共分泌ルシフェラーゼサロゲートを用いた相対インスリン分泌の測定

このプロトコルは、β細胞からのインスリン分泌のプロキシとしてインスリン連結ガウシアルシフェラーゼを使用して中程度のスループットで迅速な低コストルシフェラーゼアッセイを行う方法について説明する。アッセイは、ほとんどの発光プレートリーダーおよびマルチチャンネルピペットで行うことができる。

このプロトコルは、創薬と特性評価を促進するためにベータ細胞株からのインスリン分泌をアッセリンするための代替迅速なアプローチを記述する。このアプローチは、複数の治療法を同時にテストすることができ、実験の直後に結果が得られ、このアッセイは他のものよりも手頃な価格であるため、有用です。インスリン分泌の新しい小分子モジュレーターのスクリーニングに向けてこの方法を適用すると、将来の糖尿病治療のための鉛化合物を同定することができる。

β細胞機能の知識の増加は、一般的にタンパク質または神経伝達物質の分泌の理解を深めるに貢献することができます。.このインスリン分泌レポーターは、他のβ細胞株およびヒト小島においてレンチウイルス系で働くように確立された。このアッセイは、細胞培養およびマルチチャネルピペットの操作に精通している個人にとって非常に簡単であるべきです。

実験を計画する前に、あなたの親または安定したベータ細胞株がインスリンELISAを使用してグルコースに適切に反応していることを確認してください。まず、クレブスリンガー重炭酸塩バッファーまたはKRBHとガウシアルシフラーゼの作業溶液を原稿の指示に従って調製します。標準的な細胞培養技術を用いてT75フラスコでMIN6細胞を増殖させる。

PBSで2回細胞のコンフルエントフラスコを洗浄し、トリプシンの2ミリリットルを追加することにより、メッキのためのInsGLuc MIN6細胞を準備します。約5分間、またはフラスコから解離するまで、37°Cで細胞をインキュベートします。細胞濃度を決定し、完全な培地中の細胞を1ミリリットル当たり100万個の細胞に希釈し、96ウェルプレートの各ウェルで100マイクロリットル当たり100,000細胞に相当します。

細胞は、3〜4日後にアッセイのために十分にコンフルエントでなければなりません。アッセイの日に、実験のために十分なグルコースフリーKRBHを準備し、貯蔵所を設置する。96ウェルプレートから培地をデスキャンするには、実験室のシンクの上で素早く反転し、余分な媒体を取り除くためにペーパータオルの積み重ねにしっかりと吸い込みます。

ウェルあたり100マイクロリットルのグルコースフリーKRBHでプレートを2回洗浄し、薬物治療を行う場合は、原稿の指示に従ってKRBHに薬物を追加します。その後、各ウェルにグルコースフリーKRBHの100マイクロリットルを追加し、1時間摂氏37度でインキュベートします。インキュベーションの後、バッファーをデカンにし、ペーパータオルの上にプレートをブロットします。

蓄積された背景を洗い流すためにウェルあたり100マイクロリットルのグルコースフリーKRBHを加え、プレートをデカントします。1ウェルあたり100マイクロリットルで薬物治療の有無にかかわらず制御と刺激条件を追加し、1時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。特定の実験で細胞の応答性を決定するために、各プレートに基底および刺激されたコントロールを含めることが重要です。

細胞が時間の経過とともに応答を失った場合は、新鮮な液体窒素ストックからそれらを再培養します。マルチチャンネルピペットを使用して50マイクロリットルの上澄み物を慎重に収集し、不透明な白96ウェルアッセイプレートに移し、ルシファーゼアッセイの準備ができるまでベンチの室温でサンプルを保管してください。GLucアッセイバッファーに必要量のCTZ溶液をピペット処理して、GLucアッセイバッファーにガウシアルシファーゼアッセイの作動液を調製し、CTZの温暖化を防止するよう注意を払います。

マルチチャンネルピペットを使用して、GLucアッセイの作業溶液をKRBH上清を使用してプレートに素早く添加します。ウェルの側面に液滴がある場合は、テーブルトップでプレートを簡単に回転し、バケット遠心分離機を振ります。その後、プレートをプレートリーダーに入れ、0.1秒の積分時間で発光を読み取ります。

このアッセイは、グルコース濃度の上昇に対する応答としてインスリン分泌を測定することによって制御条件下で試験されている。5ミリモルグルコース未満では分泌活性が非常に少なく、8ミリモル以上の分泌量の増加が観察される。この細胞は、ジアゾキシドパラダイムに挑戦した場合に予想される分泌応答を示す。

ジアゾキシド治療は、細胞外の塩化カリウムがない場合、インスリン分泌をブロックします。塩化カリウムが存在する場合、さらにグルコースを添加して分泌を増幅することができる。また、InsGLuc MIN6細胞が、塩化カリウム、ジアゾキシド、PMA、エピネフリンなどの化合物を分泌する際に期待どおりに反応することが実証されています。

この手順に従って、重要な結果は、インスリン濃度の決定を可能にする抗体ベースELISAまたはHTRFアッセイ中のKRBH上清を分析することによって確認されるべきである。ブロード・インスティテュートのグループによって多くの先駆的な仕事が行われ、私はこのアッセイを研究にますます使う道を開きました。私たちやブロードのグループを含む複数の研究グループは、糖尿病の分野での創薬活動にこのアプローチを使用しています。