ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

リグノセルロース系バイオマスでは、多糖類を分析する酵素の活性は、リグニンとの非特異的相互作用の存在によって制限される。FRET分析は、ナノスケールでの進化に関連するアプローチです。その後全ての切片を得ることが、バイオマスによっては難しい場合があります。

ミクロトームで切り離し、穏やかな洗浄を行う時間を取ります。蛍光寿命とスペクトル測定を照合することで、リグニンとタグ分子間の定量的な敏感かつ明確なFRETの測定が可能になります。この方法では、多次元顕微鏡の取得や分析のサンプル断面化など、視覚的なデモンストレーションで簡単に学習できる、トリッキーな手法を使用します。

木材、小麦、繊維、または断片から植物サンプルを調製するには、カミソリの刃を使用して材料の構造を損傷することなく、1センチメートルの長さのサンプルを切断し、真空下にサンプルを置いて空気を除去します。穏やかな攪拌で室温で水に希釈PEGの連続30%および50%の濃度で24時間のサンプルを沈めます。続いて24時間は摂氏70度でPEGの100%濃度に沈んだ。

100%のペグ浸漬の後、70°Cのホットプレート上のカプセルにサンプルを入れ、プレートが室温に達するまでプレート温度を摂氏5度刻みで徐々に下げます。サンプルが冷却されたら、ミクロトームと使い捨てブレードを使用して、各PEGブロックから30〜60マイクロメートルの厚いセクションを慎重に得ます。3つの5分間の穏やかな水の流しでセクションからPEGを取り除きます。

最後の洗浄後、500マイクロリットルの新しい蛍光プローブを光から保護してチューブあたり最大3つのセクションをインキュベートします。染色インキュベーションの最後に、ガラススライドとナンバー1.5Hカバースリップの間にセクションを取り付ける前に、ブラシを使用してセクションをスライドに移します。sFLIM検出器のスペクトル窓幅を決定するには、0.17マイクロメートルのガラス底を持つ培養箱に尿素結晶を入れ、顕微鏡サンプルホルダーに箱を置きます。

20Xの目的と900ナノメートルの波長と2%のパワーを持つチタンドープサファイアレーザーを選択し、スキャンをオンにします。sFLIM 測定を実行するには、システムを sFLIM モードに切り替えます。sFLIM検出器上の第2の高調波信号を集めるには、レーザー励起波長を900~980ナノメートルに徐々に調整し、第2のスペクトルチャネルに第2の高調波信号が集まる。

次に、スペクトルウィンドウの長さを決定します。非Dスキャンモードに切り替えて、蛍光光子をsFLIM検出器に送ります。sFLIM取得を有効モードに設定して、単一のフォトンカウンタでフォトンカウントを行えるようにします。

装置の準備ができたら、コントロールネイティブの小麦わら単独の植物セクションをスライドとカバースリップの間に置き、レーザースキャンを可能にするためにシステムを連続モードに設定します。30 秒のコレクションを設定し、定数分数の判別子が 1 回 10 から 4 番目、10 から 6 番目の間であることを確認します。次に、サンプルの測定領域を選択し、[開始]をクリックします。

測定の最後に、sdt ファイルを保存し、少なくとも 9 個のサンプルの測定を繰り返します。パルスバイアップを避けながらフォトンに十分な収集された光子を達成することと、蛍光寿命を変える可能性のある写真誘発効果との間にバランスを取る必要があります。上は、取得したsFLIMデータを分析し、単一の光子カウンターソフトウェアにネイティブ小麦ストロー単独のデータファイルをインポートし、不完全な多指数12.5ナノ秒を選択するオプションとモードを開きます。

[オプションと基本設定] で、[インストゥルメンタル応答を自動的に計算] を選択し、[指数適合モデルに] を選択します。各チャンネルに対して、継ぎ手モデルを適用し、フィットパラメータをスプレッドシートに保存します。チャンネルと実験の比較のために、スプレッドシートの主蛍光寿命を計算します。

すべてのチャネルで少なくとも10個のサンプルの平均寿命を計算するには、ドナーチャネルの主蛍光寿命を分析して、最大フォトン数を選択し、リグニン最大放出に対応する専用チャネル値を決定します。コントロールのネイティブ小麦ストローサンプルと実験サンプルとの間のsFLIM値とEFRET値を比較するために、FRETイベントとして分析される対照と実験サンプルとの間の均質な寿命減少に関連する正のEFRETを考えてみましょう。この代表的な実験では、sFLIM曲線は、参照サンプルと2つの相互作用事例の間で達成できるいくつかの変更を示す。

実際、ローダミン放出範囲に対応するスペクトル領域の蛍光増加は容易に可視化される。3つの最初のチャネルフォトン崩壊曲線を注意深く観察すると、ローダミンでタグ付けされたPEGでインキュベートされたネイティブ小麦ストローよりも、ローダミンでタグ付けされたデキストリンを持つネイティブ小麦ストローに対するより強い抑揚も明らかになる。フォトン減衰曲線をフィッティングし、各チャネルの主蛍光寿命を計算した後、FRET シグネチャがより明白になります。

例えば、蛍光寿命はネイティブの小麦ストローサンプルの蛍光スペクトルに沿って増加し、減少する一方で、ローダミンとデキストリンをタグ付けした天然小麦ストローと、ローダミンサンプルでタグ付けされた天然小麦ストローの両方に対して明確なFRETシグネチャが観察されます。リグノセルロース系バイオマス加水分解の状況では、この方法は、新しいバイオマスの厳密な特性評価を必要とする様々なバイオマスサンプルにおける酵素相互作用研究に容易に移すことができる。sFLIMはサンプルの固定を必要としないため、動的酵素リグニン相互作用研究への道を開き、酵素工学戦略とバイオマス前処理を導く可能性が高い。

ほとんどの場合、寿命測定にはパルス赤外線レーザー光源を使用する必要があります。適切な安全対策を講じる必要があります。