い(10 μg未満)。小規模なRIPiT(10cmプレートから)に続いて、2つの免疫沈殿ステップの間に各画分におけるタンパク質のウェスタンブロット検証は、スケールアップする前に手順の効率と特異性を評価するのに非常に有用であることが証明されます。標的タンパク質と複合体内の他の予想される相互作用タンパク質の両方が溶出中に検出されるべきである。また、枯渇したライザス(FLAG-agaroseまたは磁気ビーズに結合しない)のタンパク質のアッセイは、免疫沈殿効率と複合体に組み立てるタンパク質の割合の良好な推定値を有することも有益です。さらに、この分析は、RnP内のRNA依存性相互作用からRNA依存性相互作用を分離す...

細胞内では、RNAはタンパク質と複合体内に存在し、RNA:タンパク質複合体(RAP)を形成します。RPは、RNA結合タンパク質(RRB、RNAを直接結合するもの)を中心に組み立てられますが、非RRB(RNAと結合するもので、RNAを結合しないもの)も含み、多くの場合、本質的に動的です。RRBとその共因子は、RRB内で一括して機能し、規制機能を実行します。例えば、ナンセンス媒介mRNA減衰(NMD)経路では、UPFタンパク質(UPF1、UPF2、およびUPF3b)は、早期に終了したリボソームを認識する。UPFタンパク質のそれぞれはRNAに結合することができますが、それらが一緒に組み立てるときだけ、活性NMD複合体が形成され始めます。この複合体内では、UPF1は非RBP SMG1によるリン酸化によってさらに活性化され、そのようなUPF1活性化は最終的にmRNA減衰誘導因子1、2の募集につながる。この例では、RBP は、NMD をトリガーする RNP 複合施設の採用およびアクティブ化に非 RBP 副要因を必要とします。RPのもう一つの性質は、その組成的不均一性である。異なる E、A、B、または C の複合体に存在するスプライセオソームを考えてみます。異なるスプリセオソーム複合体は、重複し、異なるタンパク質3を有する。RNP機能を研究するには、どのRNAがRBPとその関連タンパク質によって結合されているかを解明することが重要です。これを達成するために多くの方法が存在し、各アプローチには明確な長所と短所 4、5、6、7があります。
RBP結合部位を同定する広く一般的な方法-架橋に続いて免疫沈殿(CLIP)およびその様々なバリエーション - RBPをRNA8に架橋するために紫外線(UV)光に依存しています。ただし、これは、RNA に直接接触しない RP 内の非 RRB に対する効果的なアプローチではありません。ここでは、RNA 結合部位を分離して同定するために、RBP および非 RBP に適用可能な代替アプローチについて説明します。このアプローチは、連動してRNA免疫沈殿(RIPiT)と呼ばれる2つの免疫沈殿ステップからなり、単一の精製と比較してより高い特異性を達成するのに役立ちます(図1)9、10。個々の免疫沈殿(IP)ステップはCLIPと比較して低いストリンジェンシーで行うことができるので、RIPiTは免疫沈殿時に強い洗剤の存在に耐えることができる抗体の利用可能性に依存しない。RIPiTの最もユニークな利点は、2つの精製ステップで2つの異なるタンパク質を標的にする能力です。これは、他の同様の複合体11から組成的に異なるRNP複合体を豊かにする強力な方法を提供します。
RIPiTプロシージャへの小さなバリエーションは、RNP濃縮をさらに高めることができます。例えば、RP内のRNAタンパク質またはタンパク質とタンパク質の相互作用の一部は一過性であり、そのような複合体のフットプリントを効率的に精製することは困難である場合があります。このような相互作用を安定させるために、RPは細胞リシスおよびRIPiTの前にホルムアルデヒドと細胞内で架橋することができる。例えば、エキソン接合複合体(EJC)コア因子であるEIF4AIIIとEJC分解因子との間の弱い相互作用が、PYM12がより多くのRNAフットプリントが濃縮されるようなホルムアルデヒド処理で安定化できることを観察しました(データはが表示されます)。細胞採取およびRIPiTの前に、細胞はまた、特定の状態でRPを安定化または濃縮する薬物で治療することができる。例えば、翻訳中にmRNAから除去されるタンパク質を研究する場合(例えば、EJC 13、UPF114)、ピューロマイシン、シクロヘキシミドまたはハリントンチンなどの翻訳阻害剤による治療は、RNA上のタンパク質。
RIPiTから回収されるRNAの量は通常低い(0.5-10プレモル、すなわち、75 ntの平均RNA長を考慮して10〜250 ng RNA)。この主な理由は、特定のタンパク質のほんの一部のみがRP内の他のタンパク質と複合体内に存在する(第1ステップで行われた任意の「自由な」タンパク質IPが第2のIP中に失われる)。このRNAからRNA-Seqライブラリーを生成するために、我々はまた、このような低RNA入力に適した以前に公開されたプロトコルの適応を概説する 15,16 (図2), これは、3でハイスループットシーケンシング準備サンプルを得る日。

<table><tbody><tr><td>アンチFLAGアフィニティゲル</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>ATP、[&γ;-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide、250 &micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A250UC</td><td></td></tr><tr><td>BD 使い捨てシリンジ Luer-Lokチップ付き (200)</td><td>Fisher</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Betaine 5M</td><td>Sigma</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-dATP</td><td>TriLink</td><td>N-5002</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-dCTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL540001EA</td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier, Model SSE-1</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CircLigase I</td><td>VWR</td><td>76081-606</td><td>ssDNA ligase I</td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>ThermoFisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DNA load buffer NEB</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>LifeTech</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In-T-REx 293 Cell Line</td><td>ThermoFisher</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Low Range DNA Ladder</td><td>ThermoScientific</td><td>FERSM1203</td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアン TBE ゲル 10 ウェル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>4565013</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアン TBE-尿素ゲル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>4566033</td><td></td></tr><tr><td>miRCAT-33 アダプター 5&prime;-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>Mirus transIT-X2トランスフェクション試薬</td><td>Mirus</td><td>MIR 6004</td><td></td></tr><tr><td>Mth RNAリガーゼ</td><td>NEB</td><td>E2610S</td><td></td></tr><tr><td>PE1.0 5&prime;-AATGATACGGCGGACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illumina シーケンシング プラットフォーム</td></tr><tr><td>PE2.0 5&prime;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illumina シーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl)</td> <td>Fisher</td><td>BP1752I-100</td><td></td></tr><tr><td>Purple Gel Loading Dye (6x)</td><td>NEB</td><td>NEB #7025</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491S/L</td><td></td></tr><tr><td>RNase I, E. coli, 1,000 U</td><td>Eppicenter</td><td>N6901K</td> とのみ互換性があります。<td></td></tr><tr><td>SPIN-X カラム</td><td>Corning</td><td>CLS8160-24EA</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジンビーズ</td><td>ThermoFisher</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III (SSIII)</td><td>ThermoScientific</td><td>18080044</td><td>逆転写酵素</td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td>金核酸ゲル染色</td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ-2500U</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4RNL2 Tr. K227Q</td><td>NEB</td><td>M0351S</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>Sigma</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>耐熱性 5&acute;アプリケーション DNA/RNA リガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0319S</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq_SE1 5&prime;-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCTCTCGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE10 5&prime;-pGGTTCTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE11 5&prime;-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCaccgctc TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE12 5&prime;-pGGAGATGNNNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE2 5&prime;-pGGGTAGCNNNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE35&prime;-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTCTCCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE4 5&prime;-pGGCCTCGNNNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCTCTCCTGAACCGCTCaccgctc TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE5 5&prime;-pGGTGACANNNNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE6 5&prime;-pGGTAGACNNNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE7 5&prime;-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCTCTCGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE8 5&prime;-pGGATCGGNNNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr><tr><td>TruSeq_SE9 5&prime;-pGGACTGANNNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>この</td><td></td><td>プロトコルは、Illuminaシーケンシングプラットフォーム</td></tr>、<tr><td>Typhoon 5、Bimolecular Imager</td><td>、GE、Healthcare Life Science</td><td>29187191</td><td></td></tr>とのみ互換性</tbody></table>があります

ランデムにおけるrna免疫沈殿によるrnaタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(ripit-seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

タンデムにおけるRNA免疫沈殿(RIPiT)は、RNA:タンパク質(RNP)複合体内の一対のタンパク質のRNAフットプリントを濃縮する方法である。RIPiTは2つの精製ステップを採用しています。まず、タグ付きRNPサブユニットの免疫沈殿は、軽度のRNase消化およびその後の非回想性親和性溶出が続く。別のRNPサブユニットの第2の免疫沈殿は、定義された複合体の濃縮を可能にする。RNAおよびタンパク質の変性溶出に続いて、RNAフットプリントはハイスループットDNAシーケンシングライブラリーに変換されます。より一般的な紫外線(UV)架橋に続いて、RBP結合部位を濃縮する免疫沈殿(CLIP)アプローチとは異なり、RIPiTはUV架橋に依存しません。したがって、RIPiTはRNA相互作用に存在する多数のタンパク質に適用することができ、その先はRNA調節に不可欠であるが、RNAまたはUVクロスリンクに不十分に直接接触しない。RIPiTの2つの精製ステップは、目的のタンパク質が別の因子と連携して作用する結合部位を同定する付加的な利点を提供する。二重精製戦略はまた、背景を制限することによって信号を強化するのに役立ちます.ここでは、RIPiTを実行し、分離されたRNAフットプリントからハイスループットシーケンシングライブラリを生成するためのステップワイズ手順を提供します。また、RIPiTの利点とアプリケーションの概要を説明し、その制限事項について説明します。

RIPiTが成功すると、目的のタンパク質と他の既知の相互作用タンパク質の両方の免疫沈殿と、非相互作用タンパク質の不在が生じる。図3Aに見られるように、MagohとEIF4AIIIの両方がRIPiT溶出で検出されたが、HNRNPA1は検出されなかった(レーン6)。並行して、RNP複合体と共精製したRNAフットプリントは、自動無線撮影(図3B)またはバイオアナライザ(図3C)を介して検出された。ピューロマイシン治療はRNAのEJC占有率を増加させると予想され、図3Bのピューロマイシン処理RIPiTにおいてより強いRNAフットプリントシグナルが観察された(レーン2および3を比較)。深いシーケンシングのためのサンプルを生成するには、アダプターをRNAにライディングし、アダプタ...

ここでは、哺乳動物細胞由来のRNA:タンパク質(RNP)複合体の内因性RNA結合部位または「フットプリント」を濃縮するプロトコルを提示する。このアプローチは、RNPサブユニットの2つの免疫沈殿を伴い、したがって、並行してRNA免疫沈殿(RIPiT)と呼ばれています。

ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

タンデムでのRNA免疫沈降、シーケンシング、またはRIPiT-Seqは、RNAのどの領域が特定のRNA結合タンパク質によって結合されているかを同定するための方法である。RIPiTの最もユニークな利点は、2つの精製で2つの異なるタンパク質を標的にする能力です。これは、他の複合体とは組成的に異なるRNAタンパク質複合体を濃縮するための強力な方法を提供します。また、RIPiT-SeqはUV架橋独立性であり、直接結合することなくRNAに作用する多くのタンパク質に適用することができます。この方法は直接的に治療や診断に向けては及びませんが、RNA結合タンパク質およびRNA処理は神経障害および癌のようないくつかの疾患に関連しています。RIPiT-Seqは、疾患に関連するRNA結合タンパク質の機能を研究するためのツールを提供します。RIPiT-Seqはエピトープタグ付きタンパク質を発現できるシステムを必要とします。HEK293細胞でしか試験されておらず、細胞培養に最も適している。しかし、CRISPRを使用してタンパク質にタグを付ける能力を持つRIPiT-Seqは、現在の多様なシステムに適用できます。RIPiTの成功は2つの効率的な免疫沈降に依存するため、使用されている抗体の免疫沈降条件を最適化することが重要です。また、RNAを使用するには適切な予防措置が必要であるため、RNA抽出中および後にRNaseフリー試薬を使用する必要があります。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の大学院生であるローレン・ウッドワードです。15センチメートルプレートあたり15ミリリットルの冷やされたPBSで単層細胞を穏やかに洗浄することによって開始します。その後、PBSの30ミリリットルに細胞を削り取り、50ミリリットルの円錐管に集めます。400gで400gで摂氏4度で10分間遠心して細胞をペレットにし、上清を捨てる。氷冷低張性のリシスバッファーの4ミリリットルを追加し、細胞を再中断するためにP1000ピペットを使用しています。ライセートを5ミリリットルのチューブに移し、氷の上で10分間インキュベートします。氷浴にライセートを入れ、原稿の指示に従って超音波処理します。その後、5モル塩化ナトリウムの108マイクロリットルを加え、塩濃度を150ミリモルに調整します。次いで、摂氏4度で10分間10分間12,000gの後にリセートを遠心し、ウェスタンブロット分析のために上清の20マイクロリットルを回収する。事前洗浄FLAGアガロースビーズ原稿の指示に従って、5ミリリットルチューブ内のビーズの750マイクロリットルに残りの上清を適用します。FLAGアガロースビーズを細胞抽出物と共に摂氏4度で1~3時間、穏やかな混合でインキュベートします。インキュベーション後、400gで400gで4度で1分間の遠心分離によりビーズをペレット化し、ウェスタンブロット分析のために上清の20マイクロリットルを回収した。残りの上清を捨て、4ミリリットルのイソウォッシュバッファーで再懸濁してビーズを洗います。もう一度ビーズをペレットにし、上清を取り除きます。原稿の指示に従って750マイクロリットルのISO洗浄バッファーでRNase Iを希釈し、FLAGアガロースビーズに添加します。穏やかな混合で摂氏4度で混合物をインキュベートし、遠心分離によってビーズをペレットします。ウェスタンブロット分析のために20マイクロリットルの上清を収集し、残りを捨てます。次に、先に述べたようにイソ洗浄緩衝液でビーズを洗浄する。次に、ビーズに溶出バッファーの375マイクロリットルを加え、1〜2時間摂氏4度で穏やかに振ることによって、親和溶出を行う。インキュベーション後、ビーズをペレット化し、ウェスタンブロット分析用の溶出の15マイクロリットルアリコートを収集する。アフィニティー溶出が進行中で、磁気ビーズ抗体の結合を行います。イソ洗浄バッファーの1ミリリットルで50マイクロリットルの磁気ビーズを洗浄することで始めます。ビーズを100マイクロリットルの共役バッファーに再懸濁し、適切な量の抗体を添加します。次いで、ビーズを室温で少なくとも10分間インキュベートする。磁気ビーズを共役バッファーで 2 回洗浄し、375 マイクロリットルの RIPiT 希釈バッファーでビーズを再懸濁します。ビーズを氷の上に保存し、免疫沈降するまで保存します。FLAGアフィニティー溶出を抗体結合型の磁気ビーズに適用し、摂氏4度で1〜2時間穏やかな混合でインキュベートする。マグネットでマグネットビーズを捕獲し、ウェスタンブロット分析のために15マイクロリットルの上清を集める。その後、ビーズをイソウォッシュバッファで7回洗浄します。透明なサンプルバッファーの100マイクロリットルに磁気ビーズを再懸濁し、10分間氷上で懸濁液をインキュベートすることにより、変性溶出を進めます。インキュベーション中に、ビーズを定期的にフリックして再中断します。マグネット上の磁気ビーズをキャプチャし、ウェスタンブロット分析のための溶出の15マイクロリットルを収集します。残りの溶出を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。RNAを抽出するには、RNaseフリー水320マイクロリットル、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール400マイクロリットルをRIPiT溶出に加えます。混合物をボルテックスし、5分間12,000gで遠心分離する。水相の350マイクロリットルを別のチューブに集めます。酢酸ナトリウム、塩化マグネシウム、グリコーゲン、エタノールを採取したサンプルに加え、一晩マイナス20°Cでインキュベートします。翌日、12,000gで摂氏4度で30分間遠心分離してRNAをペレット化し、70%エタノールで洗浄する。エタノール洗浄後、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、またはPNKでRNAをATPなしで処理し、原稿の指示に従ってフェノールクロロホルム精製を行う。クリーンなRNAを4.5マイクロリットルのRNaseフリー水で再懸濁します。RNAの収量を定量化するために、PNKと32P標識されたATPを原稿の方向に従ってRNAに放射標識する。サイズおよび量の標準のための低範囲DNAの梯子および20から40ヌクレオチドの合成オリゴを使用する。標識したRNAを26%の尿素ポリアクリルアミドゲルで解決します。原稿の方向に従ってゲルを乾燥させ、適切な信号が検出されるまでゲルをホスホスクリーンに当てはめます。この手法は、エキソン接合複合体またはEJCの相互作用を調べるのに使用されています。RIPiT手順の各主要工程から精製されたタンパク質のウェスタンブロット分析は、精製EJCがEIF4A3とMAGOHの両方を含んでいることを示しています。陰性制御HNRNPA1は、溶出中に検出されない。RNAフットプリントシグナルの強度は、RNAタンパク質相互作用の量と相関する。より強い足跡は、RNAのEJC占有率を増加させるプロマイシンで処理された細胞に対してRIPiTを行ったときに観察される。RIPiTが有効であることを確認するには、ウェスタンブロットでIPの効率をテストすることが重要です。深いシーケンシングを進める前に、RNAの量と品質を評価することも重要です。2018年、Singhラボはこの技術を使用して、エキソン接合複合体の2つの組成的に異なるバリエーションを精製し、RNA結合パターンを同定することに成功しました。研究者が自動ラジオグラフィーでRNAフットプリントを検出することを選択した場合、すべての適切な放射線安全手順とプロトコルに従う必要があります。

identification-footprints-rnaprotein-complexes-via-rna

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

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翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々...

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

体外の能力を計測する Toeprinting の目的は、リボソームさまざまな条件の下でフォームの翻訳開始複合体に RNA を転写しました。このプロトコルは toeprinting 哺乳類の RNA のための方法を記述してキャップ依存、IRES...

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

内生的に形成された mRNA 蛋白質複合体の回復のためのタンデムの RNA 分離手順 (旅行) を説明します。具体的には、RNA 蛋白質の複合体は、生体内で架橋 polyadenylated Rna ランダムプライマー ビーズ抽出物から分離された、特定の Mrna が変更された RNA アンチセンス オリゴヌクレオチドでキャプチャされます。イムノブロット解析による蛋白質の Mrna...

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

共翻訳相互作用は、新生鎖修飾、標的化、折り畳み、およびアセンブリ経路において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、 in vivo、モデル真核生物...

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

提案するミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) のアクセシビリティを統合ヌクレオソーム密度チップ seq 解析フレームワークに適したシーケンス データセットの生成 (チップ seq) 方法論をシーケンス変更されたネイティブ...

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

学ぶRIPiT-Seq法によるRNAタンパク質複合体の足跡同定技術。2段階の免疫沈殿で組成特異的複合体を精製し、哺乳類細胞におけるRNA結合タンパク質の機能解析と疾患関連研究に活用できます。

ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq)

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