Name: アフィニティクロマトグラフィー樹脂の急速な発達のための活性化架橋アガロース - ケーススタディとしての抗体捕捉 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶ DsRedベースのアフィニティ樹脂を用いたモノクローナル抗体の精製法。活性化架橋アガロースへの結合と回収率向上の最適化条件を解説し、バイオ医薬品製造コスト削減に貢献する革新的な代替技術を紹介します。

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私たちは、イブラヒム・アル・アメディがトランスジェニックタバコ植物を栽培し、トーマス・ラデマッハ博士がタバコ発現ベクターを提供したことを認めたいと思います。著者らは、DFEアフィニティリガンド構造に関する実りある議論のために、編集支援とマーカス・サック博士にリチャード・M・ツイマン博士に感謝したいと考えています。この作品は、グラント・ノーの下でフラウンホーファー・ゲッセルシャフト内部プログラムによって一部資金提供されました。125-600164とライストーンスゼントルム交付金第423号「ネットワーク化された適応生産」の下でノースライン・ウェストファリアの状態を引き付けます。この研究は、研究訓練グループ「腫瘍標的薬物送達」助成金331065168の枠組みの中で、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(DFG)によって支援されました。GE ヘルスケアは、この記事のオープンアクセスの公開をサポートしました。

著者は、開示する利益相反を持っていません。

新規親和性樹脂の応用
mAbsの捕捉のためのカスタムアフィニティクロマトグラフィー樹脂は、NHS活性化架橋アガロースにmAb特異的エピトープを含むリガンドを固定することによって製造できることを示した。このような樹脂を設計するには、エピトープ配列を知り、線形エピトープを使用する必要がありました。得られた樹脂は、高価なタンパク質Aアフィニティクロマトグラフィーステップを置き換える可能性があるため、mAbsの捕捉に有利です。我々のケーススタディにおける2F5とDFEの相互作用はエピトープ・パラトープ結合によって媒介されたので、我々のリガンドは、ほとんどのマウスおよびヒトIgGのFc領域に結合するタンパク質Aよりも選択的であるべきである。各mAbには個別のリガンドが必要となるため、当初は非常に大規模に産生される抗体に適していると思われる場合があります。しかし、我々のアプローチを迅速な植物ベースの一過性タンパク質発現と組み合わせることにより、新しい親和性リガンドは、最小限の労力で2週間27未満で調製することができる28。したがって、この方法は、小規模なmAb精製にも適している。
アフィニティリガンドの生産と潜在的な改善
植物は、我々のケーススタディで紹介されたDFE融合タンパク質など、アフィニティリガンド5、29、30のための迅速かつ安全な生産プラットフォームを提供します。植物材料をブランチングすると、1つのステップで宿主細胞タンパク質の量が大幅に減少し、標準的な明確化ルーチンに容易に統合されました。しかし、リガンドの回収は、現在のセットアップでは低く、おそらくその適度な熱安定性およびフィルタ層へのいくつかの非特異的結合のために、他の製品31、32、33について報告された。したがって、その熱安定性を高めるためにキャリアをエンジニアリングすることは、マラリアワクチン候補CCT、抗腫瘍酵素PpADIまたは中親性β-グルコシダーゼ34のために記載されているように、将来的にリガンド収率を改善するのに役立つ可能性があり、35、36.同じことが深度ろ過ステップにも当てはまり、タンパク質工学はフィルター材料37への非特異的結合を減らすのに役立つかもしれない。DFEおよび同様のリガンドの生産コストはまた、凝結剤またはフィルター添加剤38、39を用いて明確化の全体的な効率を改善することによって低減することができる。
DsRedをキャリアとして使用すると、四面体複合体を形成します。これは、リガンドあたりのエピトープの数を増加させるので有利であるが、それはまた、アフィニティクロマトグラフィー中に分解または変形の影響を受けやすいリガンドをレンダリングする可能性があります。したがって、mCherryのような単量体担体タンパク質は、低pH40で安定しているので、好ましいかもしれません、そして、エピトープのタンデムリピートを含めることは、リガンドの生存率を増加させ、したがって、樹脂容量5を増加させるであろう、26歳,41.単純なキャリアエピトープタンパク質(すなわち、ジスルフィド結合または翻訳後修飾を持たないもの)の微生物生産システムは、製造コストを削減し、リガンドをプロテインAとの競争力を高める可能性があります。例えば、緑色蛍光タンパク質は、約1g·kg-1バイオマスの収率を有する細菌細胞で発現されており、これはリガンド製造コスト42を大幅に削減するであろう。
発現宿主にかかわらず、それ以外の場合は樹脂選択性および容量を減少させることができる宿主細胞タンパク質または培体成分の固定化を最小限に抑えるために、カップリング中に精製されたアフィニティリガンドが必要であった。IMAC精製のためのポリヒスチジンタグを含めることは、1つのステップで〜90%に純度を増加させ、迅速かつ安価なリガンド生産5、43、44を容易にした。しかしながら、融合タグの位置は、立体的にエピトープ結合を妨げるか、または担体45、46からタグまたはエピトープのいずれかの切断を誘発する可能性を有するので重要である。
NHS活性化クロマトグラフィーカラム上のアフィニティリガンドの固定化
固定化は、手動またはクロマトグラフィーシステムを用いて行った。列あたりのバッファ量が少ないため、手動での処理が好ましいと思われました(廃棄物量が最小限に抑えられるなど)。しかし、複数/より大きなカラムが必要な場合、クロマトグラフィーシステムは結合条件の制御を容易にし(例えば、規制された流量速度)、したがってDBCの観点から再現可能な結果を達成する可能性が高くなります。我々のデータは、カップリングバッファとpHが結合効率と全体的なカラムコストに重要な影響を及ぼすことを示唆している。カップリング反応に影響を与えるスクリーニング因子を各キャリアタンパク質(または各キャリアリガンド融合)に対して調整することで、結合効率と樹脂性能が向上する可能性があるため、このアプローチをお勧めします。
DFEアフィニティ樹脂を用いて2F5分離をテスト
製品の歩留まりと純度は樹脂性能の重要な側面であり、DFEの場合は105±11%(±SD、n=3)の収率と97±3%(±SD、n=3)の純度を達成し、ベンチマークタンパク質A樹脂25の性能に匹敵します。、26.一般的な樹脂のもう一つの主要な業績指標(特にアフィニティリガンドに基づくもの)は、このパラメータが特定のプロセスに必要な樹脂の量に影響を与え、コストに影響を与えるため、10%の製品ブレークスルーでDBCです。DFEリガンドの場合、最初のDBCは~4 g·L-1樹脂は、同様の条件下でタンパク質Aに対する対応値の約13%(接触時間2分のみ)25、47が、他のカスタム親和性樹脂と比較して約15倍高い2分48の同じ滞留時間を用いた抗FSH-免疫親和性リガンド。DFEのDBCは、25回の結合および溶出サイクル後の開始値の15%に低下したが、市販のタンパク質A樹脂49におけるDBCの同一損失には50サイクル以上が必要である。しかし、我々のキャリアは、過去40年間に包括的に調査され、改善されたプロテインAと同じ程度にまだ最適化されていないことに注意することが重要です8.
これまでは、以前の研究13で推奨されているように、低pH溶出バッファーから高濃度の塩化マグネシウム(図3)に切り替えることで樹脂の安定性と製品回収を改善してきました(図3)。アフィニティリガンドの特徴的な赤色は、25の結合および溶出周期の間に実質的にフェードしなかったので、我々は、明らかにされた植物抽出物31の内因性植物プロテアーゼが切り捨てられ、したがって、エピトープを不活性化した可能性があると推測する。リガンド。したがって、キャリアとエピトープを接続するプロテアーゼ耐性リンカーを設計することは、サイクルの長い数にわたって初期DBCを維持するのに役立つ場合があります。DFEリガンドの迅速かつ簡単な発現と精製、市販のクロマトグラフィー樹脂への簡単な結合、および優れた製品収率と純度を考えると、当社の方法はタンパク質Aに適した代替手段を提供すると考えています。タンパク質Aに結合しないmAbsおよび抗体誘導体の精製は、特にキャリアおよびリンカーの改善がDBCおよびリガンド安定性を改善できる場合である。この仮定は、DFE精製およびタンパク質A精製2F5抗体5の解離定数のわずかな差によって支持され、当社の新しい親和性リガンドが高品質のmAbsの回収を可能にすることを示す。
メソッドの利点と現在の制限事項
キャリアタンパク質との遺伝的融合としてアフィニティリガンドを産生すると、水バッファーの溶解性が増加し、典型的なリガンド結合条件との相溶性が高まります。対照的に、固相ペプチド合成に由来するブランクペプチドは、その配列50に起因するこれらの条件下での溶解度が制限され得るが、これはmAbによって認識されるエピトープのアミノ酸配列によって決定されるので変更することができない。浄化される。したがって、他の人はペプチドリガンド51のオンレジン合成を使用している。得られた樹脂の静的結合能力が高かった(~80g·L-1)、樹脂製剤の工程は長いが、動的結合能力は報告されず、得られた純度および回収は我々のアプローチよりも低かった。実験室規模での融合タンパク質リガンドのさらなる利点は、リガンドおよびその変異体が、使いやすい高スルー発現システム52において最小限の労力で迅速に製造、精製、試験できることである。
ここで提示される方法の2つの現在の制限は、3 gの低ダイナミック結合能力です·L-1およびその90%の減少は25の結合および前溶周期のコース5の間に5。これらの制限は、より厳格な負荷条件を適用し、現在のDsRedキャリアをそれぞれ設計された、より安定したバリアントに置き換えることによって、将来的に対処することができます。例えば、現在の接触時間を2分から4分に倍増すると、一部のプロテインA樹脂26に示したように動的結合能力を倍増する可能性がある。
トラブルシューティング
次の表は、このプロトコル中に発生する可能性のある潜在的な問題を示し、それらを解決する方法のヒントを示します (表1)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">表 1: 発生する可能性のある問題と修正の可能性について説明します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロトコル ステップ</td>
			<td>問題</td>
			<td>カウス</td>
			<td>修正</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>植物は成長しない</td>
			<td>妥協された成長条件</td>
			<td>肥料のpHと導電性を確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>温度と光の状態を確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 および 3</td>
			<td>大量の宿主細胞タンパク質が抽出後に存在する</td>
			<td>不完全な降水量</td>
			<td>ブランチ中の温度を確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ブランチ風呂の攪拌を確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 および 3</td>
			<td>植物エキスに製品が見つかりません</td>
			<td>ブランチング温度が高すぎる</td>
			<td>ブランチ中の温度と pH を確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>ブランチ ング バッファの pH が低すぎる</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>大きな茎や葉の部品は、抽出後に残ります</td>
			<td>ブレンダーでの不完全な混合</td>
			<td>植物材料がブレンダーのプラグを形成していないことを確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>深さのろ過の間の急速な圧力の上昇</td>
			<td>フィルタの選択や向きが正しくありません</td>
			<td>フィルタの種類と向きを確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>溶出中の小さな融合タンパク質/フロースルー中の多くの融合タンパク質</td>
			<td>IMAC樹脂は金属イオンで充電されなかった</td>
			<td>IMAC樹脂がイオンで正しく充電されたかどうかを確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>融合タンパク質は、親和性タグを失った</td>
			<td>植物栽培中の強い日光と高温を避ける</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>濃度中に失われた融合タンパク質</td>
			<td>膜に結合した融合タンパク質</td>
			<td>膜の種類を確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>濃度係数が高すぎていないことを確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>低結合収率</td>
			<td>カップリング試薬添加の順序が正しくありません</td>
			<td>試薬ラベルと添加シーケンスを確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>カップリング前の列の正しい準備</td>
			<td>コラムプリパラトンの条件を確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 および 6</td>
			<td>低mAb収率</td>
			<td>植物バイオマスにおける低mAb発現</td>
			<td>バイオマスにおけるmAb発現の試験</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>低リガンド密度</td>
			<td>融合タンパク質製剤の純度を確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>ブラッドフォードアッセイにおける非常に低/高タンパク質濃度</td>
			<td>ピペッティング中の気泡形成</td>
			<td>96ウェルパルテの気泡を確認する</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>SPR測定中の低mAb濃度</td>
			<td>侵害されたタンパク質Aチップ</td>
			<td>既知の濃度と標準mAbの結果と比較</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>誤ったサンプル希釈</td>
			<td>希釈率とバッファを確認する</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:トラブルシューティング。

バイオ医薬品は、医学1のほぼすべての分野における幅広い疾患の治療に重要である。モノクローナル抗体(mAbs)はバイオ医薬品市場を支配しており、2020年には世界の売上が約1,100億ユーロに達すると予測されています。mAbsに好まれる発現プラットフォームは、通常、培養スーパーネート3、4で最大10g∙L-1の高mAbチテーターを産生する中国ハムスター卵巣細胞株である。しかしながら、哺乳動物細胞培養におけるmAbsの産生は、培地のコストが高く、無菌発酵5の必要性に起因して高価である。プラントなどの代替式プラットフォームは、工業生産6、7に対して、より速く、よりシンプルで、より安価でスケーラブルなアプローチを提供する可能性があります。
哺乳類細胞培養に関連するコストに加えて、製品キャプチャのためのプロテインAアフィニティクロマトグラフィーの広範な使用は、mAbsの工業生産のための主要なコストドライバーです。タンパク質Aは、黄色ブドウ球菌細胞の表面に自然に見出され、特定のマウスおよびヒト抗体の結晶化可能(Fc)領域に結合し、それによって体液性免疫系8を回避する防御機構として作用する。タンパク質Aは、細胞培養上清からのmAbsの捕捉のための業界のゴールドスタンダードとなっており、また、それは非常に選択的であるため、研究コミュニティによって広く使用されており、典型的には、単一のステップ8で〜95%のmAb純度を達成する。当然のことながら、過去20年間のプロテインAの売上は、mAbs8の売上を密接に反映しています。生産規模に応じて、プロテインAのコストは、総プロセスコストの25%以上に対応することができ、それによって€2,000 g-15、9まですることができる治療用mAbsの市場価格に影響を与えることができます。したがって、同様の精製性能を有する代替クロマトグラフィー樹脂は、生産コストを大幅に削減する可能性があり、より多くの患者に対して抗体ベースの治療を利用可能にする10,11 、12.このような選択肢は、低pH(通常&lt;3.5)での過酷な溶出条件を含むタンパク質Aクロマトグラフィーの欠点を回避し、mAbsが凝集を促進する立体構造変化を引き起こす可能性がある13.重要なことに、プロテインAは特定のIgGサブクラスのFc領域に対してのみ選択的であり、切り捨てられた結合ドメインを有する非機能分子は無傷の製品5と共に精製し、一鎖変数フラグメントなどのmAbデリバティを選択する可能性がある。プロテインAに全く結合しないでください。
ここでは、その線形エピトープELDKWA(1文字アミノ酸コード)5,14を用いてHIV中和mAb2F5を捕捉するための代替親和性クロマトグラフィー樹脂について説明する。2F5エピトープを、担体およびレポーター分子として機能した蛍光タンパク質DsRedのC-終位に遺伝的に融合し、トランスジェニックタバコ(DFE)で得られたタンパク質DSRed-2 F 5-Eピトープ(DFE)を産生した(ニコチアナ・タバカム)植物。DFEは、単段固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー(IMAC)により精製した。精製されたDFEアフィニティリガンドを架橋アガロース樹脂に固定化し、N-ヒドロキシスチニミド(NHS)活性化架橋アガロースカラムを用いて化学結合することによって達成した。その後、統計的実験計画を用いて、固定化手順と結合効率15を最適化した。mAb 2F5の精製戦略は、抗体純度、収量およびリガンド安定性の観点から評価された。Fc領域に結合するタンパク質Aとは対照的に、DFEは2F5の相補性決定領域に結合し、無傷のパラトープを有する分子の精製を保証する。我々の概念は、線形エピトープまたはマイクロアレイ研究16によって容易に同定することができる他のペプチドベースの親和性リガンドを有する任意のmAbに容易に適合させることができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> 図1:粗植物抽出物または細胞培養上清からのmAbsの捕捉に使用できるエピトープ親和性樹脂の調製のためのプロセスフロースキーム。(A)アフィニティリガンドDFEは、トランスジェニックタバコ植物で発現した。収穫した葉を均質化する前に熱降ステップ(B)を含有した(C)。(D) 粗植物抽出物を袋ろ過、深さろ過、0.2μm無菌濾過により明らかにした。(E) DFEは、その後、IMACによって精製された。(F, G)精製されたDFEアフィニティリガンドをEDC/NHS活性化架橋アガロースカラムに固定化した。(H)T-DNAコード抗体2F5を担持する細菌培養物は、フィトトロンで増殖したN.ベンタミアナ植物(I)における一過性発現に用いた。(J)N.ベンタミアナ葉をD.(K)mAb2F5に記載の通りに収穫して処理し、DFE親和性カラム(L)を用いて精製した抽出物から精製した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>10 L/20 Lのバケツ</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>は装置</td></tr><tr><td>2100P携帯用濁度計</td><td>Hach</td><td>4650000</td><td>の濁度計</td></tr><tr><td>&Auml;KTApure</td><td>GE Helthcare</td><td>29018226</td><td>クロマトグラフィーシステム</td></tr><tr><td>Allegra 25R</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369434</td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>アミンカップリングキット</td><td>GE ヘルスケア</td><td>BR100050</td><td>SPRチップカップリングキット</td></tr><tr><td>アミンカップリングキット</td><td>GEヘルスケア</td><td>BR100050</td><td>SPRチップカップリングキット</td></tr><tr><td>抗体 2G12</td><td>フラウンホーファーIME</td><td>n/a</td><td>SPR用標準品定量</td></tr><tr><td>ブレンダー</td><td>Waring</td><td>800EG</td><td>ブレンダー</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Fuhr</td><td>2632410001</td><td>バッグフィルター</td></tr><tr><td>CanoScan 5600F</td><td>Canon</td><td>2925B009</td><td>スキャナー</td></tr><tr><td>遠心分離管 50 mL 自立</td>型<td>ラボメディック</td><td>1110504</td><td>反応管</td></tr><tr><td>キレートセファロース FF</td><td>GE Helthcare</td><td>17-0575-01</td><td>クロマトグラフィー樹脂</td></tr><tr><td>Cond 3320</td><td>WTW</td><td>EKA 3338</td><td>導電率計</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n/a</td><td>DoEソフトウェア</td></tr><tr><td>Discovery Compfort</td><td>Gilson</td><td>F81029</td><td>マルチチャンネルピペット</td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4984.3</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>多様なボトル</td><td>Schott Duran</td><td>n/a</td><td>Glas ボトル</td></tr><tr><td>Dri Block DB8</td><td>Techne</td><td>Z381373</td><td>Heat block</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Fraunhofe IME</td><td>n/a</td><td>Standart</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8043.2</td><td>バッファー コンポーネント</td></tr><tr><td>EnSpire</td><td>Perkin Elmer</td><td>2390-0000</td><td>プレート リーダー</td></tr><tr><td>ETHG-912</td><td>Oregon Scientific</td><td>086L001499-230</td><td>温度計</td></tr><tr><td>F9-C</td><td>GE Helthcare</td><td>29027743</td><td>フラクション コレクター</td></tr><tr><td>Ferty 2 メガ</td><td>カムロット</td><td>5.220072</td><td>肥料</td></tr><tr><td>Forma -86C ULT 冷凍庫</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>冷凍庫</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>緩衝成分</td></tr><tr><td>Hettich 遠心分離機 Mikro 200</td><td>Hettich</td><td>2400</td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10</td><td>GE Helthcare</td><td>GE17-5087-01</td><td>クロモグラフィーカラム</td></tr><tr><td>HiTrap NHS活性化セファロースHP、1 mL</td><td>GE Helthcare</td><td>17-0716-01</td><td>クロマトグラフィーカラム</td></tr><tr>塩<td>酸</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4625.1</td><td>緩衝成分</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3899.2</td><td>緩衝成分</td></tr><tr><td>K700</td><td>ポール</td><td>5302305</td><td>デプス フィルター層</td></tr><tr><td>KM02 塩基性</td><td>IKA</td><td>n/a</td><td>マグネチックスターラー</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>ポール</td><td>B12486</td><td>デプス フィルター層</td></tr><tr><td>L/S 24</td><td>Masterflex</td><td>SN-06508-24</td><td>チューブ</td></tr><tr><td>Lauda E300</td><td>Lauda Dr Wobser GmbH</td><td>Z90010</td><td>液浸サーキュレーター</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>KK36.2</td><td>バッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>Masterflex L/S</td><td>Masterflex</td><td>HV-77921-75</td><td>蠕動ポンプ</td></tr><tr><td>Minisart 0.2 & マイクロ;m</td><td>ザルトリウス</td><td>16534K</td><td>フィルターユニット</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow PES ボトルトップフィルター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>595-4520</td><td>SPRバッファーの真空ろ過</td></tr><tr><td>硫酸ニッケル</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T111.1</td><td>バッファー成分</td></tr><tr><td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS ゲル</td><td>Invitrogen</td><td>NP0336BOX</td><td>LDS-PAA ゲル</td></tr><tr><td>Novex X-cell Mini Cell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>PAGE チャンバー</td></tr><tr><td>NuPAGE 20x ランニングバッファー</td><td>Invitrogen</td><td>NP0002</td><td>バッファー濃縮物</td></tr><tr><td>NuPAGE 抗酸化剤</td><td>Invitrogen</td><td>NP0005</td><td>抗酸化</td></tr><tr><td>剤 PageRuler タンパク質ラダー (10-180 kDa)</td><td>Invitrogen</td><td>26616</td><td>タンパク質標準</td></tr><tr><td>穴あきバッキング</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>ブランチング</td></tr><tr><td>PH 3110</td><td>WTW</td><td>2AA110</td><td>PHメーター</td></tr><tr><td>PowerPac HC</td><td>Biorad</td><td>1645052</td><td>電気泳動モジュール</td></tr><tr><td>プロテインA from Staphylococcus aureus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7837-5MG</td><td>SPRチップのコーティング</td></tr><tr><td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td><td>GE Helthcare</td><td>17003301</td><td>クロマトグラフィー樹脂</td></tr><tr><td>シリコンスプーン</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>スプーン</td></tr><tr><td>Simply Blue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>ゲル染色液</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6773.1</td><td>緩衝液成分</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X891.1</td><td>メディア成分</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>媒体成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>緩衝成分</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>HN13.2</td><td>バッファー成分</td></tr><tr><td>亜硫酸</td>水素ナトリウム <td>Carl Roth GmbH</td><td>243973-100G</td><td>メディア成分</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T877.2</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>SPRアフィニティセンサー - 大容量 Amine</td><td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td><td>SPR-AS-HCA</td><td>SPRチップ</td></tr><tr><td>SPR-2/4 表面プラズモン共振アナライザー</td><td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td><td>n/a</td><td>SPR デバイス</td></tr><tr><td>SSM3</td><td>Stuart</td><td>10034264</td><td>Mini Gyro-rocker</td></tr><tr><td>加熱容器、20 L</td><td>Clatronic</td><td>n/a</td><td>ブランチングチャンバー</td></tr><tr><td>滅菌シリンジ、2 mL</td><td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td>シリンジ</td></tr><tr><td>シリンジ アダプター (Union Luer F)</td><td>GE Helthcare</td><td>181112-51</td><td>シリンジアダプター</td></tr><tr><td>TE6101</td><td>ザルトリウス</td><td>TE6101</td><td>精密スケール</td></tr><tr><td>Tween-20 (ポリソルベート)</td> <td>メルク</td><td>8170721000</td><td>バッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>ユニコーン 6.4</td><td>GE Helthcare</td><td>29056102</td><td>クロマトグラフィーソフトウェア</td></tr><tr><td>真空バッグ</td><td>イケア</td><td>203.392.84</td><td>プラントストージ</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>ポール</td><td>VP60G03KNH4</td><td>フィルターハウジング</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>科学産業</td><td>SI-0236</td><td>Vortex</td></tr><tr><td>XK-26/20 カラムハウジング</td><td>GE Helthcare</td><td>28-9889-48</td><td>クロモグラフィーカラム</td></tr></tbody></table>

アフィニティクロマトグラフィー樹脂の急速な発達のための活性化架橋アガロース - ケーススタディとしての抗体捕捉

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

モノクローナル抗体(mAbs)の精製は、一般的にプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって達成され、これは全体的なプロセスコストの最大25%を占めることができます。そのため、単一のmAbを大量に製造する工業規模の製造では、コスト効率の高い代替キャプチャステップが有益です。ここでは、DsRedベースのエピトープリガンドを架橋したアガロース樹脂に固定化する方法を提示し、タンパク質Aを使用せずに粗植物抽出物からHIV中和抗体2F5を選択的に捕捉することを可能にする。線形エピトープELDKWAは、最初に蛍光タンパク質DsRedに遺伝的に融合し、融合タンパク質は固定化された金属イオン親和性クロマトグラフィーによって精製される前にトランスジェニックタバコ(ニコチアナ・タバカム)植物で発現した。さらに、活性化された架橋アガロースに基づく方法は、高リガンド密度、効率的な結合および低コストのために最適化された。pHおよび緩衝液組成物および可溶性リガンド濃度は、カップリング手順中に最も重要なパラメータであり、実験の設計アプローチを用いて改善された。得られた親和性樹脂は、粗植物抽出物中の標的mAbを選択的に結合する能力について試験し、溶出バッファーは、高mAb回収、製品活性およびアフィニティ樹脂安定性のために最適化された。この方法は、線形エピトープを持つ他の抗体に容易に適合させることができる。新しい樹脂は、タンパク質Aよりも穏やかな溶出条件を可能にし、mAb生産のための初期捕捉ステップのコストを削減することもできます。

アフィニティリガンドの発現と精製
融合タンパク質DFEは、温室で成長したトランスジェニックタバコ植物で発現した。収量は、植物当たり約130gの平均バイオマスで、約120mg·kg-1葉質量であった。DFE純度は、ブランチング前の粗植物抽出物中のTSPの&lt;5%であったが、宿主細胞タンパク質の97%を沈殿させた70°Cでの熱処理後に約40%に増加した。ブランチングステップは、収穫および抽出ルーチン(図1)に容易に統合され、水浴のセットアップを含む余分な時間の2時間未満を要した。DFEの全体的な回復は、純度&gt;90%の23.5 mg kg1であった。製品損失の原因となるステップは、ブランチング、深度ろ過、IMACで、それぞれ40%、27%、45%の特定の損失でした。深度フィルタ容量は平均135±36L m-2(±SD、n=3)であり、文献21で報告された値の上限範囲であった。DFE収量は植物の年齢とともに増加しました(図2)。
NHS活性化クロマトグラフィーカラム上のアフィニティリガンドの固定化
最初のカップリングテストでは、HEPESバッファ(pH 8.3)が、メーカーが推奨する重炭酸塩バッファーの78±9%(±SD、n=3)と比較して、結合効率を89±6%(±SD、n=3)に増加させることがわかりました。したがって、HEPESは、その後のすべてのカップリング実験に使用されました。DFEとNHS活性化架橋アガロース樹脂への結合効率を最適化するDoEアプローチを選択しました。樹脂上に固定化されたDFEの絶対量は、カラムに注入されたDFEの質量と共に増加し、約15g·L-1の一方で、より多くのDFEが注入されるにつれて結合収率は継続的に低下した(図2)。結合収率も酸性バッファーで&gt;50%低く、各リガンドに対して適切なカップリング条件をケースバイケースでスクリーニングする必要性を示した。結合収率、固定化DFEおよびカラムコストの絶対量の観点から理想的な条件は、DoEソフトウェアの数値最適化ツールを使用して同定された。最も望ましい条件(pH 9.0および7.0mgの架橋アガロース樹脂の1mL当たりのDFE)は、大きな高原に位置し、したがって堅牢であった。DFE分子は結合後も赤色蛍光を保持し、色強度は固定化DFEの総量に相当する(図2)。したがって、列色は、カップリング効率とカラム品質を推定するための単純な品質管理パラメータとして使用することができます。蛍光はまた、DFE融合タンパク質が天然DsRedの四面体状態で組み立てられることを確認した。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> 図2:NHS活性化架橋アガロース樹脂に対するDFE固定化の最適化(A) LDS-PAAゲルと均質化および溶出試料のウェスタンブロットオーバーレイを有する非ブランチおよびブランチトランスジェニックDFE植物抽出物。植物の収穫は、播種後38、45または52日目に行った。ウェスタンブロットは、抗His6-抗体5を用いて行った。(B) NHS活性化架橋アガロースカラムに注入された精製DFEの結合pHおよび全質量の場合の依存性における結合DFEアフィニティリガンドの総量。赤い点は、応答サーフェス モデルを構築するために実行された実際の実験を示します。(C) カップリング・プロシージャーの後の DFE アフィニティ列。数字は、パネル B. dps = シード後の日数で強調表示されているカップリング条件に対応します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
DFEアフィニティ樹脂を用いて2F5分離をテスト
組換え2F5抗体は、フィトトロン5で成長したニコチアナ・ベンタミアナ植物で一過性に製造された。粗植物抽出物からの2F5の捕捉を、約7.0mg精製DFEと結合したアフィニティカラムを用いて試験した(ステップ6)。タンパク質A樹脂からの溶出は、通常、酸性バッファー(pH〜3.3)13を含む。そこで、DFEカラムに対して、最初に異なる低pH溶出バッファ(pH 6.0-3.25)を評価しました。2F5の溶出は4.5以下のpH値で成功し、pH3.25で約35%の回復率が最も高かった。しかし、低pH溶出は、抗体(SPR分光法で確認)とDFEリガンド(色の喪失と低いDBC、図3)の両方を不活性化した。後者は、ネイティブDsRedがpH &lt;4.022、23で変性することを考えると予想されました。製品およびリガンドの変性を避けるために、我々は以前に他の親和性樹脂24からmAbsを溶出するために使用されていたので、代替溶出剤として塩化マグネシウムを試験した。1.25Mの塩化マグネシウム濃度は、DFEアフィニティ樹脂から2F5を溶出するのに十分であり、105±11%(±SD、n=3)の回収と純度97±3%(±SD、n=3)であった。この性能はプロテインA樹脂25、26に匹敵した。DFE精製2F5抗体および合成リガンドフゼオンの平衡解離定数(KD)は791pMであったのに対し、タンパク質A精製相手の平衡解離は763 pM5であった。さらに、合計25の結合および溶出サイクルにわたって樹脂中に実質的な色の損失は認められなかった。10/5ブレークスルーにおけるDFEアフィニティ樹脂のDBCは、初期値の約15%に25サイクルの間に直線的に減少した(図3)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> 図3:DFEアフィニティ樹脂を用いて、明確化された植物抽出物からの2F5の単離を試験する。(A) DFE アフィニティ樹脂は、pH 6.0 の中和ステップの後に 4.0~ 3.0 の範囲で異なる pH 値を持つバッファーを使用し、同じ樹脂を使用して 1 回の溶出サイクル後に樹脂を使用します。(B)DFEアフィニティ樹脂は、溶出剤として1.25Mまたは4.00M塩化マグネシウムを用いて2F5精製の1および6サイクル後に樹脂化する。(C) 塩化マグネシウムを溶出剤として用いてDFE樹脂のサイクル依存動的結合能を判定する前頭荷重実験(ブレークスルー曲線)のクロマトグラム。ブレークスルー曲線は、4.0Mと1.25Mの塩化マグネシウム溶出バッファーと各種サイクル数について測定した。(D) 1.25M塩化マグネシウムを溶出剤として用いるDFEのサイクル依存動的結合能力。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この手順では、DsRedベースのエピトープリガンドが固定化され、タンパク質Aの代替として、粗植物抽出物または細胞培養上清からのモノクローナル抗体の捕捉のための高選択的親和性樹脂を産生する。

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

モノクローナル抗体は、バイオ医薬品市場を支配し、典型的にはプロテインAクロマトグラフィーによって精製されます。従う樹脂は、抗体系治療薬の価格に影響を及ぼす生産時の主要なコストドライバである。ここでは、HIV中和抗体2F5の線状エピトープの担体として読み取られる蛍光タンパク質に基づく新しい親和性リガンドについて説明する。一般に我々の方法はモノクローナル抗体の捕獲に使用することができるアフィニティークロマトグラフィー樹脂の速い生成を可能にする。我々は、粗植物抽出物から抗体2F5を捕捉することによってこの能力を実証した。動的結合能力と樹脂再利用性を向上させるために、捕捉条件と溶液バッファーを最適化しました。当社の樹脂は、タンパク質Aよりも一般的に緩い条件を可能にし、モノクローナル抗体の精製コストを削減する可能性を秘めています。さらに、樹脂は、直鎖状エピトープに結合する他の抗体に容易に適合させることができる。この手順を開始するには、実験の設計で定義された1リットル当たり5〜15グラムの範囲になるように、調製された親和性リガンド溶液の濃度を調整する。カップリング反応ができるまで氷の上に溶液を保管します。次に、2ミリリットルのシリンジを1本のDFE溶液で満たします。そして、1ミリリットルのベッド容量を持つNHS活性化クロスリンクアガロースカラムに注射器を取り付けるアダプターを準備します。カップリングに使用される10カラムごとに、30ミリリットルの不活性化溶液、30ミリリットルの低pH溶液、および1ミリリットルの貯蔵溶液を調製します。その後、チューブに1ミリモル塩酸の20ミリリットルを調製します。そして、少なくとも20分間氷の上でそれをインキュベートします。カップリング反応中にすべてのステップの分数を通して流れを監視するために精密スケールを準備します。この後、密閉されたNHS活性化架橋アガロースカラムを開きます。アダプターの入口にバッファーのドロップを適用して、空気が列に入らないようにします。列の入口にシリンジアダプターを取り付けます。6ミリリットルの氷冷1ミリモル塩酸でカラムを洗い、1分あたり1ミリリットル以下の流量で洗います。2ミリリットルのシリンジを使用して、すぐに1.5ミリリットルのDFE溶液を毎分1ミリリットル未満の流量で注入する。そして、後続の分析のために精度のスケールで分数を通して流れを収集します。両端に柱を密封し、摂氏22度で15~45分インキュベートします。次に、活性化溶液の6ミリリットルを注入し、続いて低pH溶液の6ミリリットルを、毎分1ミリリットル未満の流量で、非共有結合リガンドを樹脂から除去する。6ミリリットルの活性化溶液を注入し、カラムを15分間インキュベートする。この後、カラムに低pH溶液を6ミリリットル注入します。活性化溶液の6ミリリットルが続く。次に、カラムに低pH溶液の別の6ミリリットルを注入します。2ミリリットルの貯蔵溶液をカラムに注入し、摂氏4度で保管します。まず、2F5を含む透明化植物抽出物、または好ましい細胞ベースの発現系用上清の100ミリリットルを調製し、2F5も含む。次に、平衡バッファーと、高鉄X強度錯覚バッファーを、テキストプロトコルで概説したとおりに用意する。クロマトグラフィーシステムをバッファでフラッシュします。クロマトグラフィー システムに DFE アフィニティカラムをマウントします。そして5CVの平衡バッファーと平衡化し、毎分1ミリリットルの流量で。280ナノメートルでUV吸光度を監視します。その後、明確化された植物抽出物、または上清の80ミリリットルを毎分5ミリリットルの流量でカラムに積み込みます。2分の接触時間を保証する。2ミリリットルの分数または画期的な曲線再構成でサンプルを通して流れを収集します。直ちにサンプル分析が不可能な場合は、サンプルを通して摂氏4度で流量を保存します。この後、平衡バッファーの6CVでカラムを洗浄します。洗浄の始まり、中、最後にサンプルを集める。MAB2F5を5巻の高いイオン強度の錯覚バッファーで希釈します。280ナノメートルのUV信号がベースラインより5ミリの吸光度単位に増加した場合、DFE分数を収集します。テキストプロトコルで概説されているように、エピトープと抗体のペアごとに錯覚バッファーを最適化します。融合タンパク質DFEは、トランスジェニックタバコ植物で発現し、温室で増殖する。DFEの全体的な回復は23.5キログラム当たりミリグラムです。90%以上の純度で樹脂に固定化されたDFEの絶対量は、カラムに注入されたDFEの質量に応じて増加し、1リットル当たり約15グラムでプラトンが増加し、一方、結合収率は、より多くのDFEが注入されるにつれて継続的に低下する。DFE分子は、カップリング後も赤色の蛍光を保持することが見られます。色の強度は、固定化されたDFEの総量に対応します。したがって、カラムカラーは、結合効率とカラム品質を推定する簡易品質管理パラメータとして使用できます。組換え2F5抗体は、植物で成長したニコチアナベンタミアナ植物で一時的に産生される。粗植物抽出物からの2F5の捕獲は、アフィニティーカラムを用いて試験され、精製されたDFEのおよそ7ミリグラムと結合される。1.25モルの塩化マグネシウム濃度は、100%近い回収率とプロテインA樹脂に匹敵する約97%の純度でDFE親和性樹脂から2F5を溶出するのに十分です。DFEアフィニティ樹脂のDBCを10%2F5のブレークスルーで、25サイクルの間に直線的に低下し、初期値の約15%にする。我々は、我々の親和性リガンドの結合容量を最適化するために、実験アプローチの設計を使用しました。これらの条件は、将来的に他のリガンドのために微調整することができます。我々の方法は、産物特異的リガンドのサブキャリアタンパク質をスレッド化するために、花性タンパク質を使用する。同時に、単に、オペレータに即時かつ直感的なフィードバックを提供し、動員手順の視覚的な品質インジケータとして機能を追加します。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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