DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

このプロトコルは、凍結組織の使用が複数の組織を評価する際の物流を簡素化し、分析のために遠隔実験室へのサンプル転送を可能にし、数ヶ月間組織を分析する決定を延期することができるので重要である。この技術の主な利点は、凍結キューブ組織を使用することは、壊死時に彗星アッセイで訓練された人員を必要とせず、サンプル操作中に導入された技術的な誤りおよび機械的DNA損傷の機会を最小限に抑えることです。この技術は、前臨床薬の開発、環境に入る化学物質の安全性評価、および食品添加物に適用されています。

凍結組織は、遺伝子毒性ポテンシャル、DNA修復、化学療法や放射線によるDNA損傷に対する保護効果、および環境バイオモニタリングの評価に使用できます。理想的には、実験は、次の動物から採取された臓器が処理可能になる前に、凍結ステップに各組織サンプルの処理を可能にするように設計されるべきである。凍結組織は、遺伝子毒性ポテンシャル、DNA修復、化学療法または放射線によるDNA損傷に対する保護効果、および環境バイオモニタリングを評価するために彗星アッセイで訴えることができます。

テクニカルトレーナーのキャロル・ボビットと調査毒物学ラボマネージャーのアイリーン・ギラスが今日プロセクターを務める予定です。リサーチアソシエイトのリンカーン・マーティンと組織学の技術者アメリ・ラデッサーがサンプルハンドリングをデモンストレーションします。この手順を開始するには、関連付けられた接続組織、臓器、および破片を目的の器官から取り除きます。

残りの血液および破片を除去するために、約7ミリリットルの冷たい、作りたてのミンチ液を含む中型の重量を量るボートですぐに激しく臓器をスウィッシュする。十分な冷たいミンチ溶液を含む別のクリーンな重量を量るボートにオルガンを移し、組織を水没させ、さらに処理するまで氷の上に維持する。肝臓の場合は、左葉の5ミリメートルの縦断を切断し、約7ミリリットルの冷たいミンチ溶液をそっとスウィッシュします。

その後、約7ミリリットルの冷たいミンチ溶液を含むきれいな中型の計量ボートにティッシュのストリップを置き、さらに処理する準備ができるまで氷の上に維持します。肝臓の一部を取り除き、埋め込みカセットに入れる。将来の病理評価のために実験室標準手順に従って固定、トリミング、パラフィンの埋め込みを行います。

十二指腸の場合、胃に近位の十二指腸の10ミリメートルの部分を切断します。十二指腸の一方の端に21〜25ゲージの針を挿入し、任意の破片や細菌を除去するために冷たいミンチ溶液の1ミリリットルでそれを洗い流します。十二指腸をひっくり返し、もう一度1ミリリットルのミンチ溶液で洗い流し、針を捨てます。

十二指腸を切開し、約7ミリリットルのミンチ溶液ですすります。その後、再び十二指腸をすすい、さらに処理する準備ができるまで氷上のミンチ溶液でそれを維持します。肝臓について以前に説明したように、将来の組織病理学的評価のために残りの十二指腸の一部をカットして固定する。

脳の場合、最初に脳を2つの半球に分け、1つの半球が組織病理学のために保存されているのが有用である。関心のある脳領域を解剖し、それらを穏やかに洗い、肝臓と十二指腸について先に述べたように、さらに処理する準備ができるまで、氷の上でミンチ溶液を維持する。胃のために、前胃を取り除いて捨てます。

腺胃を切り開き、約7ミリリットルの冷たいミンチバッファーを含む中型の計量ボートでスウィッシュして食品から自由に洗います。前述のように、組織病理学の評価の可能性を固定するために、十二指腸に近位する腺胃の5ミリメートルストリップを取り除く。残りの胃を約7ミリリットルの冷たいミンチバッファーを含む中型の計量ボートに入れ、氷の上で15〜30分間インキュベートします。

この後、お腹をきれいなパラフィンに移し、メスの刃またはプラスチックセルスクレーパーを使用して、表面上皮を少なくとも2回静かに掻き取り、破片を取り除きます。鉗子で胃粘膜を拾い、冷たいミンチバッファーの1ミリリットルでそれをすすいでピペットを使用しています。すすった胃組織をきれいな表面または皿に移し、冷たいミンチ液を加える。

メスの刃またはプラスチックセルスクレーパーの裏を使用して、胃上皮を4~5回慎重に掻き取り、細胞を放出します。次いで、ピペットを用いて、放出された細胞を含むミンチ液を回収し、氷上のマイクロ遠心チューブに移す。組織サンプルを細かくする場合は、肝臓、脳、または十二指腸の一部を切断し、冷たいミンチ溶液の1ミリリットルを含む標識されたマイクロ遠心分離管に移す。

サンプルが冷たく保たれる一方で、サンプルが最終的に分散されるまで迅速にミンチするハサミを使用してください。サンプルは少し曇って見えるはずです。しかし、チューブの底に落ち着くいくつかの部分が残ることは一般的です。

新鮮な間に組織を使用するには、氷の上にサンプルを含むチューブを維持します。組織サンプルを凍結するには、ミンチまたは採取直後にチューブの蓋を固定し、液体窒素を含むデュワーフラスコにチューブをドロップします。組織の収穫の終わりに、サンプル管を取り出すために取鍋を使用し、並べ替えるためにドライアイスの上に置きます。

チューブをドライアイスの冷凍庫に移し、箱をマイナス80度で冷凍庫に保管します。組織の凍結キューブを調製するには、いくつかの小さな組織を切断し、液体窒素を含む中型の計量ボートまたは他の適切な容器に数秒間直接それらを直接落とします。破片が完全に凍結した後、凍結した組織キューブをドライアイス上のラベル付きマイクロ遠心チューブ(クライオチューブ)に個別に移します。

組織の収穫の終わりに、ドライアイスの冷凍庫ボックスにチューブを移し、マイナス800°Cの冷凍庫に箱を保管します。湿った氷の上に維持され、みじん切りまたは掻き取ったティッシュを使用する場合は、収穫から1時間以内に彗星のスライドを準備します。凍結したひき肉または擦り傷した組織を使用する場合は、凍結した組織のチューブを室温の水浴に入れ、サンプルが完全に解凍されるまで、冷たく保たれます。

サンプルが解凍されたら、すぐにチューブを氷の上に移します。立方体組織の場合、キューブを含むチューブを冷凍庫から取り出し、スライド準備までドライアイスで維持します。アリコート 1 ミリリットルの商人の培地またはミンチ溶液を各サンプルに対してラベル付けされた 1.7 ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにし、氷の上に維持します。

解凍を避けるために迅速に働いて、室温組織ミンチ装置の開いた端に組織の立方体を置く。素早くサイズに一致したシリンジプランジャーをデバイスに挿入して、組織をメッシュ端に押し込み、冷たいミンチ液を含むマイクロ遠心管に入れる必要があります。冷たいミンチ液に約5〜10秒間デバイスのメッシュ端を浸し、組織を完全に解凍できるようにします。

細胞がメッシュの毛穴を突き出して見えるまで、プランジャーを完全に押し落とします。その後、プランジャーを約2.5センチメートル引き上げ、再び完全に押し下げてください。数回繰り返し、ミンチ液が濁るまで繰り返す。

スライドを調製するには、セル懸濁液を穏やかに混合し、摂氏37度で0.5%低融点アガロースの450マイクロリットルを含むチューブに50マイクロリットルを移す。テキスト プロトコルで説明されているスライドを準備し、スコアを付けます。最初の研究では、肝臓は1週間ずらした雄のスプレイグドーリー車両制御ラットの2つのコホートから収穫された。

スライドは、挽きたてのティッシュ、凍結したひき肉、および凍結立方体組織から調製した。OECDは新鮮なラット肝臓におけるテールDNA%の上限を推奨しているため、これらの結果は、凍結方法のいずれかが組織の評価にうまく機能することを示している。全体として、ヘッジホッグ率はテールDNAの%と平行していたが、凍結組織は大きな変動性を示した。

2番目の研究では、雌のB6C3F1マウスを、その車両またはムタゲンエチルメタンスルホン酸を投与した。%尾部DNA結果は、肝臓組織がキューブとして凍結し、その後組織ミンチ装置を用いて処理され、新たにひき肉組織について得られたものと非常によく似た結果をもたらすことを示している。EMS誘発DNA損傷の統計的に有意な増加を、3つの方法すべてで処理された組織サンプルで測定した。

3番目の研究では、90日間の化学毒性試験で雌のB6C3F1マウスから採取された肝臓サンプルを分析した。凍結したひき肉組織におけるDNA損傷は、動物の変動に対して実質的な動物を有する、すべての用量群にわたって高かった。テールDNAの結果の割合はハリネズミの割合と相関し、ハリネズミがこれらのサンプルで観察された高レベルのDNA損傷に実質的に寄与したことを示している。

対照的に、DNA損傷とハリネズミ%の両方は、ひき肉サンプルと並行して調製されたフラッシュ凍結立方体組織において非常に低かった。したがって、ひき肉サンプル中のハリネズミとして現れた損傷の強い細胞は、明らかに生物学的プロセスの結果ではなく、機械的破壊、または、フラッシュ凍結される前のミンチ処置中の組織温暖化によって導入された可能性が高かった。したがって、ひき肉のデータは信頼性が低いと考えられた。

それに比べて、長期間保存した後でも、凍結された立方体組織から高品質のデータを得た。収穫した組織を冷たく湿らせた状態に保ち、サンプルを凍結するために迅速に作業することが重要です。また、凍結した立方体組織は、均質化工程の直前に解凍する必要があります。

凍結組織試料は、例えば、酸化的損傷または架橋を検出するための彗星アッセイの改変、および遺伝子発現の変化の評価を含む他の下流の適用に適している。メスの刃を取り扱って組織を切ったり掻き取ったりする際、および凍結プロセス中に液体窒素を取り扱う際には注意が必要です。