Name: 4-チウラシル(Ers4tU)を使用したビボにおけるRNAの非常に迅速かつ特異的な代謝標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: 学ぶ 4-チウラシルを用いたSaccharomyces cerevisiaeの新規転写RNAの迅速かつ特異的な精製法。短時間ラベリングと低バックグラウンドでパルス追跡実験を可能にする革新的な分子生物学技術です。

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この作品は、ウェルカムがJB[104648]に資金を提供して支援されました。細胞生物学のためのウェルカムセンターでの仕事はウェルカムコア資金[092076]によってサポートされています。著者らは、ベラ・モードリン、エマニュエラ・サニ、スザンナ・デ・ルーカス・アリアス、シャイニー・ジョージの助けを研究室のメンバーに認めています。著者はまた、プラスミドYEpEBI31111のためにパトリック・クラマーに感謝したいと思います.

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<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li>
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<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li>
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<li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+fast+and+incredibly+close%3A+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li>
<li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li>
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</ol>

著者は何も開示していない。

この記事では、非常に迅速かつ特異的な4tUラベリングのためのプロトコルを提示し、新生の回復のために、わずか15sのラベリング後にS.セレビシエから新たに合成されたRNAを、標識されていないRNAによる非常に低い汚染と共に提供する。
ユーザーは、常に低温およびDEPC処理試薬を使用してRNAの完全性を維持するように注意する必要があります。ストレプトアビジンビーズ精製は一般的に信頼できます。ただし、ビード バッファは処理が困難です。それは、そのコンポーネントが正しい順序で追加され、冷やされたりオートクレーブされていない、新鮮に作られる必要があります。一般的な障害には、RNAが沈殿ステップの後に不完全に溶解され、生分解されないか、処理ステップ中に失われるものが含まれます。補足資料には広範なトラブルシューティングのヘルプがあります。
ers4tU では注意が必要な制限があります。すでに述べたものの1つは、4tUが酵母の成長を遅らせることです(図1a)。内因性チオレートされたRNA9とは別に、ラベリング期間中に転写されたRNAのみがこの方法によって精製することができる。チオレーション時間を通じて遺伝子に一時停止したポリメラーサスは、精製可能なチオレート転写物を生成しませんが、チオレーション中にポリメラーが入ったり、一時停止状態を残したりして部分的に標識された転写物は回収できます。変異または増殖条件のために転写が不十分な株は、少しnsRNAを産生するが、ここで使用される技術は、他の方法と比較してnsRNAの回復を改善する。これらの菌株および条件においては、より長い時間および増加した培養量が必要であり、必要な場合がある。ウラシルは窒素の良い供給源であることに注意してくださいので、この方法は窒素飢餓を含む研究に使用される前に試されるべきです。
ers4tUプロトコルは、短命RNAの分析に特に有用であり、その多くは急速に劣化しているため、劣化機構を損なうことなく同定することができません。例としては、不可解な不安定転写物(CUTs)4、およびプロモーター(PROMPTs)19からの早期終了またはプロモーター近位休止18およびアンチセンス転写「上流」によって産生される短い転写物が挙げられる。安定したRNA種の処理中に産生される中間体も一過性であるが、ers4tU転写4を用いて濃縮することができる。したがって、ers4tUプロトコルは、非常に一過性のRNA種を分析し、他の方法に対して大きな利点である近くの生理学的条件下で捕捉することを可能にする上で例外的である。この技術は、通常の20よりも速くまたは遅く伸びるRNAポリメラーゼ変異体における転写および下流RNA処理動態を研究するために使用されてきた。
チオレーションはRNA-seqおよびSLAM-seq21とも互換性があり、非常に短い時間枠内で生産されるすべてのRNAが絶妙な細部で特徴づけられることを可能にする。

RNA は動的な性質を持っています。それは多くのRNAが急速に処理され、分解された後すぐに生成されます。現在、RNA代謝のほとんどの研究は、主に完全に処理され、安定した状態レベルで、総細胞RNAを分析します。このレベルは、転写後の成熟と劣化の速度のバランスに依存します。定常状態平衡につながるプロセスの分析には、非常に短命なRNA種を捕捉するための専門的な技術が必要です。
4-チオウラシル(4tU)または4-チウリジン(4sU)などのヌクレオチド類似体を有するRNAの代謝標識(優れたレビューについてはDuffy et al.1を参照)は、チオ標識付きの新生RNAとその処理中間体を単離する能力を提供する。しかし、公開されたプロトコルは、数分2、3のラベリング時間を含み、これは多くのトランスクリプトの生産速度に比べて遅いです。平均酵母遺伝子を転写するのに1分の順序で行われるので、酵母RNAを1分未満の標識は非常に短いと考えることができます。非常に迅速かつ特定の4 thiouracilプロトコル(ers4tU)は、4tUの組み込みを最大化し、ラベルなしの既存のRNAの回収を最小限に抑えることで、ノイズ比に信号を最大化し、非常に短いラベリング時間を可能にします4。
チオ修飾塩基は、新たに合成されたRNA(nsRNA)を効率的に標識するために、迅速かつ十分な量で細胞内に輸入されなければならない。これを促進するために、細胞はウラシルフリー培地で増殖し、適切なパーマーゼの発現は4tUまたは4sUの取り込みを高めるのに役立ちます(適切なパーマーゼ遺伝子および補足図1を運ぶプラスミドのリストについては、表1を参照)。4tUの水酸化ナトリウムの溶解度は、他のヌクレオチド類似体に必要な有毒な有機溶媒の必要性を回避します。残念ながら、50μMを超える濃度でチオ修飾ヌクレオシドを用いて長期間培養を増殖させることが観察され、リボソーム5を破壊することが観察されている。しかしながら、ここで用いる濃度(10μM)は、極めて短い標識時間と、有害な影響を最小限に抑えながら(図1a)、分析に十分なRNAを得ている。
この技術は、標的タンパク質6、7(図2)の迅速かつ特異的なアウクシン媒介破壊と組み合わせることができ、そのβ-エストラジオールがオーキシンの発現を調節する「β-est AID 4U」プロトコルと呼ばれる。誘導性デグロン(AID)システムは4tUラベリングと組み合わされます。β-est AID 4Uアプローチでは、標的タンパク質が枯渇し、RNA代謝に及ぼす影響を注意深くモニタリングすることができる(図2)。タイミングは重要です。付属のビデオを表示し、図 2とそのアニメーション形式に細心の注意を払うことをお勧めします (補足図 2を参照)。
正確な時間分解のためには、RNAの処理と劣化を非常に迅速に停止する必要があります。これは、低温でメタノールを使用して達成され、これは非常に迅速に細胞内容を固定し、核酸含有量8を維持しながら細胞膜を分解する。RNA抽出は効率的で、RNA を損傷しないようにする必要があります。機械的なライシスは、カオトロピック剤の不在で有効である(多くの場合、これらはチオ基を含むので、避けるべきである)。RNAの塩化リチウム沈殿が好ましく、tRNAの方が効率よく沈殿しがちである。tRNAは急速に転写され、自然にチオレートされる9なので、tRNAを除去すると、バイオチリン化試薬の競合が減少します。小さく、高度に構造化されたRNAが関心がある場合は、アルコールベースのRNA沈殿方法が推奨されます。
チオ化RNAを回収するために、ビオチンは4tUを有するRNAに組み込まれたチオ基を介して共生的に付着する。硬化性ジスルフィド結合を介して付着する修飾ビオチンの使用(例えば、HPDP-ビオチン(例えば、HPDP-biotin)-3/3(2-pイリジルdイチオ)pロピオナミド、またはMTS-ビオチン(メタンチオスルフォネート)が推奨される還元剤を添加してRNAの放出を可能にする。生体化RNAは、磁気ビーズに結合したストレプトアビジン上で精製された親和性である。このプロトコルは、前述の10に記載されている他のプロトコルに似ていますが、バックグラウンドを減らすために集中的に最適化されています。
チオールラベリング実験には、連続ラベリングと不連続ラベリングの2種類があります。それぞれに独自の利点があります。連続ラベリングでは、4tUが一定の間隔で採取された培養物およびサンプルに添加される。このタイプの実験は、RNAの処理方法と、時間の経過とともにレベルがどのように変化するかを示しています。例としては、変異体と野生型実験とパルスチェイス実験の比較が挙まれる。図3b,cに示す実験は、このタイプのである。不連続ラベリングの場合、変更はシステムに誘導され、RNA はモニターされます。変更が誘導されると、カルチャはいくつかのサブカルチャに分割され、特定の時間に、各カルチャは短時間でティオラベル付けされます。1 つの例は、図 27に示す β-est AID 4U です。この種の実験は、RNA処理に対する代謝変化の影響をモニタリングするのに特に有用である(図3d参照)。
チオラベリング実験のグラフィカルな表現を図4と図5に示し、プロトコルのパフォーマンスを大幅に簡素化するスプレッドシートを用意しています(4tU実験テンプレート.xlsxを参照)。補足情報には、広範なトラブルシューティング ガイドが含まれています。4tU ラベリングと auxin 枯渇プロトコルを統合する β-est AID 4U プロトコルについては、図 2および補足図 2を参照してください。詳細なAID枯渇プロトコルについては、Barrassら7を参照してください。

<table><tbody><tr><td>&β;-メルカプトエタノール (&β;ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>注意 有毒。標準的な解決はほぼ14 M、使用のための1/20の希釈で作</td></tr>る <tr><td></td><td></td><td></td><td>注意 有毒</td></tr><tr><td>なジエチルピロカーボネート(DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>解決に1/1000の容積を加え、室温で24時間置いて下さい。 その後、オートクレーブ</td></tr><tr><td>DMF(N,N-ジメチルホルムアミド)</td><td>&nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>注意 有毒</td></tr><tr><td>なEDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>水酸化ナトリウムで0.5 M、pH 8.0にする</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29221</td><td></td></tr><tr><td>EZ-link HPDP ビオチン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>21341</td><td>光から保護して保管してください。バイアルの内容物をすべて 22.7 mL DMF に溶解します(4 mM ストック溶液を調製するため)。水から離して、暗闇で、-20°Cで、HPDPの一部のバッチが貯蔵中に沈殿するため、使用する前に溶液を確認してください。42°Cの熱。C で再懸濁します。</td></tr><tr><td>グルコース</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン [20 mg/mL]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10901393001</td><td>-20 °C で保存;C</td></tr><tr><td>固定化 TCEP ジスルフィド還元ゲル</td><td>Thermo Scientific</td><td>77712</td><td>オプション</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793620</td><td>10 M 溶液。注意:これは溶解すると非常に熱くなり、100oCを超えると沸騰することさえあります。LiCl結晶をゆっくりと水に加えます。</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63033</td><td>1 M 溶液。注意:これは溶解すると非常に熱くなり、100oCを超えると沸騰することさえあり、MgCl2結晶をゆっくりと水に加えます。</td></tr><tr><td>メタノール</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>M/4000/PC17</td><td>注意 有毒で可燃性の</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>それぞれ1 M溶液を作り、等量で混合して適切なpHの溶液を得る</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-M</td><td>5 M溶液</td></tr><tr><td>フェノール、低pH。&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>4°Cの暗闇で保管してください。 注意 有毒</td></tr>な<tr><td>フェノールクロロホルム5:1(125:24:1)低pH。</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td>4°Cの暗闇で保管してください 注意 有毒</td></tr>な<tr><td>ピアススピンカラム</td><td>Thermo Scientific</td><td>69702</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>SCSMシングルドロップアウト &ndash;ura</td><td>フォーミディアム&nbsp;</td><td></td><td></td>DSCS101</tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32318-M</td><td>酢酸で 3 M 溶液と pH を 5.3 にします</td></tr> 水<tr><td>酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td>CAUTION 腐食性</td></tr><tr><td>SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td>CAUTION 刺激性、</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン磁気ビーズ</td><td>NEB</td><td>1420S</td><td>を 4&deg で吸い込まないでください。C&nbsp;</td></tr><tr><td>SUPERase-In, RNase阻害剤</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>AM2696</td><td>-20&degで保管。</td></tr><tr><td>C スパイク用チオレーテッド Schizosaccharomyces pombe</td> プロトコル 4-チオウラシル (4tU) <td>のセクション 1.7 を参照してください</td>。<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ACROS ORGANICS</td><td>359930010</td><td>暗闇の中でもお召し上がりいただけます。1M NaOHで100 mMストックを作成し、溶液を-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>1 M 溶液 各種</td></tr><tr><td>pH tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td>5mg/mL、-20°C;C</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>H2Oで1 M溶液を調製し、2 mLアリコートに分割し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>アミノ酸を含まない酵母窒素ベース&nbsp; 硫酸アモニウム</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Zeba カラム 0.5ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td>4 °C で保存。C&nbsp;</td></tr><tr><td>ジルコニア</td><td>ビーズ シスルサイエンティフィック</td><td>110791052</td><td></td></tr><tr><td>Equipment and Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beadbeater</td><td>Biospec</td><td>112011EUR</td><td>他のホモジナイザーを使用することができます。各ホモジナイザーとひずみの正しい条件を確立する必要があります。</td></tr><tr><td>バイオアナライザー(Agilent)または同様のRNAの品質を評価します。これが重要でない場合は、分光光度計がRNAの定量に役立ちます。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機:4°Cで培養物を回転させることができます。Cと少なくとも3000g。可能であれば事前に冷やします。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機:最大2 mLのチューブを最大13,000 gから1000 gまでの可変速度で回転させることができます。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サンプルからビーズを分離するための磁気ラック。紙に使用されているものは3Dプリントされており、Thingiverse(thing:3562952)から入手できます。市販のラックが存在します&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>暗闇でのインキュベーションを可能にする加熱された蓋付きのPCRマシン。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mLチューブを端から端まで回転させる回転ホイール&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>振とう加熱ブロック(Eppendorf Thermomixerなど)をお勧めします&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ、遠心分離機、低保持、RNaseフリー0.5mL</td><td>Eppendorf</td><td>H179467N</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、遠心分離機、低保持、RNaseフリー1.5mL</td><td>Ambion</td><td>AM12350</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、遠心分離機、50mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>他の遠心分離管は、CO2をメタノールに溶解させるガスプルーフではありません。これは、温かい培養物を追加すると激しく溶液から出てきます。サンプル損失につながります</td></tr><tr><td>チューブ、遠心分離機、15 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、2 mL、スクリューキャップ</td><td>Greiner</td><td>723361</td><td></td></tr><tr><td>チューブ 0.2 mL ストリップ 8 個入り、一体型蓋付き</td><td>ブランド</td><td>781332</td><td></td></tr></tbody></table>

4-チウラシル(ers4tu)を使用したビボにおけるrnaの非常に迅速かつ特異的な代謝標識

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

ヌクレオチド類似体である4-thiouracil(4tU)は、細胞によって容易に取り込まれ、生体内で転写される際にRNAに組み込まれ、ラベリングの短い期間中に産生されるRNAの単離を可能にする。これは、組み込まれたチオ群にビオチンモイエティを付着させ、親和性精製を、ストレプトアビジン被覆ビーズを用いて行う。既存のRNAを含まない純粋で新しく合成されたRNAの良好な収率を達成することで、ラベリング時間を短縮し、運動学的研究における時間分解能の増加を可能にします。これは、新たに合成されたRNAの非常に特異的で高収率の精製のためのプロトコルである。ここで提示されるプロトコルは、酵母サッカロマイセスセレビシエからRNAを抽出する方法を説明する。しかし、全RNAからチオ化RNAを精製するためのプロトコルは、細胞から抽出された後、任意の生物からのRNAを使用して有効であるべきである。精製されたRNAは、逆転写酵素-qPCR、RNA-seqおよびSLAM-seqなどの多くの広く使用されている技術による分析に適しています。この技術の特異性、感受性および柔軟性はRNA代謝に比類のない洞察を可能にする。

このers4tUプロトコルを用いて回収されたnsRNAの典型的な収率は図1bに表示され、これはバイオアナリサータによって生成され、トレースはRNA対サイズ(ヌクレオチド[nt])の収率を示す。なお、バイオアナライザトレースとインセットグラフの両方において、タイムポイント0からのRNA回収は、より長い時点から回収されたもののごく小さな部分であり、約10 9μgのRNAが約109μgと比較して2倍以上に増加した。同じ数の細胞からのラベリングのわずか30s(nsRNAの0.8 μg)の後。15sでのRNA回収は、サンプリングを行う際の小さな違いがRNA回収に比例して大きな影響を及ぼすため、より可変的である。バイオアナリサータトレースでは、rRNA前駆体は1000nt付近のピークと1700−1800 ntのピークの二重として見ることができます。これらの中間体の豊富さは、チオレーションが続くにつれて増加します。
チオラベリングは、ACT1トランスクリプトのスプライシングを定量するために使用されました(図3)。チオレーションを行い、チオ標識の開始から15秒間隔で採取した試料及びACT1 RNAの処理を監視した(図3a,b)。ごく一見、プレmRNAは(転写によって)生成され、ラリアット(プレmRNAからのスプライシングの最初のステップによって)、わずか15sのラベリングの後でさえも。約45~1分後、ラリアットとプリmRNAの量は平衡に達し、これらのRNA種の多くはスプライシングによって処理されるのと同じくらい転写によって作成される。
図3cに示すデータを生成するために、株を25sの4tUでパルスし、次いでウリジンで追いかけた。プレmRNAおよびラリアットの生成は1分で最大に達する。これは図 3bとよく比較されます。45s後に達成される最大値は、平衡に加えてラベリングの25sに達する。ピーク後、チオラベル付きRNAがスプライシングプロセスを通じて追いかけるにつれて、レベルは低下します。
図3dは、β-est AID 4U系6、7を用いて、タンパク質スプライシング因子の枯渇およびRNA代謝への影響を示す。ここで、Prp16pは、枯渇の25分後にこのレベルの近い生理学的レベルから5%に減少する。Prp16p は、スプライシング15の 2 番目のステップに不可欠なスプライシング係数です。ラリアットはスプライシングの2番目のステップ(図3a)の間に除去されるが、ここではPrp16が制限されるにつれて、前mRNAのレベルを上回る。その後の枯渇時には、他の要因が二次的な影響によって制限され、ラリアットのレベルが低下し、mRNA前のレベルが上昇する。スプライスされたmRNAのレベルは低下する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> 図1:4tUおよびRNA回収における成長(a) 4-thiouracilは成長に影響を与える。ウラシルを含まないYMMドロップアウト成長培地中の4tU濃度を増加させると、p4FuiΔプラスミドを運ぶS.セレビシエ(BY4741)の倍増時間が増加する。4つの複製培養の成長をテカン無限プロ200で30°Cでモニタリングした。すべてのカルチャはログ フェーズ全体にあり、OD600は 0.1 ~ 0.6 でした。モックは、同等の量のNaOHを追加したコントロールカルチャであり、それ自体は成長率を変更しません。このグラフは、チオラベリングが急速な標識と細胞への損傷との間で妥協していることを示しています。誤差余数は、4 反復の標準誤差です。(b) nsRNA収率は約15sのラベリングから直線的に増加する。主な図は、精製されたバイオアナライザの痕跡を示し、nsRNAを0(チオレートされていない)から15秒間隔で4tUを添加した後2分までを示す。15sサンプルはラベル付けされていないサンプルと区別がつかないため、表示されないことに注意してください。2つの大きなピークはリボソームRNA(rRNA)に対応しています。rRNA前駆体および中間体は、成熟したrRNAよりも大きな分子量で複数のピークとして見える。これらの前駆体および中間体の回復は時間とともに増加する。1つの代表的な実験の結果が示されている。インセットグラフは、4tUでインキュベーションを増加させるnsRNAの回復を示す。nsRNAの収率は、4tUで成長の時間が増加するにつれて増加する。この実験のタイムスケール全体を通して回復は著しく直線的(R2 = 0.934)であり、バイオアナライザからの目でラベル付けされていないサンプルと区別できないにもかかわらず、4tUで15sラベリングでもバックグラウンド上のわずかな増加を示しています。トレース。誤差バーは、3つの生物学的反復の標準誤差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> 図2:βエストAID 4Uβ-est AID 4Uグラフィカルプロトコル。β-est AID 4U プロトコルのプロトコルのグラフィカルな要約。β-エストラジオール(β-est)は、AID*タグ付き標的タンパク質を枯渇させる補助誘導性デグロン(AID)系の発現を促進し、詳細なプロトコルについてはBarrass et al.7を参照してください。この場合、デグロン系発現はタンパク質分解が始まる25分前に開始され、各時点でのチオレーションは1分間です。補足図 2にアニメーション版が表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> 図3:ACT1 RNAスプライシングの前駆体および中間体。 ACT1前mRNA転写物のスプライシングは、定量的逆転転写PCR16によってモニターした。ACT1前駆体(前mRNA)、中間ラリアットエキソン2(ラリアット)およびスプライス産物(mRNA)のレベルは、ACT1 Exon2のレベルおよびこれらのRNAの定常状態レベルに対して正規化されたことが示されている。(a) ACT1トランスクリプト上のqPCR製品の場所。ACT1転写産物16のスプライシング反応の前駆体、中間体および産物のレベルをアッセイするために使用されるqPCR産物の位置の概略図。エクソンは箱で表され、ラインとしてイントロン、qPCR製品は両端にダイヤモンドを持つラインとして表され、色はグラフで使用されるものと一致します。プレmRNA PCRは、プリmRNAに特異的であり、この製品がスプライシングの最初のステップの後に中断される分岐点を横切るため、スプライシングの任意の中間体ではありません。ラリアットPCRは、スプライシングの第1段階の産物と、第2の後に産生される切除ラリアットを検出する。mRNA PCRは、スプライシング、mRNAの積に特異的である。エクソンPCR(取除きラリアットを除くすべての前駆体、中間体および製品に存在する)からの結果は、データを正規化するために使用されたため、常に1に等しいため、グラフには表示されません。(b) 連続チオラベリング。4tUが転写によって組み込まれると時間とともにmRNAの量が増加し、短い遅延の後、スプライシングはそれをlariat-exon2中間およびスプライスされた製品に変換する。これらの前mRNAおよびラリアット種のレベルは、4tUで成長のわずか15sの後にバックグラウンドの上に検出され、4tUとの連続的な標識の約45s後に最大に達し、その時点でその生産はスプライスへの変換によってバランスが取れていますmRNAおよび/または分解。値は定常状態(グラフの左端)に正規化され、exon 2レベルはエキソン2の転写と比較してその外観と処理を示す。ACT1のRNAスプライシングは、主に共写性4、17スプライスmRNAが急速に最も豊富な種となり、そのレベルはエキソン2のものと同様である。3つの生物学的反復の標準誤差は、それぞれが三量体でアッセイされる。(c) パルス/チェイス。25秒のチオレーションパルスに続き、ウリジンで追いかける。これらのRNAの定常状態レベル(左端点)と比較して、新しく合成されたプールでは、最初は非常に豊富です。それらはmRNA(または分解)に処理されるにつれて徐々に低下し、5分の定常状態レベルに非常に類似したレベルに近づき、3つの生物学的反復の標準誤差、それぞれが三極化でアッセイされる。(d) nsRNAおよびタンパク質枯渇。図2に記載されているオーキシンデグロン系を用いたPrp16タンパク質の枯渇時のパネル(a)のように定量的逆転転写PCRによってモニターされたACT1プレmRNA転写物のスプライシング。 Prp16タンパク質レベルは、オーキシン枯渇前のレベルのパーセンテージとして第2のY軸に対してプロットされたグラフにも表示されます。Prp16は、パネル(a)に示すスプライシングの第2段階において特に重要なスプリセオソームの重要な構成要素であり、その後ラリアットが分解される。このステップが制限になると、ラリアットは最初に蓄積します。後でスプライシングが完全に失敗し、ラリアットはもはや産生されなくなり、mRNA前のレベルは上昇する。誤差バーは、3つの生物学的反復の標準的な誤差であり、それぞれが三量体でアッセイされる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> 図 4: プロトコル セクション 1 から 3 のグラフィカルな概要。細胞を4tUでチオレートし、改変ヌクレオチドをRNAに組み込むために増殖させた。チオレートされたS.ポンベスパイクを追加して、時間ポイントと実験を通じて正規化することができます。4tUのパルスは、非チオレートウリジンを使用して追うことができる。ラベリングは、4tU添加から継続的に行うことができるか、または成長条件の変化から、培養分割および4tUは成長条件の変化から増加する時間に培養物に加えられるが、各ラベリングは短時間のみである。細胞を採取し、細胞から調製したRNAを、ホモジナイザーおよびフェノール系の方法を用いることに好ましい。RNAはビオチン化され、次いで、サイズ排除カラムを用いて非組み込みビオチンから精製されたビオチン化RNAを精製する。nsRNAは、ストレプトアビジンビーズで精製する準備ができました(セクション4、図5)。赤色の数字は、プロトコルのステップ番号に対応します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> 図 5: プロトコル セクション 4 のグラフィカルな概要。セクション1から3(図4)に続いて、ストレプトアビジンビーズがブロックされ、ビオチン化されたRNAサンプルが調製されたビーズに添加される。生体化RNAは、ストレプトアビジンビーズと非ビオチン化RNAを除去して洗浄して結合する。ビオチン化RNAはβMEを用いてビーズから照出され、さらなる研究の準備が整った。赤色の数字は、プロトコルのステップ番号に対応します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:チオ標識の1分および3分間の輸入者の追加コピーの有無にかかわらず酵母細胞からのnsRNA回収の改善。なお、Fui1は2μmプラスミドから発現した酵母自身のプロモーターである。この遺伝子のゲノムコピーは、これらの株の両方に存在する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:βエストAID 4Uβ-est AID 4Uグラフィカルプロトコルのアニメーション版。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1: 4tU_実験_テンプレート.xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>プラスミド名</td>
			<td>輸入者/パーマイーズ</td>
			<td>マーカー</td>
			<td>コメント</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4フイ</td>
			<td>
S.セレビシエ・フイ1</td>
			<td>ウラ3</td>
			<td rowspan="2">Fui1はウラシルとウリジンを輸入し、パルス/チェイス実験に最適です。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S.セレビシエ・フイ1</td>
			<td>ルー2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4フイ-ΔPEST</td>
			<td>
S.セレビシエ・フイ1</td>
			<td>ウラ3</td>
			<td>Fui1のPESTモチーフは非活性化されているので、細胞のニーズに十分な細胞内ウラシルがある場合、パーマシーは分解されません。ラベリング実験でうまく機能し、パルス/チェイス性能を向上させます。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4ファー</td>
			<td>
S. セレビシエ・ファー4</td>
			<td>ウラ3</td>
			<td>ウラシルパーマーゼ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">イェペビ311</td>
			<td>H. サピエンス ENT1</td>
			<td rowspan="2">ルー2</td>
			<td rowspan="2">ミラーら11.また、HSVチミジンキナーゼ遺伝子も含まれています。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(平衡核サイドトランスポーター)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">すべてのプラスミドは2 μmベースである。すべてのp4プラスミドおよびpATはプラスミドのpRS16シリーズに基づいている。FUI1およびFUR4は、独自の内因性プロモーターから発現される。</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表1:このプロトコルで使用されるプラスミド。

酵母サッカロマイセスセレビシエから新たに転写されたRNAを敏感かつ特異的に精製するためにチオレートされたウラシルを使用する。

4-チウラシル(Ers4tU)を使用したビボにおけるRNAの非常に迅速かつ特異的な代謝標識

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

この方法は、新たに合成されたRNAをこのような短い時間スケールで分析することを可能にするプロトコルがなく、そのような短いパルスでパルスチェイス実験を可能にするため、重要です。このプロトコルは、ベストエイド4Uプロトコルなどのタンパク質枯渇に適しています。主な利点は、背景が低いということです。これは、ほぼすべての非thiolated RNAを除去することによって、短い標識時間を可能にする。また、このプロトコルでは、実行できるさまざまな種類の実験と、それらをこの手法に統合する方法についても詳しく説明しています。この手順を開始するには、YMM培地で酵母を0.6と0.8の間のOD 600に成長させます。ヒュームフードに、目的のサンプル量の30〜50%に相当するメタノールを50ミリリットルチューブに加えます。チューブをしっかりと閉じ、ラベルを付け、ドライアイスの上に置いて冷やします。次に、サンプルの長期保存のために2ミリリットルのチューブにラベルを付け、冷却するために氷の上に置きます。2ミリリットルのチューブにジルコニアビーズを追加します。氷の上のサンプルあたり少なくとも1ミリリットルの水を冷却します。S.pombeスパイクを培養物に添加する場合は、チオラ化されたS.pombe細胞のアリコートを氷の上に置いて解凍します。解凍されたアリコートを渦に入れ、文化に加えます。その後、培養物に4tUを10マイクロモルの濃度に加え、激しく混ぜます。15秒から5分の間の時間の長さのチオラベル。時間コースの終わりまで一定の間隔で文化のサンプルを取ります。各サンプルを、メタノールを含む調製された遠心管の1つに加えます。各チューブを密封し、十分に混ぜ合わせて振り、ドライアイスの上に置きます。すべてのサンプルが採取されたら、それらをすべて氷の上に置きます。いずれのサンプルも凍結されていないことを確認します。凍った方は、絶えず逆に手でやさしく温めます。細胞を3,000倍gで遠心し、摂氏4度で2分間ペレットします。液体を注ぎ、ペレットを少なくとも1ミリリットルの氷冷水に入れ、上下に激しくピペットを入れます。準備されたスクリューキャップチューブにサスペンションを移し、チューブを氷の上に置きます。サンプルを13,000グラムを超える速度で短時間遠心し、細胞を再ペレット化する。その後、氷の上に戻し、液体を取り除きます。まず、400マイクロリットルのAEバッファー、40マイクロリットルのSDS、および800マイクロリットルのフェノールを低pHで加えます。10 秒間ボルテックスで再中断します。その後、最も低い電力設定で3つの2分間のバーストのためにホモジナイザーで細胞をlyseします。均質化パルスの間に2分間氷の上にサンプルを残します。溶かした細胞を固まるまで5分間ドライアイスの上に置きます。次に、マイクロ遠心分離機を使用して、室温で5分間13,000回以上gの速度で細胞を回転させます。この後、テキストプロトコルで概説したように、フェノールクロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を行う。10モルクロリトの体積の1/3〜1/2の間に加え、混合してRNAを沈殿します。5分間13,000回以上の速度で遠心分離機。流体を取り除き、サンプルを一時的に再スピンしてドレッグを取り除きます。その後、ペレットを70%エタノールの300~500マイクロリットルで洗浄する。洗浄したペレットを短く遠心分離し、残ったエタノールを除去する。振りながら摂氏65度で加熱して、90マイクロリットルのTEでRNAペレットをpH 7.0で再溶解します。完全なRNA可溶化を確認した後、懸濁液を0.2ミリリットルチューブに移します。まず、10マイクロリットルのHPDP-ビオチン溶液をRNAに添加してビオチン化し、十分に混合します。暗闇の中で摂氏65度で15~30分インキュベートします。次に、少量の樹脂容積、サイズ除外カラムを用意し、非法人ビオチンを除外する。柱の底部タグを取り外し、キャップを緩め、2 ミリリットルの遠心管にカラムを入れる。遠心分離機を1,500回gで1分間バッファを洗い流し、フロースルーを破棄する。その後、静かに列の上部にTEの0.3ミリリットルを追加し、同じ条件を使用して再び回転します。洗浄したカラムを1.5ミリリットルの新鮮なチューブに移します。サンプルインキュベーションが完了したら、カラムの上部にサンプルを追加します。1,500回gで遠心分離機を2分間、ビオチン化RNAサンプルをチューブの底に残した。列を破棄します。そして、試料を含むチューブに10モルクロリチの1/3~1/2体積を加えます。混合してRNAを再沈殿します。まず、200マイクロリットルのDEPC処理水にRNAを再溶解する。RNA濃度を測定し、すべてのサンプルに対して同量のRNAを与える各サンプルの体積を計算します。この量のRNAを新鮮なチューブに加え、DEPC処理水を合計容量200マイクロリットルまで添加します。試料が室温の場合は、10 x NaTMバッファーの25マイクロリットル、リン酸ナトリウム1モル25マイクロリットル、10%SDSの2.5マイクロリットルを加えます。十分に混ぜ合わせ、約100倍gで30秒未満で遠心分離機を軽く混ぜます。1 つの x NaTM バッファー、0.1 モルリン酸ナトリウム、および 0.1%SDS を使用して、各サンプルに 2 ミリリットルのビーズ バッファーを準備します。ストレプトアビジンビーズ50マイクロリットルを低保持1.5ミリリットルチューブに加えます。チューブを磁気ラックに置き、ビーズが落ち着くのを待ちます。その後、吸引によって流体を除去する。ビーズを洗浄するには、ビーズペレットが完全に再懸濁されるまで、200ミリリットルのビーズバッファーと渦を加えます。チューブを約100倍gで最大5秒間遠心分離する。マグネットラックにチューブを置き、ビーズを磁石で取り込みます。サンプル数が少ない場合は吸引によって流体を除去します。多くのサンプルがある場合は、流体を注ぎ、その後吸引します。200マイクロリットルのビーズバッファー、10マイクロリットルのグリコーゲン、2.5マイクロリットルのtRNAをブロックします。室温で20分間インキュベートし、終わりを適度な速度で回転させます。この後、流体を取り除き、テキストプロトコルで概説されているように、もう一度洗います。サンプル中のビーズを再懸濁し、回転しながら室温で30分間インキュベートする。このインキュベーションの間に、各サンプルのための新鮮な1.5ミリリットルの管を準備する。pH 5.3とグリコーゲンの20マイクログラムで酢酸3モルの1/10容量を追加します。遠心分離機は約100倍gで3秒間行う。ビーズから非結合RNAを取り出し、テキストプロトコルに記載されているように洗浄します。RNAを溶出するには、作りたての0.7モルベータメルカプトエタノールをビーズに50マイクロリットル加えます。ボルテックスと遠心分離の後、スラリーを磁気ラックに入れる。調製した1.5ミリリットルの遠心分離管に溶液を含むRNAをピペット。前述のようにもう一度エルルート。次に、サンプルを磁気ラックに戻して溶出したRNAから残留ビーズを取り除き、液体を新鮮で低結合の0.5ミリリットル遠心管に移します。サンプルを混ぜます。そして、2.5容量のエタノールを加え、nsRNAを沈殿させます。混合およびインキュベート後、遠心分離機は少なくとも13,000回gの速度で、摂氏4度で20分間。このプロトコルを用いて回収されたsnRNAの典型的な収量を以下に示す。なお、ポイントゼロでのRNA回収は、約300億個の細胞から回収されたRNAのわずか0.3マイクログラムで、より長い時点から回収された部分のごく一部です。しかし、わずか30秒の標識の後、同じ数の細胞から2倍以上のRNAが収集されます。バイオアナライザーのトレースでは、RNA前駆体は1,000ヌクレオチド付近のピークと1,700〜1,800ヌクレオチドのピークの二重と見なすことができます。これらの中間体の豊富さは、チオラクションが続くにつれて増加します。次いで、チオ標識の開始から15秒間隔で採取されたサンプルでチオラ化が行われ、ACT1 RNA転写物の処理が監視されます。見られるように、プレmRNAおよびラリアットは、標識のわずか15秒後でも生成される。約45秒から1分後、ラリアットとプレmRNAの量は、スプライシングによって処理されるのと同じくらい転写によって作成されるこれらのRNA種の多くと均衡に達する。最も困難なステップは、ビーズ、洗浄、およびブロッキングを含むステップです。ビーズを失わないように注意するか、それらを乾燥させてください。新しく合成したRNAを精製したら、従来のRNA分析手順を使用できます。RNAは生体アナライザまたは類似の状態で実行することをお勧めします。その後、通常、QPCRとRNA-Seqを使用してRNAを分析します。この方法は、RNA処理の動態を分析するのに理想的であることが判明した。最も危険なステップは、RNA抽出でフェノールとクロロホルムを使用するステップです。これらの化学物質を密封されていない容器に入れて使用するときは、フームフードで使用し、適切な防護服、ラボコート、手袋を着用してください。スクリューキャップチューブの糸にジルコニアビーズが入っていないので、漏れにつながるので、特に注意してください。

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