アラビドプシス二重受精における精子核形態をたどる受精状態の評価

このプロトコルは、シロイヌナズナの二重受精における特定の因子の関与を評価する方法を提供する。受精状態は精子核の形態によって一目で判断できるため、統計解析のためのデータの迅速な取得が可能です。この方法は、シロイヌナズナの受精表現型の評価に特有である。

たとえシロイヌナズナズナディスであっても、未知の受精調節因子がまだあります。この方法は、将来の未知の受精因子の機能分析に有用であろう。排卵の迅速かつ無傷の処理のスキルを習得することは、この分析の成功のために重要です。

まず、シロイヌナズナズナを成長室で16時間の光と8時間の暗いサイクルの下で摂氏22度で成長させます。軸芽の開発を促進するためにはさみで最初に開発された花の茎をカットして削除します。最初の茎を切断した2〜3週間後、植物の高さを測定します。

高さが25センチを超える植物は、活発に成長している植物と考えられ、分析に適しています。魅了するには、ステージ11で芽を探し、上部に花びらのビットが見られます。花芽のセパル、花びら、およびスタメンを除去するために数5鉗子を使用してください。

浸透してから15~18時間後、フィラメントを鉗子でつまんでステージ13でHTR10-mRFP花の背景を持つDMP9ノックダウンラインのスタメンを取ります。受粉するには、魅惑的なピスティルの汚名を消し香のアンテルで数回軽くたたきます。受粉から7〜8時間後、うまいを集め、両面テープに貼ります。

次に、鉗子で軽く押して、テープのピスティルを固定します。解剖顕微鏡の下で、注射針を用いて卵巣の上端と下端を切り落とす。注射針の先端を動かして、再プラムの両側に沿って卵巣壁をスリットします。

真菌と伝達路を分離しないように慎重にカットします。卵巣の壁をエバート。排卵が接続されている中隔の基部をつまみ、鉗子で慎重に持ち上げます。

卵をスライドガラスの水滴に移し、蛍光顕微鏡で観察するためにカバーグラスで軽く覆います。蛍光フィルターキューブを搭載した蛍光顕微鏡で、対物レンズを20倍または40倍に調整します。mRFPで標識された精子核を含む排卵の画像を取得する。

胚嚢中のmRFP標識された精子核の数を確認する。胚嚢中の各mRFP標識された精子核の形状と位置を確認する。本研究では、受精性のフェノタイプを排卵中の精子核信号形態によって判断した。

ほとんどの排卵体は、卵細胞ミクロピラー側および中央細胞チャラザル末端側に2つの縮合mRFP標識精子核を含んでいた。これは二重受精の成功を示す。また、中央細胞核に縮合mRFP標識精子核を含む排卵と、卵細胞外の縮合したmRFP標識精子核を含有する排卵が観察され、単一受精を示す。

二重受精に失敗した場合、2つの凝縮されたmRFP標識精子核が卵細胞と中央細胞の境界で観察された。HTR10-mRFP花粉を背景とするDMP9-ノックダウンラインを用いた解析では、単一の凝縮されたmRFP標識精子核または3つ以上のmRFP標識精子核を含む排卵はほとんど観察されなかった。女性マーカーラインを使用して組み合わせることで、より正確な受精状態を分析することができます。

例えば、アテ融合後とカルヨガの前の受精状態を判断することができる。はい、受精プロセスはいくつかのステップに分かれています。この改善された方法で、どのステップに答えることができるか、各受精調節器が関与する質問。

それは植物の性的生殖に関するより深い洞察を提供するだろう。