Name: コキサッキーウイルスA16に対する抗ウイルス候補の同定のためのウイルスエントリーアッセイと分子ドッキング解析の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 学ぶ コキサッキーウイルスA16に対する抗ウイルス候補の同定法。ウイルスエントリーアッセイと分子ドッキング解析を用いて、小分子里化合物の作用機序を評価し、創薬研究の枠組みを提供します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、テキサス大学オースティン校のジョシュア・ベッカム博士に、分子ドッキングによる技術サポートに感謝しています。この研究は、台湾科学技術省(MOST107-2320-B-037-002からC.J.L.およびL.T.L.への資金提供によって部分的に支援されました。MOST106-2320-B-021およびMOST107-2320-B-038-034-MY3からL.T.L.へ)。

注:すべての細胞培養およびウイルス感染は、取り扱うサンプルのバイオセーフティレベルに適した認定バイオセーフティフードで行う必要があります。CVA16感染9を効率的に遮断することが観察された小分子ケブラギン酸(CHLA)とプニカラギン(PUG)の2つのタンニンクラスは、候補阻害剤の例として用いられる。ウイルス学技術における基本原理、ウイルス伝播、ウイルス力確定、およびプラーク形成単位(PFU)または感染の多重性(MOI)の概念について、読者は参照参照10と呼ばれる。
1. 細胞培養、ウイルス製剤、化合物製剤、化合物細胞毒性
<ol><li>ヒト横紋筋肉腫(RD)細胞は、CVA16感染11に寛容な宿主細胞である。10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)の10mLでRD細胞を成長させ、200 U/mLペニシリンG、 200 μg/mLストレプトマイシン、およびT-75フラスコ中の0.5 μg/mLアンポテリシンBを5%CO2インキュベーターで37°Cで使用します。</li>
	<li>RD細胞にウイルスを伝播してCVA16を調べ、PFU/mLでウイルスのチターを決定する。最適化されたプロトコルについては、リファレンス11を参照してください。</li>
	<li>各溶媒を使用して試験化合物およびコントロールを調融する:例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)にCHLAおよびPUGを溶解する。すべての感染ステップについて、基底培地はDMEMプラス2%FBSおよび抗生物質からなる。 注:試験化合物処理におけるDMSOの最終的な濃度は、実験で0.25%以下である。0.25%DMSOは、比較のためのアッセイに陰性対照治療として含まれる。</li>
	<li>XTTなどの細胞生存率判定試薬を用いてRD細胞上の試験化合物の細胞毒性アッセイを行う((2,3-bis-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-フェニルアミノ)-カルボニル-2H-テトラゾリウムヒドロキシド)詳細なプロトコルについては、リファレンス12を参照してください。製造元のプロトコルに従って GraphPad プリズムなどの分析ソフトウェアを使用して、試験化合物の細胞毒性濃度を決定します。細胞生存率に有意に影響を与えない薬物濃度(≥95%生存細胞)は、研究の残りの部分に使用される。</li>
</ol>2. 薬剤添加アッセイの時間
<ol><li>
ウイルス感染前の宿主細胞に対する薬物の影響を評価する(前処理)
	<ol>
<li>2 x 105細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を得た。</li>
		<li>RD細胞を非細胞傷害性濃度(ステップ1.4から決定)で1時間または4時間の基底媒体容積の1mLで治療する。</li>
		<li>1-2 mLのPBSで細胞を洗浄してから、基底媒体に50 PFU/ウェルのウイルスを加え(接種の最終体積は300μL)、1時間ごとにプレートを15分ごとにロックします。</li>
		<li>感染後、PBSを用いて単層を再度洗浄し、0.8%メチルセルロースを含む基底媒体の1mLをオーバーレイし、5%CO2インキュベーターで37°Cでさらにインキュベーションを行う。</li>
		<li>インキュベーションの72時間後、オーバーレイ培温を取り外し、PBSの2 mLを使用してウェルを洗浄します。</li>
		<li>37%ホルムアルデヒドの0.5 mLを使用して15分間ウェルを固定します。</li>
		<li>上清を取り出し、PBSを使用して再び洗浄します。</li>
		<li>0.5%結晶紫色溶液の0.5 mLを使用して井戸を汚します。その後、2分以内に汚れ溶液を除去し、空気乾燥前に水の穏やかな流れで井戸を洗浄します。</li>
		<li>ホワイトライトボックスにプレートを置くことによって、ウイルスプラークを数えます。パーセント (%)CVA16感染は以下の通り:(プラークウイルス+薬物の平均#/プラークウイルス+DMSO制御の平均#)×100%。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
薬物とウイルスを同時に添加する効果を評価する(共添加)
	<ol>
<li>2 x 105細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を得た。</li>
		<li>RD細胞を適当な濃度で試験化合物で処理し、CVA16の50 PFU/ウェル(接種の最終体積は300μL)を1時間毎にプレートを1時間ロックします。</li>
		<li>1 mLのPBSで細胞を洗浄し、0.8%メチルセルロースを含む基底媒体の1-2 mLでオーバーレイし、5%CO2インキュベーターで37°Cでさらにインキュベーションを行います。</li>
		<li>感染後72時間後に結晶紫色でウイルスプラークを染色し、上述したようにCVA16感染率を決定する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ウイルス感染後の薬物治療効果を評価する(感染後)
	<ol>
<li>2 x 105細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を得た。</li>
		<li>CVA16の50 PFU/ウェル(接種の最終体積は300μL)でRD細胞を1時間毎にプレートをロックします。</li>
		<li>PBSの1-2 mLでウェルを洗浄し、0.8%のメチルセルロースと適切な濃度の試験化合物を含む基底媒体で細胞をオーバーレイします。</li>
		<li>結晶バイオレットでウイルスプラークを染色し、72時間後の感染後にカウントし、上記の%CVA16感染インキュベーションを決定する。 注:細胞を持ち上げないように、すべてのPBS洗いを穏やかに行います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. フローサイトメトリーベースのバインディングアッセイ
<ol><li>2 x 105細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を達成する。</li>
	<li>細胞単層を4°Cで1時間予冷します。</li>
	<li>4°Cで3時間の試験化合物の有無にCVA16(MOI=100)でRD細胞に感染する。 注:氷上のウイルス接種と4°C冷蔵庫でのインキュベーションを行い、4°Cの温度を維持し、ウイルス結合を可能にするが、入り口は認めません。</li>
	<li>ウイルスの接種を取り除き、1-2 mLの氷冷PBSで一度洗います。</li>
	<li>氷上の井戸に1 mLの氷冷解離バッファーを3分間加えて、細胞を集集め、氷冷流サイトメトリーバッファー(1x PBS+2%FBS)で再懸濁して細胞を持ち上げます。</li>
	<li>氷冷流サイトメトリーバッファーを用いて細胞を2回洗浄し、0.5mLの4%パラホルムアルデヒドで20分間氷上で固定する。</li>
	<li>PBSを使用して細胞を洗浄して、結合されていないウイルスまたは弱結合ウイルスを除去し、その後、抗VP1抗体の1 mL(1:2,000;3%BSAを含むPBSで希釈)で細胞を1時間氷上に染色し、続いてセカンダリAlexa 488結合抗マウスIgG(1:250)でインキュベーションを行います。1時間氷上に3%BSAを含むPBSで希釈し、各抗体処理後にPBS洗い(3回)を行う。</li>
	<li>氷冷流サイトメトリーバッファーの0.5 mLで細胞を再中断し、標準的な手順を使用してフローサイトメータ上のフローサイトメトリー分析を実行します。関連するソフトウェアを使用してヒストグラムにデータを表示し、棒グラフ表現の定量を行います。</li>
</ol>4. ウイルス不活性化アッセイ
<ol><li>
前述の12のように、次の条件を使用してウイルス不活性化アッセイを実行します。 - CVA16の開始濃度106 PFU/mL。 - 2 x 105細胞/ウェルの播種密度から12ウェルプレート中のRD細胞単層。 - 50倍の希釈を行い、薬物化合物を活性化させ、最終的なウイルス濃度を50PFU/ウェルにする。 - PBSの1-2 mLを使用してステップを洗浄します。 - 0.8%のメチルセルロースを含むオーバーレイ培った培養剤。</li>
	<li>上記で詳述したように、ウイルスプラーク手順の結晶紫色染色を用いてウイルス感染の最終読み出しを行う。</li>
</ol>5. 分子ドッキング解析
<ol><li>PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)から試験化合物の3D分子をダウンロードします。分子に3D構造がアップロードされていない場合は、2D構造をダウンロードするか、SMILES弦配列を使用して分子プログラム(例えばCORINA)を介して3D分子に変換します。</li>
	<li>RCSBタンパク質データバンク(https://www.rcsb.org/)からウイルス生物学的組み立てユニットをダウンロードし、バイオコンピューティングプログラム(例えばUCSFキメラ)を使用してウイルス構造モデルを調作する。例えば、CVA16成熟ビリオン結晶構造(PDB:5C4W)3の場合、PDBファイルから溶媒を削除し、Dunbrach 2010ロタマーライブラリーのデータを使用して不完全なサイドチェーンを置き換え、水素と料金を構造に追加します。以前に報告された13.ドッキングターゲットは、生物学的アセンブリ情報(タンパク質データバンク)を用いた意図された分析に関連する任意のウイルスタンパク質でありうたえられる。</li>
	<li>
例えばUCSFキメラを使用して調製されたウイルスユニットに化合物をドッキングし、ビジュアライゼーションソフトウェア(例えば、オートドックVina、PyMol)で出力ファイルを分析します。
	<ol>
<li>「リガンド」としてUCSFキメラにテスト化合物ファイルをアップロードし、「受容体」として準備されたウイルスタンパク質全体を選択してブラインドドッキングを実行します。コンピュータのマウスまたはトラックパッドを使用して、検索ボリューム全体の「受容体」のサイズを変更します。[詳細オプション] で、バインド モードの数を最大に設定します。ドッキング フレームは、最高から最低の結合エネルギーに自動的にランク付けされます。</li>
		<li>(オプション)さらにブラインドドッキングに関して、マウスまたはトラックパッドを再び使用してブラインドドッキング結果に由来する目的の領域のウイルスタンパク質にドッキング部位を閉じ込め、検索量を減らす(例えば、100Å x 100Å x 100Å)。この手順は、ブラインドドッキングの結果を確認するのに役立ち、特異性を高めるのに役立ちます。</li>
		<li>分子グラフィックスシステム(例えば、PyMol)を使用して、ドッキングファイルをアップロードしてバインディングモードの位置を分析します。「リガンド」を選択し、「任意の原子に」オプションで極性接触を識別することにより、化合物からウイルスタンパク質への極性接触を見つけます。結果を調べます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li>
<li>Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A16+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity%3A+implications+for+particle+expansion%2C+receptor+binding%2C+and+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7%2C+A14%2C+and+A16+and+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187(2013).</li>
<li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes & Infections. 7, 162(2018).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+Virology%22">Principles of Virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Velu, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BPR-3P0128+inhibits+RNA-dependent+RNA+polymerase+elongation+and+VPg+uridylylation+activities+of+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71.</a> Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124(2015).</li>
<li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOCK+6%3A+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes & Infections. 6, 65(2017).</li>
<li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWISS-MODEL%3A+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li>
</ol>

著者らは、利益相反がないと宣言している。

本報告では、特に非エンベロープCVA16に対して、ウイルスエントリを標的とする抗ウイルス候補の同定に有用なプロトコルについて説明した。アッセイは、ウイルスの侵入中に初期の事象を解剖する方法で設計されており、試験剤の抗ウイルス活性の作用と潜在的な標的のメカニズムを明らかにするのに役立ちます。「薬物添加アッセイ」は、例えば、未感染の宿主細胞(前処理分析)、ウイルス粒子または宿主細胞表面との相互作用(共添加分析)など、試験化合物の潜在的な標的を広く決定することを可能にする。)、またはウイルス複製段階(感染後分析)中にウイルスに感染した宿主細胞。このアッセイ単独では、このプロトコルに記載された後続のアッセイ(例えば、ウイルス不活性化アッセイおよび結合分析)につながる化合物からの相互作用の方法を決定することができる。洗浄工程は、検査された治療方法が分析された方法に固有であることを確認するために重要です。「フローサイトメトリーベースの結合アッセイ」の使用は、宿主細胞へのウイルス結合に対する化合物の影響を評価するのに役立つ。この温度はウイルス結合を可能にするが、エントリを可能にしないので、4 °Cで実験の温度を維持することは、細胞表面上のビリオンの最...

手、足、口の病気(HFMD)は、幼児におけるコクサッキーウイルスA16(CVA16)およびエンテロウイルス71(EV71)によって最も一般的に引き起こされる疾患である。最近、アジア太平洋地域では、CVA16誘発HFMDが著しい上昇を見せております。症状は軽度であり、脳と心臓に影響を与える重篤な合併症が起こり、潜在的な死亡事故は1、2である。現在のところ、CVA16に対して認可された抗ウイルス療法やワクチン接種は存在しないため、将来の流行とそれに関連する合併症を抑制するための抗ウイルス戦略を開発する必要があります。
CVA16は、それぞれVP1、VP2、VP3、およびVP4という4つの構造タンパク質を含むペンタマーから組み立てられたイコサヘドラルドカプシドを持つ非エンベロープウイルスです。ペンタマーの各5倍軸を囲むは、うつ病として示す「キャニオン」領域であり、受容体結合3におけるその役割で知られている。この渓谷の底部には、スフィンゴシン(SPH)という名前の天然脂肪リガンドを含むVP1領域に疎水性ポケットがあります。ヒトPセレクチン糖タンパク質リガンド1(PSGL-1)およびスカベンジャー受容体クラスB部材2(SCARB2)などの細胞受容体は、このリガンドを置換することによりウイルス結合の役割を果たさなことが示唆されており、その結果、カプシドおよびコプレジドに対する立体構造変化をもたらす。宿主細胞4、5、6へのウイルスゲノムのその後の排出。ウイルス入力プロセスにおける連続的な事象をブロックする可能性のある阻害剤を同定することは、CVA16感染に対する潜在的な治療戦略を提供する可能性がある。
ウイルスライフサイクルのステップは、モード特異的抗ウイルス剤の同定に役立つ標的として実験的アプローチを通じて解剖することができる。薬物添加分析では、ウイルス感染の前に(ウイルス感染前に追加)、エントリー(ウイルス感染に同時に追加)、およびポストエントリー(以下に追加される)を含む、ウイルス感染中の異なる時期における薬物治療効果を調べる。ウイルス感染)7.その影響は、各治療条件で形成されたウイルスプラークの数を定量することにより、標準的なプラークアッセイを用いて評価することができる。フローサイトメトリーベースのウイルス結合アッセイは、薬物が宿主細胞へのウイルスの付着を防ぐかどうかを決定する。これは、ヒトウイルス感染の大部分が発生する37°Cから、ウイルスが宿主細胞表面に結合できるが細胞7に入ることができない4°Cに温度をシフトすることによって達成される。細胞膜結合ウイルス粒子は、ウイルス抗原に対する免疫染色を通じて定量化され、フローサイトメトリーによって評価される。一方、ウイルス不活性化アッセイは、遊離ウイルス粒子との薬物の潜在的な物理的相互作用を評価するのに役立ちます, バイリオンを保護または中和, またはそれらのために非アクティブにする集約や立体構造変化を引き起こす感染8、9の間に宿主細胞表面とのその後の相互作用。この実験では、ウイルス接種は、宿主細胞単層に感染し、標準的なプラークアッセイ8を行う前に薬物をチレートする前に、薬物で最初にインキュベートすることを許可する。最後に、分子ドッキングは、計算を使用して、エンベロープされたウイルスからのウイルス糖タンパク質や非エンベロープウイルスからのウイルスカプシドタンパク質を含む、ビリオン表面上の潜在的な薬物相互作用部位を予測するための強力なツールです。アルゴリズム。これは、薬物の作用モードの標的を機械的に特定し、下流アッセイによってさらに検証できる有用な情報を提供するのに役立ちます。
我々は最近、非エンベロープCVA169による感染を効率的にブロックした抗ウイルス化合物を同定するために、上記の方法を採用した。本明細書において、使用された詳細なプロトコルについて説明し、議論する。

<table><tbody><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>AL-158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-標識抗マウス IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>抗 VP1 抗体</td><td>メルク・ミリポア</td><td>MAB979</td><td>抗エンテロウイルス 71 抗体、Coxsackie A16、クローン 422-8D-4C-4D</td></tr><tr><td>ベックマン・コールター サイトメーターとの交差反応</td><td>ベックマン・コール</td><td>ターFC500</td><td></td></tr>コ<tr><td>リーナ</td><td>・モレキュラー・ネットワークスGmbH</td><td></td><td></td></tr>クリスタル<tr><td>バイオレット</td><td>シグマ</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr>ホル<tr><td>ムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>ΣH3393</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体外毒性試験キット、XTTベース</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td></td><td>Σ M0512-100G</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PyMol</td><td>Schr&ouml;ディンガーUCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キメラ</td><td>カリフォルニア大学サンフランシスコ</td><td></td><td></td>校</tr></tbody></table>

コキサッキーウイルスa16に対する抗ウイルス候補の同定のためのウイルスエントリーアッセイと分子ドッキング解析の使用

Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

機械的にウイルスの入り口を調べる抗ウイルスアッセイは、評価された薬剤が最も効果的であるステップを識別するのに関連し、候補ウイルスエントリー阻害剤の同定を可能にする。ここでは、ウイルス粒子または初期のウイルス侵入における特定のステップを標的にすることにより、非エンベロープコクサッキーウイルスA16(CVA16)による感染を遮断することができる低分子の同定のための実験的アプローチを提示する。アッセイには、薬物添加分析の時間、フローサイトメトリーベースのウイルス結合アッセイ、およびウイルス不活性化アッセイが含まれる。また、ウイルスカプシドタンパク質を利用して、抗ウイルス化合物の標的となる潜在的な残留物を予測する分子ドッキングプロトコルを提示する。これらのアッセイは、ウイルスの侵入に作用する候補抗ウイルス剤の同定に役立つはずだ。将来の方向性は、さらなる薬剤開発のためのこれらの可能な阻害剤を探索することができます。

時間増量アッセイは図1に示され、CVA16感染に対する低分子CHLAおよびPUGを用いた治療からの影響を示す前ウイルス入力(前処理)、ウイルス入力中(共添加)、またはウイルス後のエントリー(感染後)。いずれの低分子も、ウイルス感染前の宿主細胞の前処理(図1A)または感染後治療(図1C)において、CVA16感染性に対する限界的な影響のみを生じさせた。対照的に、CHLAおよびPUGは、共添加治療においてCVA16感染を&gt;80%によって効率的に損なった(図1B)。したがって、これらの観察は、2つの化合物が感染中に宿主細胞表面にウイルス粒子と同時に存在する場合に最も効果的であることを示唆している。
<strong cl...

プロトコルの目的は、候補ウイルスエントリ阻害剤を同定するために使用することができるウイルスエントリに関連する異なるアッセイを説明することです。

コキサッキーウイルスA16に対する抗ウイルス候補の同定のためのウイルスエントリーアッセイと分子ドッキング解析の使用

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

このプロトコルは、メカニズム主導のアプローチを通じて潜在的な抗ウイルス小分子の発見を助けることができる。加算アッセイの時点では、その低分子が抗ウイルス活性を示す感染のステップを決定する。分子ドッキングは、小分子とウイルスタンパク質の相互作用を予測します。ウイルス感染前の宿主細胞に対する薬物の影響を評価するために、RD細胞を12ウェルプレートに2倍10~5番目の細胞で播種した。一晩で5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。翌朝、RD単層の各ウェルを目的とする試験化合物で、三重化で、1ミリリットルの基底培地中の非毒性濃度で1〜4時間治療する。治療インキュベーションの最後に、PBSの1ミリリットルで細胞を洗浄してから、1時間あたり300マイクロリットルの基底培地に50個のプラーク形成単位のウイルスを加え、15分ごとに揺れ動かします。感染インキュベーションの終わりに、PBSで細胞を洗浄し、0.8%メチルセルロースを含む新鮮な基礎培地の1ミリリットルで細胞をオーバーレイします。細胞培養インキュベーターで72時間後、PBSを2ミリリットルでそれぞれよく洗い、15分間37%ホルムアルデヒドの0.5ミリリットルで細胞を固定します。固定の終わりに、PBSでウェルを洗浄し、ウェルあたり0.5%クリスタルバイオレット溶液の0.5ミリリットルで細胞を汚します。2分後、井戸を穏やかな水で洗い、プレートを空気乾燥させます。次に、プレートを数えるために白いライトボックスに置き、式に従ってコクサッキーウイルス感染細胞の割合を計算します。分子ドッキング解析では、PubChemから試験化合物の3D分子をダウンロードしてください。分子にアップロードされた3D構造がない場合は、2D構造をダウンロードするか、またはSMILE文字列シーケンスを使用して、適切な分子プログラムを介して構造を3D分子に変換します。次に、RCSBタンパク質データバンクからウイルス生物学的組み立てユニットをダウンロードします。適切なバイオコンピューティングプログラムを使用して、タンパク質データバンクファイルから溶媒を削除し、Dunbrack 2010ロタマーライブラリからのデータを使用して不完全な側鎖を交換し、前述のように水素と電荷を構造に追加します。テスト化合物を準備されたウイルスユニットにドッキングするには、テスト化合物ファイルをリガンドとしてカリフォルニア大学サンフランシスコキメラ校にアップロードし、ブラインドドッキングを行う受容体として調製されたウイルスタンパク質全体を選択します。追加のドッキングの場合、さらに検索量を減らすことによって、ブラインドドッキング結果から得られる対象領域にドッキング部位をウイルスタンパク質に閉じ込めます。次に、ドッキングファイルを適切な分子グラフィックスシステムにアップロードして、結合モードの位置を分析します。リガンドを選択して化合物からウイルスタンパク質への極性接触を見つけ、任意の原子に対する極性接触を識別します。この代表的な実験で試験された小分子の両方は、ウイルス感染前の宿主細胞の前処理でも感染後の治療においても、コクサッキーウイルスA16感染に対する限界的な影響のみを生み出した。対照的に、分子は共加処理において80%を超えて効率的に感染を除去し、感染時に宿主細胞表面にウイルス粒子と同時に存在する場合に2つの化合物が最も効果的であることを示唆している。フローサイトメトリーに基づく結合分析は、2つのタンニンが宿主細胞へのウイルス粒子結合を防止することによってコクサッキーウイルスA16感染性エントリーを予防したことを確認する。タンニンの分子ドッキングは、両方ともコクサッキーウイルスペンタマーの峡谷領域で結合すると予測されていることを示し、ポケットファクターを保持し、コクサッキーウイルスの結合および宿主細胞への侵入を仲介する上に重要な役割を果たす。これらの表面投影では、2つのタンニンの間で共通のアスパラギン-85、リジン-257、およびアスパラギン-417で、ポケット入り口の周りの小分子の極性接点から予測されるユニークな残基が観察される。分子ドッキングの場合、結合フレームをランク付けする際にウイルスタンパク質のトポロジーを考慮する必要があります。追加の実験には、組み換えウイルスに対する化合物の抗ウイルス活性のテストが含まれ、薬物の有効性に対する重要性を検証するために発見されたアミノ酸の突然変異が含まれる。

use-viral-entry-assays-molecular-docking-analysis-for-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、抗ウイルス剤がウイルス粒子に与える影響の評価を示す、ウイルス不活化アッセイを示しています。...

ウイルス不活化アッセイによる抗ウイルス試験化合物の有効性の評価

このビデオでは、抗ウイルス化合物をスクリーニングするためのウイルス付着アッセイを実演しています。遺伝子組み換えC型肝炎ウイルスとルシフェラーゼを用いて、ウイルス単独のウェルと比較して、共治療したウェルの光強度が低いことからわかるように、ウイルス付着に対する阻害効果を評価します。...

抗ウイルス化合物のスクリーニングのためのウイルス付着アッセイ

このビデオは、ウイルスが宿主細胞に侵入し、エンドソームと融合する特定のステップを標的とする抗ウイルス剤を評価するためのアッセイを示しています。細胞を低温でインキュベートした後、HCVに感染させます。低温は宿主細胞へのウイルスの結合を可能にしますが、エンドサイトーシスによる内在化を阻害します。試験用抗ウイルス化合物を添加し、細胞を生理的温度でインキュベートします。この高温へのシフトにより、ウイルスの侵入が容易になり、エンドソームとのウイルスエンベロープ融合に対する試験化合物の影響を評価できます。...

宿主細胞へのウイルス侵入と融合に対する被験化合物の影響を評価するためのアッセイ

細胞変性効果（CPE）ベースのアッセイ、用量応答アッセイとTime-of-付加（TOA）アッセイを含む3つのアッセイは、同様に、開発され最適化され、検証され、ブルータングウイルスに対する新規な抗ウイルス（BTV）を識別するために利用されている新たに同定された抗ウイルス薬のための可能な作用機序（MOA）を決定するように。...

タングウイルスに対する新規抗ウイルス剤の同定のためのアッセイ

ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて大きくルシフェラーゼまたは生物発光が可能な他の酵素を発現する組換えRNAウイルスの開発により改善されてきた。ここでは、詳細な化学ライブラリーから広域スペクトルの抗ウイルス剤を単離するために麻疹およびチクングニアウイルスのような組換え菌株を組み合わせたハイスループットスクリーニングパイプライン。...

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

ここでは、新規抗ウイルス剤を特定し評価するために、ウイルス侵入の特定のステップを調べるプロトコルを提示します。...

抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

アリーナウイルスのライフサイクルの最初のステップは、ウイルス粒子の宿主細胞への付着です。アリーナウイルス付着イベントの超高感度検出と定量のための定量的(q)RT-PCRベースのアッセイを報告します。...

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

アルボ ウイルス複製とアルボ ウイルス複製を制限する 2) 真核生物の宿主因子を促進する免疫調整物質 1) ウイルス エンコードを識別するためにプロトコルを紹介します。これら蛍光や発光を用いる方法は、急速に量的な読み出し信号対雑音比の低い単純なアッセイのアルボ...

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

ウイルス性ポリタンパク質に埋め込まれた相同な宿主病原体タンパク質配列(SSHHPS)の短いストレッチを同定するための一般的なプロトコルを提示する。SSHHPSはウイルスプロテアーゼによって認識され、いくつかのグループIVウイルスによって特定の宿主タンパク質の標的破壊を指示する。...

インビトロ法とインシリコ法を用いた第IV族ウイルスSSHHPSの解析

本プロトコルは、HA、S糖タンパク質、関連するハイブリッド型グリカン、および高マンノースオリゴ糖へのCV-N結合を調べるためのSPR結合アッセイのための新しいツールについて説明しています。SPRは、これらのグリカンに二量体または単量体CV-Nのいずれかを結合するためのKD...

表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング

本記事では、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いてSARS-CoV-2疑似型粒子を生成する方法論と、それを用いたエントリー阻害剤の同定について説明しています。これらのプロトコルは、組換えヒトACE2-Fc融合タンパク質と小分子化合物アルビドールという2種類のエントリー阻害剤を用いて実証されています。...

MLVベースの偽ウイルスを用いたSARS-CoV-2侵入阻害薬の潜在的な抗ウイルス薬同定の手順

学ぶ コキサッキーウイルスA16に対する抗ウイルス候補の同定法。ウイルスエントリーアッセイと分子ドッキング解析を用いて、小分子里化合物の作用機序を評価し、創薬研究の枠組みを提供します。

コキサッキーウイルスA16に対する抗ウイルス候補の同定のためのウイルスエントリーアッセイと分子ドッキング解析の使用

さらに動画を探す