Name: アラビドプシス二重受精における精子核形態をたどる受精状態の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: 学ぶ、アラビドプシスの二重受精における精子核形態を用いた受精状態評価法。蛍光顕微鏡で精子核を観察し、統計解析のための迅速なデータ収集を可能にします。未知の受精調節因子の機能解析に有用です。

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本研究は、日本学術振興会(JP17H05832 to T.I.)の支援を受け、千葉大学植物化学植物分子科学戦略優先研究推進プログラムの助成を受けました。

1. 人工受粉
注:プロセスを開始する前に、5番鉗子のペアが必要です。
<ol><li>成長室で16時間/8-hの暗いサイクルの下で22 °CでA.タリアナ(Col-0)を成長させる。 注:軸芽の開発を促進するために、ハサミで最初に開発された花の茎をカットし、削除します。活発に成長する植物(最初の茎の切断後2〜3週間、植物の高さ約25センチメートル)は、分析に適しています。</li>
	<li>エミュレートするには、第5鉗子を使用して、ステージ11 8(図1A)で花芽のセパル(図1B)、花びら(図1C)、およびスタメン(図1D)を取り除きます。上部に見られる花びらのビットを持つ芽が最適です。 注:適切な女性のゲームマーカーラインを使用してください。このプロトコルでは、野生型植物を女性の親として使用しました。</li>
	<li>15~18時間後に、鉗子でフィラメントをつまんでステージ138でDMP9KD/HTR10-mRFPの花のスタメンを取る。 </li>
	<li>受粉するには、消化された雌しべの汚名を、脱気剤で数回軽くたたきます。</li>
</ol>2. 観察のための排卵の準備
注:両面テープが付いているスライドガラス、第5の鉗子、27 Gの注入針および解剖顕微鏡は必要である。
<ol><li>受粉(HAP)の後7〜8時間、雌しべを収集し、両面テープ上に置き、その後、テープ上の雌しべを固定するために鉗子で穏やかに押します(図2A、A')。 注:雌しわのほとんどの卵管は、少なくとも1つの花粉管10 HAP9を受け取る。第1の花粉管からの精子細胞の両方またはいずれかの1つが受精に失敗した場合、第2の花粉管は受精回復システム10に起因する排卵によって引き付けられるであろう。最初の花粉管から精子核形態を分析するには、遅く10HAPまでに卵管調製を完了することをお勧めします。</li>
	<li>解剖顕微鏡下で注射針を用いて卵巣の上端と下端を切り取る(図2B,B')。</li>
	<li>注射針の先端を動かして、リプラムの両側に沿って卵巣壁をスリットする(図2C、C')。 注:中隔からの卵の分離を防ぐために注射針を浅く挿入します。</li>
	<li>注射針を使用して卵巣壁をエバート(図2D,D')。</li>
	<li>排卵が接続されている中隔の基部をつまみ、鉗子で慎重に持ち上げます(図2E)。</li>
	<li>卵管をスライドガラス上の水滴に移し、蛍光顕微鏡下で観察するためのカバーガラスで優しく覆う(図2E,E')。</li>
</ol>3. 顕微鏡検査
注:このプロトコルでは、蛍光フィルターキューブ(材料の表を参照)、デジタルカメラ、および付属のソフトウェアを備えたエピ蛍光顕微鏡を使用しました。
<ol><li>20倍または40倍の対物レンズと装備されたデジタルカメラを使用して、mRFPで標識された精子核を含む卵丘の画像を取得します。</li>
	<li>胚嚢におけるmRFP標識精子核の数を確認する。 注:2つのmRFP標識精子核を含む卵子は、統計分析のために母集団サイズに含めることができる。</li>
	<li>胚嚢内の各mRFP標識精子核の形状と位置を確認する。 注:花粉管から放出された直後に、凝縮されたmRFP標識精子核のペアが卵と中央細胞の間に局在する。例えば、カラザル側で検出された非凝縮されたmRFP標識精子核は、中央細胞受精を示す。適切な女性のガメテ膜マーカーラインを用いることによって、補足図1に示すように、精子細胞がプラスモグミー(膜融合後であるが、カルヨガミーの前)を受けているかどうかが明確に監視することができる。</li>
</ol>

<ol><li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+dialogs+in+green+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li>
<li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li>
<li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+HAP2+%28GCS1%29+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li>
<li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+gamete+membrane+protein+DMP9%2FDAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076(2018).</li>
<li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).</li>
<li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li>
<li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

HTR10-mRFPは、父方クロマチン(すなわち、精子細胞核を可視化する)を標識し、二重受精におけるダイナミクスが7に報告されている。花粉管からの放出直後に、HTR10-mRFP標識精子核は依然として凝縮されている。しかし、各精子核は、カルヨガミーで受精したメスのガメ核と合併すると凝縮され、3~4時間後にゲーム膜融合7が行われている。未受精精子細胞は、gcs1精子細胞が受精せずに逮捕される胚嚢に示すように凝縮されたままである(図3D)。通常、肥沃なHTR10-mRFPを花粉親として使用する場合、7-8 HAPでピスティル内の排卵の57.9%±17.8%(平均±s.d.;n =16ピスティル)に2つのmRFP標識精子核信号が含まれており、ほぼすべての信号(97.2%)二重受精に成功した(図3Aに同様の信号パターンが示されている)を反映して、凝縮される。 ...

開花植物は、二重受精を介して種子を生成し、ゲーム血漿膜1、2に局在するタンパク質間の相互作用によって直接制御されるプロセスである。開花植物オスのガメ、精子細胞のペアは、花粉で発症します。受粉後に成長する花粉管は、雌のゲーム、卵細胞、胚嚢で発達する中央細胞に精子細胞のペアを提供します。オスとメスのゲームが出会った後、ゲームの表面のタンパク質は、認識、付着、融合を促進し、二重受精を完了します。これまでの研究では、オスのガメテ膜タンパク質生成細胞特異的1(GCS1)/HAPLESS2(HAP2)3、4、およびGAMETE発現2(GEX2)5は、ガメ融合に関与する受精調節剤として同定され、 添付ファイルは、それぞれ。我々は最近、男性のガメテ特異的膜タンパク質、DUF679ドメイン膜タンパク質9(DMP9)を、ゲームと相互作用に関与する受精調節器として同定した。我々は、DMP9発現の減少は、A.タリアナ6における二重受精中の卵細胞受精の有意な阻害をもたらすことを見出した。
卵巣組織でさらに包まれた卵巣に埋め込まれた胚嚢に二重受精が起こるので、二重受精プロセスの状態を観察し、分析することは困難である。このため、二重受精制御のメカニズム全体を完全に理解するのを妨げる多くの不明確な点が依然として存在する。生体内条件下での二重受精中のガメテの挙動を追跡する観察技術の確立は、受精レギュレータの候補候補の機能解析に不可欠である。最近の研究では、ガメの細胞内構造が蛍光タンパク質で標識されるマーカーラインが得られた。この記事では、人工的に受粉した雌しべに由来する胚嚢で発生した二重受精を観察するための簡単で迅速なプロトコルを示す。精子細胞核マーカーラインHTR10-mRFP7を用いて、各メスの受精状態は精子核信号形態に基づいて判別することができる。受精時の精子核の形態的変化に焦点を当てた我々のプロトコルは、統計的証拠のために十分な量のデータを効率的に得ることができる。HTR10-mRFPの背景(DMP9 KD/HTR10-mRFP)を持つDMP9-ノックダウンラインを男性植物として使用し、単一の受精パターンを示した。このプロトコルは、他の受精レギュレータの機能解析にも適しています。

<table><tbody><tr><td>BX51</td><td>オリンパス</td><td></td><td>落射蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>松波ガラス</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6</sup</td></tr><tr><td>>両面テープ</td><td>ニチバン</td><td>NW-15S</td><td>15mm幅</td></tr><tr><td>DP72</td><td>オリンパス</td><td></td><td>デジタルカメラ</td></tr><tr><td>鉗子活</td><td></td><td></td><td>任意の5番鉗子が利用可能</td></tr><tr><td>成長室</td><td>ニホニカ</td><td>LPH-411PFQDT-SP</td><td></td></tr><tr><td>HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>シロイヌナズナ、エコタイプ コロンビア-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7</td></tr><tr><td>注射針</td><td>テルモ</td><td>NN-2719S</td><td>27 G</td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>松波ガラス</td><td>S9443</td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>オリンパス</td><td></td><td>解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>U-MRFPHQ</td><td>オリンパス</td><td></td><td>蛍光フィルターキューブ (励起:BP535-555、発光:BA570-625、二色ミラー:DM565)</td></tr><tr><td>UPlanFL N 40x</td><td>オリンパス</td><td></td><td>対物レンズ (NA 1.3)、油浸</td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x</td><td>オリンパス</td><td></td><td>対物レンズ (NA 0.75)、ドライ</td></tr></tbody></table>

アラビドプシス二重受精における精子核形態をたどる受精状態の評価

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

開花植物は、「二重受精」と呼ばれるユニークな性的再生システムを持っており、それぞれの精子細胞が卵細胞または中央細胞と正確に融合します。したがって、2つの独立した受精イベントがほぼ同時に起こる。受精卵細胞と中枢細胞はそれぞれザイゴットとエンドスパームに発達する。したがって、二重受精の正確な制御は、その後の種子開発のために不可欠です。二重受精は、深く隠され、厚い卵巣および卵巣組織で覆われている女性のゲームトフィート(胚嚢)で起こる。この雌しべ組織構造は、二重受精の観察と分析を非常に困難にし、二重受精のメカニズムに関する多くの疑問が未解決のままである現状を作成しました。受精レギュレータ候補の機能評価には、受精の見型分析が重要である。アラビドプシス・タリアナにおける受精の完了を判断するために、精子核を標識する蛍光シグナルの形状が指標として用いられる。受精に失敗した精子細胞は、メスのゲーテの外側に凝縮された蛍光信号によって示されるのに対し、正常に受精する精子細胞は、女性のゲーテの核を持つカルヨガミーによる凝縮信号によって示される。ここで説明する方法は、生体内条件下での受精の成功または失敗を決定するツールを提供する。

DMP9KD/HTR10-mRFPで受粉した雌ししから卵黄を7-8 HAPで採取し、観察した。 
ほとんどの卵子は、卵子細胞(マイクロパイラー側)と中心細胞(カラザル側)核位置に2つの凝縮されたmRFP標識精子核を含み、それぞれ(図3A)、二重受精に成功したことを示す。さらに、中央細胞核に非凝縮されたmRFP標識精子核を含む卵子と卵子細胞外の凝縮されたmRFP標識精子核(図3B)が観察され、単一受精を示した。二重受精に失敗した場合、gcs1変異精子細胞(図3D)3、4のように、卵細胞と中心細胞の境界で2つの凝縮されたmRFP標識精子核が観察された(図3C)。<...

アラビドプシス二重受精における精子核形態に基づいて成功または失敗した受精を決定する方法をエピ蛍光顕微鏡で示す。

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

このプロトコルは、シロイヌナズナの二重受精における特定の因子の関与を評価する方法を提供する。受精状態は精子核の形態によって一目で判断できるため、統計解析のためのデータの迅速な取得が可能です。この方法は、シロイヌナズナの受精表現型の評価に特有である。たとえシロイヌナズナズナディスであっても、未知の受精調節因子がまだあります。この方法は、将来の未知の受精因子の機能分析に有用であろう。排卵の迅速かつ無傷の処理のスキルを習得することは、この分析の成功のために重要です。まず、シロイヌナズナズナを成長室で16時間の光と8時間の暗いサイクルの下で摂氏22度で成長させます。軸芽の開発を促進するためにはさみで最初に開発された花の茎をカットして削除します。最初の茎を切断した2〜3週間後、植物の高さを測定します。高さが25センチを超える植物は、活発に成長している植物と考えられ、分析に適しています。魅了するには、ステージ11で芽を探し、上部に花びらのビットが見られます。花芽のセパル、花びら、およびスタメンを除去するために数5鉗子を使用してください。浸透してから15~18時間後、フィラメントを鉗子でつまんでステージ13でHTR10-mRFP花の背景を持つDMP9ノックダウンラインのスタメンを取ります。受粉するには、魅惑的なピスティルの汚名を消し香のアンテルで数回軽くたたきます。受粉から7〜8時間後、うまいを集め、両面テープに貼ります。次に、鉗子で軽く押して、テープのピスティルを固定します。解剖顕微鏡の下で、注射針を用いて卵巣の上端と下端を切り落とす。注射針の先端を動かして、再プラムの両側に沿って卵巣壁をスリットします。真菌と伝達路を分離しないように慎重にカットします。卵巣の壁をエバート。排卵が接続されている中隔の基部をつまみ、鉗子で慎重に持ち上げます。卵をスライドガラスの水滴に移し、蛍光顕微鏡で観察するためにカバーグラスで軽く覆います。蛍光フィルターキューブを搭載した蛍光顕微鏡で、対物レンズを20倍または40倍に調整します。mRFPで標識された精子核を含む排卵の画像を取得する。胚嚢中のmRFP標識された精子核の数を確認する。胚嚢中の各mRFP標識された精子核の形状と位置を確認する。本研究では、受精性のフェノタイプを排卵中の精子核信号形態によって判断した。ほとんどの排卵体は、卵細胞ミクロピラー側および中央細胞チャラザル末端側に2つの縮合mRFP標識精子核を含んでいた。これは二重受精の成功を示す。また、中央細胞核に縮合mRFP標識精子核を含む排卵と、卵細胞外の縮合したmRFP標識精子核を含有する排卵が観察され、単一受精を示す。二重受精に失敗した場合、2つの凝縮されたmRFP標識精子核が卵細胞と中央細胞の境界で観察された。HTR10-mRFP花粉を背景とするDMP9-ノックダウンラインを用いた解析では、単一の凝縮されたmRFP標識精子核または3つ以上のmRFP標識精子核を含む排卵はほとんど観察されなかった。女性マーカーラインを使用して組み合わせることで、より正確な受精状態を分析することができます。例えば、アテ融合後とカルヨガの前の受精状態を判断することができる。はい、受精プロセスはいくつかのステップに分かれています。この改善された方法で、どのステップに答えることができるか、各受精調節器が関与する質問。それは植物の性的生殖に関するより深い洞察を提供するだろう。

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