Name: 紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 学ぶマウス眼表面細胞におけるUV-C損傷に対する活性酸素種と細胞生存率の同時検出法。DCFDA、プロピジウムヨウ化物、Hoechst染色を用いて酸化ストレスと細胞死を可視化し、眼研究における細胞動態の理解を深める。

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著者らは、インフラ施設に対するイェネポヤ研究センター、イェネポヤ(大学とみなされる)からの支援を認めている。

実験は、スイスのアルビノマウスアイに由来する一次眼細胞/幹細胞に対して行った。この実験のための目を収穫するための動物の使用は、制度動物倫理委員会、イェネポヤ(大学とみなされる)によって承認されました(IEAC承認番号、6a /19.10.2016)。
1. 試薬の調製
注: マウスの眼表面からの主細胞/幹細胞の導出は、このプロトコルの範囲を超えています。したがって、UV-C曝露量、ROSを評価するための試薬調製、生細胞および死細胞およびそれらの定量を実証する。試薬の各容積については表1を参照してください(最終染色液を得るために添加される10%ウシ胎児血清、DCFDA、ヘキストおよびプロピジウムヨウ化ストック溶液)。
<ol><li>DMSOの5.13 mLでDCFDA粉末の25 mgを溶解することにより、10 mM DCFDAのストック溶液を調製します。アリク250 μLは、アンバー色1.5mLチューブにそれぞれ250μL、-20°Cで保存します。</li>
	<li>25 mg バイアルの内容物全体を 2.5 mL の脱イオン水に溶解して、10 mg/mL (16.23 mM 溶液) Hoechst 33342 のストック溶液を調製します。アンバー色のマイクロ遠心チューブに100μLのアリコートを作り、最大6ヶ月間2〜6°Cで保管してください。長期保存のために、-20 °Cで保管してください。</li>
	<li>1 mg/mLのヨウ化プロピジウムを脱イオン水にストック液を調製し、アリコート1mLをアンバー色の1.5mLチューブにそれぞれ、4°Cで保存する。</li>
</ol>2. 細胞めっきおよびUV-C放射線処理
<ol><li>めっき前に、我々の研究室で単離されたマウスの一次眼表面細胞(未発表の結果;そのような細胞は、穏やかな細胞解離剤(材料表)を用いて角膜上皮、間質細胞および角質細胞の混合物である。</li>
	<li>プレート0.2 x 106マウスの一次眼表面細胞を35mm 0.2%基調膜マトリックスコーティングした細胞培養皿で2.5mLの完全培地。5%CO2と加湿インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートする。 注:マウス眼表面から一次細胞を培養するための完全な培地は、20%FBS、1%ペンストレップ、1%グルタマックス、1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%のピルビン酸ナトリウム、および0.1%-βメルカプトエタノールを含むDMEM高グルコースで構成されています。</li>
	<li>細胞を様々な用量のUV-Cに曝露する前に、最大量の媒体を廃棄し、薄い層の培地(約500μL)のみが細胞と接触し続け、それらを覆うのに十分です。</li>
	<li>UV-Cソース/チャンバー(ハイブリダイゼーションオーブン/UVクロスリンカーの下部室)に一度に1つずつ、皿を取ります。資料の表)。皿をチャンバーに入れ、皿の蓋を取り外します。皿の開いたふたの位置は細胞がUV-C露光の間に最大UV-C線量を受け取ること保障する。</li>
	<li>細胞をUV-Cの異なるグレード/用量に曝露する:1 J/m 2、100J/m2、1,000 J/m 2および10,000 J/m2。 </li>
	<li>UV-C露光後、すぐに各皿の蓋を交換し、UV-Cソースチャンバーからそれらを取り外します。</li>
	<li>各料理を層流フードに持ち込み、2 mLの新鮮な完全なメディアで各料理を上にします。</li>
	<li>37 °CCO2インキュベーターで3時間細胞をインキュベートする。UV-C曝露後の3時間のインキュベーションは、初期の効果を視覚化して定量化するのに最適です。</li>
</ol>3. 生細胞染色媒体の調製
<ol><li>3時間の細胞インキュベーションポストUV-C露光の最後の15分の間に新鮮な染色媒体を準備します。</li>
	<li>10% FBS-DMEMを含む染色媒体のプレウォーム10 mLは、37°Cに1%ペンストレップで補足した。</li>
	<li>10 mM DCFDA の 5 μL を追加します。5 mg/mL ヘクスト溶液の 5 μL と 200 μL の 1 mg/mL ヨウ化プロピジウム.DCFDA、Hoechst、および PI の最終濃度は、10 mL の染色媒体でそれぞれ 5 μM、5 μg/mL、20 μg/mL です。</li>
</ol>4. UV-C曝露マウス主眼球のDCFDA染色
<ol><li>UV-C曝露マウスの主眼球細胞を様々な用量で3時間インキュベートした後、培地を35mmの皿から吸引した。</li>
	<li>各皿に2mLの作製DCFDA染色媒体をそっと補って補充してください。</li>
	<li>37°CのCO2インキュベーターで暗闇の中で15分間染色培地を用いて細胞をインキュベートし、生細胞染色を行います。</li>
</ol>DCFDA(ROS)、ホーハスト細胞、PI染色細胞の観察
<ol><li>インキュベーション終了後、染色媒体を廃棄する。</li>
	<li>細胞に新鮮な完全な媒体を追加し、反転蛍光顕微鏡/細胞のイメージャー(材料のテーブル)の下で細胞を観察します。希望のフィールドを撮影: 明視野, 青色蛍光, 赤蛍光, 緑色蛍光. 注:青色蛍光染色された細胞は核であり、緑色蛍光はROS生成細胞用であり、赤色蛍光はPI陽性死細胞を示す。</li>
</ol>6. イメージング技術を用いた染色細胞(ホーチストブルー、PIデッド、グリーン-ROS)の定量化
<ol><li>反転蛍光顕微鏡/細胞イメージャーの下で撮影した画像を、定量化のためにImageJにエクスポートします。</li>
	<li>各チャンネル(すなわち、青(nuclei/Hoechst)、緑(ROS)、赤(Dead/PI陽性))を使用して、カウントのために各画像を1つずつ開きます。非露出制御から開始し、1、100、1,000、10,000 J/m-2に順次移動します。</li>
	<li>各フィールドのソフトウェアメニューで十字架としてマークされたセルカウントツールを使用してセルを数える [青陽性 (Hoechst 陽性; 核), 赤陽性 (PI 陽性; 死細胞); 緑色陽性 (ROS)] 各画像に対応する各画像で、治療。</li>
	<li>各フィールドの各特定のシグナルをクリックしてカウントします。たとえば、青/Hoechst染色された核をクリックすると、所定のフィールド内の核の総数が得されます。</li>
	<li>結果を、UV損傷による細胞死の割合(PI陽性細胞数x100をホーハスト陽性細胞数で割った数)と、ROS産生の割合をUV損傷(DCFDA陽性細胞数x100)で計算する。</li>
</ol>

<ol><li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+surface%3A+the+challenge+to+enable+and+protect+vision%3A+the+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li>
<li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Ophthalmoogy%22%5BJournal%5D)">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li>
<li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), Suppl 1 3-8 (2000).</li>
<li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+%28ROS%29+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li>
<li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734(2016).</li>
<li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development%3A+passive+or+active%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited%3A+eye-sun+protection+factor+%28E-SPF%28R%29%29%2C+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li>
<li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers%3A+A+major+health+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Postgraduate+Medicine%22%5BJournal%5D)">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li>
<li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li>
<li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells%3A+A+possible+role+in+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li>
</ol>

著者は、この記事のスポンサーのためにバイオ・ラッド・ラボラトリーズ・インディア・プライベート・リミテッドから資金援助を受けました。

ここで説明するDCFDA染色法により、UV-C線で処理されたマウスの一次眼の生細胞におけるROSの可視化が可能になります。この染色方法の利点は、研究者が生きた細胞に対するUV-C(UVC暴露後3時間)の即時効果と、ROS陽性の割合と死んだ細胞の割合に対する同時列挙を研究できることです。また、染色法が生細胞に用いられているように、細胞は、UV-C放射線の遅延効果の研究のためにより長い時間(数日間)同一の培地中で更にインキュベートすることができる。したがって、この染色法により、ROS生成(緑色)を可視化し、同時に生細胞内の生細胞、アポトーシスおよび死細胞集団を反転蛍光顕微鏡下で区別することが可能になります。しかし、特定の状況下では、ROS陽性およびPI陽性細胞を得ることを期待しているにもかかわらず、視覚化は失敗する可能性があります。そのような場合は、トラブルシューティングを推奨します (表 2)。
このプロトコルは、最適な結果を得るために正確に行われなければなりません。最適な結果は、特定のUV-C線量誘発DNA損傷の正確な読み出しとして生成された緑色蛍...

眼表面(OS)は、角膜の外層及び腺上皮を主成分とする機能ユニットであり、涙腺、筋膜腺、結膜、眼瞼のマージン及び信号を変換するインナーベーションの一部である1。透明ドーム型の角膜層は、光をレーティナに焦点を当てています。この血管組織は、上皮細胞、角質細胞、及び内皮細胞およびコラーゲンおよびグリコサミノグリカンなどの細胞内皮細胞および細胞成分2などの細胞成分から構成される。この地域は、栄養素のほとんどを供給する涙によって排出されます。OSの解剖学的位置は、外部環境に直接接触することを余びれにし、明るい光、微生物、塵の粒子および化学薬品のようなさまざまな粗い部品にそれをしばしば露出させる。この要因は、物理的な傷害にOSを素因とし、それが様々な病気になりやすいです。
酸化ストレスは、活性酸素種(ROS)の生成と内因性抗酸化防御機構3との間の不一平衡に起因する。ROSは反応性分子とフリーラジカルに分類され、いずれもミトコンドリア酸化リン酸化4を介して分子酸素(O2)に由来する。前者の群は、過酸化水素(H2O2)、一重酸素(1O2)などの非ラジカル種から構成され、後者はスーパーオキシドアニオン(O2-)、およびヒドロキシルラジカル(•OH)などの種を含む。これらの分子は、正常な細胞プロセスの副産物であり、その役割は、シグナル伝達、遺伝子発現、および宿主防御5などの重要な生理機能に関与している。ROSの産生の増強は、病原体侵入、異種生物、紫外線(UV)放射線への曝露などの因子に応答して生成されることが知られている4。このROSの過剰産生は、核酸、タンパク質、脂質などの分子の損傷につながる酸化ストレスをもたらす6。
UV 放射の最も主要な光源である自然光は、UV-A (400 ~320 nm)、UV-B (320 ~290 nm)、UV-C (290~200 nm)7で構成されています。波長とスペクトルエネルギーの逆相関が報告されている。自然UV-C放射は大気に吸収されますが、水銀灯や溶接器具などの人工的な光源が放出され、したがって、職業上の危険を構成します。眼への暴露の症状は、光角膜炎および光角結膜炎8を含む。ROSの産生は、UV誘導細胞損傷9を与える主要なメカニズムの1つである。今回の研究では、UV-Cに曝露されたマウスの一次眼表面細胞/幹細胞における2',7'-ジクロロジハイドロフルオレセインダイアセテート(DCFDA)染色法を用いてROSの検出を実証した。緑色蛍光を蛍光顕微鏡を用いて捕捉した。細胞は、ヘエヒト33342および赤色のヨウ化プロピジウムの2つの染料でカウンター染色し、それぞれ生細胞および死細胞を染色した。

<table><tbody><tr><td>2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート(DCFDA)</td><td>シグマ</td><td>D6883</td><td>2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートは蛍光プローブであり、細胞に透過性です。活性酸素種の定量に使用されます。</td></tr><tr><td>細胞培養ディッシュ(35mm)</td><td>Eppendorf</td><td>SA 003700112</td><td>細胞を培養するための滅菌ディッシュです。</td></tr><tr><td>DMEM高グルコース</td><td>HiMedia</td><td>AT007</td>最も<td>広く使用されている細胞培養培地には、4500 mg / Lのグルコースが含まれています。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、EU原産</td><td>HiMedia</td><td>RM99955</td><td>細胞培養培地の最も重要な成分の一つです。成長因子、アミノ酸、タンパク質、A、D、E、Kなどの脂溶性ビタミン、炭水化物、脂質、ホルモン、ミネラル、微量元素を提供します。</td></tr><tr><td>GlutMax</td><td>Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050061</td><td>L-グルタミンのサプリメントおよび代替品として使用されます。細胞の生存率と成長を改善するのに役立ちます。</td></tr><tr><td>HL-2000 ハイブリンカー</td><td>UVP</td><td></td><td>ハイブリダイゼーションオーブン/UVクロスリンカー</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td>Hoechst染色は、生細胞と死細胞の両方に透過性があります。細胞が死んでいるか生きているかに関係なく、二重飢餐状態のDNAに結合します。</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td></td><td>Basement membrane matrix</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (100X)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>細胞の成長と生存率を高めるためのサプリメントとして使用されます。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-Strep)</td><td>Gibco、Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>ペニシリンおよびストレプトマイシンは、培養中の細菌汚染を防ぐために使用されています。</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>死細胞のみ透過性のある蛍光色素です。DNAと結合し、生細胞と死細胞を区別するのに役立ちます。</td></tr><tr><td>TryplE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Gentle cell dissociation agent</td></tr><tr><td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

紫外c(uv-c)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

眼表面は、様々な環境要因により定期的な消耗を受ける。UV-C放射線への暴露は、労働衛生上の危険を構成する。ここでは、マウスの眼面からUV-C線への一次幹細胞の被曝を実証する。活性酸素種(ROS)形成は、酸化的ストレス/損傷の程度の読み出しです。実験的なインビトロ設定では、酸化ストレスのために生成された死細胞の割合を評価することも不可欠です。この記事では、UV-C曝露マウス一次眼表面幹細胞の2',7'-ジクロロフルオレシンセインテアト(DCFDA)染色とDCFDA染色の蛍光画像に基づく定量を紹介します。DCFDA 染色は直接 ROS 生成に対応します。また、ヨウ化プロピジウム(PI)とヘーヒト3332との同時染色とDCFDA(ROS陽性)およびPI陽性細胞の割合を同時に染色することにより、死細胞と生細胞の定量化を実証した。

DCFDAは、細胞内のROSを検出するための指標として使用されるフルオレセインの化学的に還元された形態である無色色の色素である。この色素は細胞内に閉じ込められ、緑色蛍光を発する蛍光ジクロロジハイドロフルオレセイン(DCF)に容易に酸化されます。この蛍光は蛍光顕微鏡を用いて検出することができる。細胞は、次のようにROS蓄積と可視化し、相関することができます:(i)ROSのない生細胞は、高い青色蛍光を放出する。(ii) ROS蓄積を有する生細胞は、低緑色蛍光で高い青色蛍光を発する。ROS蓄積を有する(iii)死細胞は、高い赤色および高緑色蛍光を有する低青色蛍光を発する。
コントロール細胞および細胞をUV-Cの1J/m2に曝露した細胞は、DCFDA/ROSおよびPI陽性細胞を示さなかった。UV-Cの非露光制御は、ホーハスト染色によって示される核染色のみを示した(図1)。しかし、UV-C非露光対照細胞にはPIまたはDCFDA陽性細胞は見られなかった(図1)。</str...

このプロトコルは、マウスの眼表面細胞からの活性一次培養における活性酸素種(ROS)、生細胞、および死細胞の同時検出を実証する。2',7'-ジクロロフルオレセインセテート、ヨウ化プロピジウム、ヘーチスト染色を用いてROS、死細胞、生細胞をそれぞれ評価し、続いてイメージングと分析を行います。

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

こんにちは、私の名前はビパシャ・ボーズ博士です。インド、マンガロール大学イェネポヤ大学イェネポヤ研究センター、幹細胞再生医療センターの助教授と担当を務めています。次に、さまざまな紫外線-C線に曝されたマウスの眼球表面から生きた培養物における活性酸素種であるROSの存在を検出する方法を示します。この技術の利点は、ベスター細胞を持たずに、活性酸素種、生細胞および死細胞の存在を同時に検出できることです。この技術の原理は、基本的に色素DCFDAの生細胞透過性にある。DCFDAは、酸化ストレスの間に細胞内酸化酵素によって作用され、緑色の蛍光DCFに変換される無色色の色素を意味する生細胞です。したがって、緑色の蛍光は、生細胞内の活性酸素種の存在を検出することを可能にする。一方、ヨウ化プロピジウムは、赤を蛍光する色素を意味する排他的に死んだ細胞である。rDNA二本鎖インターカリング染料である。しかし、染料のHoechstは、生きている細胞と死んだ細胞の両方に対して意味されます。青い色の核染色です。したがって、これは、死細胞の評価と共に、長期培養における活性酸素種の存在を時間依存的に検出できる非常に簡単な方法です。プレートポイント 35 ミリメートル培養皿あたり 200 万個のセル。私たちが適用している細胞は、マウスの眼の表面からの細胞です。各細胞培養皿から最大量の培地を除去します。約500マイクロリットルの細胞培養培地を細胞と密接に接触させます。最小限の量の培地は、細胞の乾燥を防ぐことができます。しかし、最小限の量のメディアの目的は、UVC露光の最大の浸透を可能にすることである。UV源の下で細胞を取る、それはUV架橋機、または他の任意の紫外線-C源であることができる。1、10、100、1、000、および10,000ジュール/メートル四角などのUVC放射の異なる投与量に細胞を露出させる。細胞が紫外線-C放射にさらされた場合、蓋は開いた位置にあるはずです。これにより、細胞への紫外線-Cの最大の浸透が可能になり、したがって、紫外線-C放射に対する細胞の最適な線量応答を示す。層状空気流フードに細胞を持って来て、完全な媒体の2ミリリットルで皿の各々を補充する。この完全な培地には、DMEMに20%のウシ胎児血清が含まれ、1%の最小非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイシンである1%の抗生物質などのサプリメントを補う。その後、最大体積で補充した後、2ミリリットルの完全な培地を、プレートをインキュベーターに戻し、紫外線-C放射の早期効果を見るために3時間インキュベートする。UVC細胞インキュベーション後3時間の最後の15分間に生細胞染色培地を準備します。染色媒体は、DMEMを含む10%FBSで37度に予め温め準備される。10ミリリットルの染色媒体を作るためには、まず5マイクロモルの最終濃度を得るために10ミリモルのストックからDCFDAの5マイクロリットルを加える。上下にピペットを入れ、よく混ぜます。第二に、mL当たり10ミリグラムのストックから5マイクロリットルのHoechst溶液を加え、mL当たり5マイクログラムの最終濃度を得る。今、上下にピペットでよく混ぜます。最後に、1 mL当たり1ミリグラムのストックからヨウ化プロピジウム200マイクロリットルを加え、1mL当たり20マイクログラムの最終濃度を得る。上下にピペットを入れ、よく混ぜます。これで染色液が使用可能になりました。3時間のインキュベーションポストUVC露光後、CO2インキュベーターからプレートを取り出します。1、1、10、100、1、000、10,000、10,000ジュールなどのUVCの様々な投与量に曝露された各皿から培地を吸引する。今、料理の側面から穏やかに料理のそれぞれに作りたてのライブセル染色メディアの2ミリリットルを追加します。プレートを再びCO2インキュベーターに戻し、生細胞染色のために15分間インキュベートします。生細胞染色媒体で15分間のインキュベーションの後、異なる紫外線-C放射に曝された細胞を含む各ディッシュから染色培地を取り除く。完全な培地の2ミリリットルで細胞を補充します。これで、セルを表示する準備ができました。次に、コントロールセルを蛍光画像の明視野の下に配置します。彼らはコントロール細胞であるため、細胞は明らかに正常に見えます。青いフィールドの下で、蛍光合計細胞をすることができます。緑色のフィールドの下に ROS 生成が表示されます。これらはコントロールセルであるため、ROSは生成されません。赤色のフィールドの下には、ヨウ化プロピジウム染色死細胞が見える。その後、UVが明視野の下でメートルの正方形あたり100ジュールを露出保ちます。青のフィールドの下に、青のフィールドの下に合計セル番号を表示することもできます。しかし、緑色のフィールドに曝露すると、DCFDA陽性細胞が見られ、PI陽性死細胞も見られます。最後に、最大UV線量(1メートル平方露出セルあたり10,000ジュール)を明視野下に置きます。異常な細胞形態を見ることができます。しかし、青のフィールドの下には、合計青いセルが表示されます。緑色のフィールドの下で、緑色蛍光DCFDA陽性細胞がROS生成を示す見られる。細胞が赤色のフィールドに曝露されると、全ての細胞が、UV投与量の1メートル平方あたり10,000ジュールで処理される場合に多数の細胞死を示す赤色の蛍光を発した。さまざまなチャンネルで撮影した画像を、紫外線-C線量と非露出コントロールに対応する単一の合成画像パネルに配置します。画像はグループ内の単一のパネルに配置されます。まず、明るいフィールド。第二に、ホーチストブルー核染色。第三に、ヨウ化プロピジウムは死核に関して染色する。第4に、ROS陽性細胞のDCFDA。そして5番目に、マージされた画像。1メートルあたり1ジュールのUVC線に曝露された未露光対照と細胞の第1列と第2列を見ると、PIもROS陽性細胞も点灯していないことが観察され、それによって、非露出制御におけるROSおよび細胞死の完全な欠如と、1メートル当たり1ジュールの低UVC用量を示した。今、メートル四角形あたり100ジュールにさらされた細胞の合成画像の3行目に来る。細胞の割合が非常に低いのは、約10%がこの用量でPIおよびDCFDAの両方に対して陽性であったが、それにより、ROS生成および細胞死の少量を示す。次に、合成画像の4列目に示すように、UVC放射被ばくのさらに高い線量、つまりメートル平方あたり1,000ジュールに移ります。ここで、細胞の約70%がPIおよびDCFDAに陽性であった。最後に、合成画像の5行目に示すように、最大用量のUVC露光(メートル平方あたり10,000ジュール)に移ります。ここで、ほぼ100%の細胞がPIおよびDCFDAの両方について陽性であったことが分かったが、これにより、この特定のUVC用量で100%の細胞死およびROS生成を示す。イメージをイメージング ソフトウェアに転送します。まず、Hoescht染色された核、すなわち細胞の総数を示す青色の画像を開きます。カウントツールを開き、番号を表示するために、各セルを 1 つずつクリックします。今度は、PI陽性死細胞を示す赤いチャネルの下でキャプチャされた画像を開きます。カウントツールを開き、PI陽性死細胞の数を示す赤いスポットをそれぞれクリックします。死んだ細胞のカウントが終わったら、緑色のチャンネルで取り込まれたセルをクリックし、カウントツールを開き、ROS生成を示すセルを示す緑色のスポットをそれぞれクリックします。緑色のチャネルの下でキャプチャされた緑色の細胞のカウントを完了し、式を使用して、UVC損傷による細胞死の割合とUVC損傷によるROS産生の割合を列挙する。これは、PI陽性細胞の単純な式数、すなわち赤色蛍光細胞を用いて、Hoechst陽性細胞の数を100倍にした値で割ったものである。UV損傷によるROS産生の割合は、式、DCFDA陽性の数、または緑色蛍光細胞を使用して、Hoechst陽性細胞の数を100倍にした回数で割って計算する。細胞死の割合とROS生産の割合の両方を持った後、これらの値を使用して棒グラフをプロットします。X軸はUVの投与量を示し、y軸は細胞の割合を示す。緑色のバーはROS生成の割合を示し、赤色のバーは細胞死の割合を示します。分析の際、UVC用量100ジュールで10%ROS生成細胞と10%細胞死があることは明らかである。一方、UVC用量10では1メートルあたり3ジュールに上げられ、70%の細胞は細胞死と同様にROS生成を示した。UVCの最高用量では、10が1メートル平方あたり4ジュールに引き上げられるが、約100%の細胞はROS産生と同様に細胞死を示した。したがって、ROS生成と細胞死との間には強い正の相関があると結論することができる。結論として、この技術は、活性酸素種、生きている、正常なイベント培養中の生きている細胞と死んだ細胞の同時評価のために非常に便利です。この技術は、紫外線、または化学薬品などの様々な細胞損傷剤に曝された長期培養において、活性酸素種、生細胞および死細胞の限定的な評価にも有用である。また、この技術は、QR to PCRやウェスタンブロッティングなど、多くの下流アプリケーションに対して可能な限り、50%ROS、75%ROSなどで細胞を収穫するのに最適な時期を決定するための研究者を導くことができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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