化合物阻害、IC50値、アーティフィファクト活性、ヌクレオシドリボヒドロラーゼの全細胞活性を決定するためのNMRベース活性アッセイ

NMRベースの活性アッセイは、特定の酵素に対する阻害剤を同定、評価、検証するための効果的な方法を提供します。それらは断片スクリーニングのために特に適している。NMRアッセイは、弱い阻害剤に必要な高い化合物濃度に適しています。

さらに、レポーター酵素の欠如は、偽陽性を起こしにくい。私たちは、研究室のNMRアッセイを使用して、トリコモナス膣から2つの酵素の阻害剤を同定し、特徴付けます。両方の酵素は、新しい抗トリコモナル薬の新しい標的を表す。

NMRアッセイは、一般的に酵素を含む研究の任意の領域に適用され、細胞内の酵素を研究するために使用することができます。この技術の最も重要な側面は、正しい試薬の容積がピペット化され、反応成分が完全に混合されていることを確認することです。基質および試験化合物を調製するには、4つの1.5ミリリットルマイクロフュージチューブのそれぞれに12マイクロリットルの基質を加え、6マイクロリットルの重水素DMSOをゼロ分制御チューブと30分制御チューブに加えます。

試験化合物の6マイクロリットルを第1実験管に加え、試験化合物の3マイクロリットル、および3マイクロリットルの重水素DMSOを第2の実験管に加える。次に、2.59ミリリットルの反応バッファーを含む15ミリリットルのチューブに300マイクロリットルの重水素酸化物を加えた後、25マイクロリットルの酵素溶液を添加します。チューブを2回そっと反転して反応ストック溶液を混合し、582マイクロリットルの反応ストック溶液を含む1.5ミリリットルチューブに1.5モル塩酸10マイクロリットルを加えます。

次に、反応ストック溶液と酸の全量をゼロ分制御チューブに移し、ゼロ分制御反応を同時に開始および焼入する。サンプルをゆっくりと意図的に2回吸引し、分配する。残りの3つの反応をずらして開始して実行し、すぐに582マイクロリットルの反応ストック溶液を最初の実験チューブに移し、サンプルを2回混合します。

慎重な吸引と分配は開始のステップの間に完全な混合を保障する。各サンプルと一致して、差分混合が変数ではないことを確認します。30秒後、反応ストック溶液582マイクロリットルを第2実験チューブに移し、その後、第2実験管で反応を起動させた30秒後に、反応ストック溶液を30分間制御チューブに添加した。

30分後、1番目の実験管に1.5モル塩酸の10マイクロリットルを加え、2番目の実験および30分間の制御チューブのために30秒間隔で消光を繰り返す。すべての反応が消灯されたら、各反応から600マイクロリットルの溶液をNMRチューブに移します。制御スペクトルの基板の変換率を計算するには、サンプルを分光計にロードし、NMRスペクトルを収集し、ゼロと30分の制御のスペクトルをオーバーレイします。

ゼロ分制御で基板信号をスケーリングして、30分の制御に合わせ、この割合を記録します。次に、変換率を、基板信号の照合から百分率を引いた100として計算する。試験化合物を含む反応に対する基質の転率を算出するために、500マイクロモル試験化合物を含む第1の反応とゼロ分制御のためのスペクトルを重ね、ゼロ分制御で基質信号をスケールして、スペクトルを試験化合物と一致させる。

この割合をメモし、この割合を使用して、単に示したように、パーセント変換を計算します。次に、250マイクロモル試験化合物を含むゼロ分制御及び第1の反応に対するスペクトルを重ね、ゼロ分制御で基質信号をスケールして、試験化合物とスペクトルを一致させる。パーセントを確認したら、パーセント変換を計算します。

各試験化合物濃度に対する反応率及び阻害率を算出するために、まず、試験化合物の転化率として反応率を算出し、制御倍率100の割合換算で割った。次に、パーセント阻害率を100から反応率を引いた値として計算します。洗剤カウンタースクリーンアッセイを実行するには、2.59ミリリットルの反応バッファーを含む15ミリリットルのチューブに300マイクロリットルの重水素酸化物と25マイクロリットルの酵素溶液を加えます。

チューブを2回軽く反転して反応ストック溶液を混合し、20ミリリットルの反応バッファーにTriton X-100洗剤を2マイクロリットル加えます。次に、0.01%トリトンX-100洗剤を含む2.59ミリリットルの反応バッファーを新しい15ミリリットル円錐形チューブに加えます。次に、300マイクロリットルの重水素酸化物と25マイクロリットルの酵素溶液をチューブに加えます。

チューブを2回軽く反転させ、反応ストック溶液を混合します。次に、100マイクロモルおよび50マイクロモル試験化合物に対する阻害率を、ちょうど実証したように決定する。洗浄剤を含まない反応ストック溶液を用いて、4本のチューブの1セットと、4本のチューブの2セット目に対する洗浄剤付き反応ストック溶液を使用する。

ジャンプ希釈を行うために、反応バッファー468マイクロリットルと60マイクロリットルの重水素酸化物を53.8マイクロリットルの反応バッファー、5マイクロリットルの酵素溶液、および30分間インキュベートされた1.2マイクロリットルのDMSOを含むチューブに移します。吸引し、ゆっくりと、しかし意図的な方法で混合物を2回分配する。468マイクロリットルの反応バッファーと60マイクロリットルの重水素酸化物を、53.8マイクロリットルの反応バッファー、5マイクロリットルの酵素溶液、および30分間インキュベートされた1.2マイクロリットルの試験化合物を含むチューブに移す前。

2回目の反応を実演に合わせて2回混ぜる。そして、すぐに588マイクロリットルの溶液を、ジャンプ希釈DMSO制御チューブから、混合して12マイクロリットルの基板を含むチューブに移す。ジャンプ希釈試験用化合物チューブ、希釈されていないDMSO制御チューブ、および希釈されていない試験化合物チューブから3つの1.5ミリリットルチューブのそれぞれに588マイクロリットルを移し、その後30秒間隔で混合してチューブあたり12マイクロリットルの基板を含みます。

次に、反応を焼き付ける前に30分待ち、NMRスペクトルを収集し、ちょうど実証したように各化合物の阻害率を計算する。ここで実証したようにプロトンNMRを用いた初期試験化合物アッセイでAgNHに対して2つの化合物を試験した結果が示される。酵素反応は、アデノシンシングルの消失と100万分の6.09部のアデノシンの単振れと6.09部のそれぞれで最も容易に観察され、定量化される。

そして、30分間の制御スペクトルで観察された100万分あたり8.33部のアデニンシングルレジデンスの出現。この図では、図示したようにプロトンNMRを用いた洗浄剤対スクリーンアッセイにおいてAgNHに対して2濃度の化合物を試験した結果が示されている。この2つの条件を用いて基質及び生成シグナルの強度において最小の差のみが認められ、観察された酵素阻害が化合物凝集のアーチファクトではないことを示す。

なお、試験化合物および洗剤から生じる共鳴は、基質または製品の共振に干渉しないことに注意してください。デモのようにプロトンNMRを用いたAGNHに対するジャンプ希釈アッセイで化合物を試験した結果は、200マイクロモル反応と比較して20マイクロモル反応における基質シグナルの強度低下を明らかにし、阻害が可逆的であることを示す。各反応の開始時およびジャンプ希釈のための完全なサンプル混合は重要である。

慎重かつ一貫した願望と分配が必要です。NMRベースのアッセイは、反応バッファーおよび酵素の代わりに中断された細胞を含む溶液を用いて、細胞全体の酵素活性を測定するために使用することもできる。抗トリコモナル創薬の取り組みは、リボヒドロラーゼ酵素に対する新たに合成された化合物の効力を測定するために、これらのアッセイに依存し続けている。

それは非常に少量で使用されているにもかかわらず、反応を急いで使用される塩酸は危険であり、適切な個人的な保護具と一緒に使用する必要があります。