Name: DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぶ彗星アッセイにおける凍結組織の調製法。肝臓や脳などの組織をミンス、キューブ、または細胞採取して凍結保存し、DNA損傷評価や遺伝毒性試験に活用できます。

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著者らは、リンカーン・マーティンとケリー・オーエンズに対し、彗星スライドの準備と採点に関する専門的な技術支援と、統計分析を行うためのキャロル・スワルツ博士に恩恵を受けている。著者らはまた、ILSの遺伝的毒物学、調査毒物学、および壊死プログラムのメンバーの支持的な貢献を認めている。

組織は、グッドラボラトリー実践規則(21 CFR Part 58)および施設動物によって承認された動物使用プロトコルに従って、NTP契約研究所のAAALAC認定施設で行われた研究の実施中に収穫された各研究室のケア・使用委員会(IACUC)
1. 組織の収穫と加工
注:サンプルチューブ(例えば肝臓)を調製したり、サンプルの約半分を別の貯蔵管(例えば、十二指腸、胃)に移して、必要に応じて再分析を可能にするのに有用である。腸管組織のサンプル間変動の可能性を最小限に抑えるために、各動物の胃に対して同じ組織領域をサンプリングし、サンプルを分割して重複サンプルを生成することを注意してください。プラスチック鉗子は、脳などの粘着性の組織を移すため推奨されます。オプションとして、ミンチ、掻き取られた、または均質化された組織製剤は、円錐管に取り付けられた40μmの細胞ストレーナーを使用して均質な単一細胞懸濁液を達成するために濾過され得る。
<ol><li>関連する組織、臓器、破片を、目的の器官から取り除きます。取り外し直後に、残りの血液および破片を除去するために、冷たく作りたてのミンチ液の〜7 mL(Mg++、Ca++およびフェノール赤自由ハンクのバランス塩溶液、10%v/v DMSO、および20 mM EDTA pH 7.5)を含む中型の重量船で臓器を激しくスウィッシュします。</li>
	<li>各臓器を、さらに処理するまで、氷上で、水没した組織を維持するのに十分な冷たいミンチ液を含む別のクリーンな重量のボートに移す。</li>
	<li>目的の各器官のセクションを取り除き、埋め込みカセットに入れる。可能な将来の病理学的評価のための実験室の標準的なプロシージャに従って10%中性緩衝ホルマリン、トリムおよびパラフィン埋め込みで修正する。</li>
	<li>肝臓の場合は、左葉の5mmの縦断面を切断し、冷たいミンチ溶液の〜7 mLを穏やかにスウィッシュします。冷たいミンチ液の〜7 mLを含むきれいな中型の重量を量るボートにティッシュのストリップを置き、さらに処理する準備ができるまで氷の上に維持する(ステップ1.8または1.11)。</li>
	<li>十二指腸の場合は、胃に近位の十二指腸の10mmの部分を切断します。21~25Gの針を使用して、残骸や細菌を除去します。
	<ol>
<li>十二指腸の一端に針を挿入し、冷たいミンチ溶液の1 mLで洗い流す。</li>
		<li>十二指腸をひっくり返し、別の1 mLのミンチ溶液で繰り返して、他の方向を洗い流します。針を捨てます。</li>
		<li>十二指腸をスライスし、洗浄液の〜7 mLを含む中型の計量ボートに入れる前に、〜7 mLのミンチ液でそれを洗いす。さらに処理する準備ができるまで氷の上に維持する(ステップ1.8または1.11)。</li>
	</ol></li>
	<li>脳の場合は、最初に脳を2つの半球に分けておくのに役立つかもしれません。1つの半球は、可能な組織病理学のために保存することができる(ステップ1.2を参照)。
	<ol>
<li>関心のある脳領域を解剖し、冷たいミンチ液の〜7 mLで穏やかにスウィッシュ。</li>
		<li>冷たいミンチ液の〜7 mLを含むきれいな中型の計量船に組織を移し、さらに処理する準備ができるまで氷の上に維持する(ステップ1.8または1.11;小さな領域、小脳や海馬などの小さな領域はそれ以上のトリミングを必要としないことに注意してください)。</li>
	</ol></li>
	<li>胃のために
	<ol>
<li>前胃を取り除いて捨てます。腺胃を切り開き、中型の計量ボートで〜7 mLの冷たいミンチバッファーを使用して食品から自由に洗います。</li>
		<li>可能な組織病理学の評価のための固定のために十二指腸に近位腺の腺胃の5mmストリップを取り除く(ステップ1.2を参照)。</li>
		<li>残りの胃を中型の計量艇で約7mLの冷たいミンチバッファーに入れ、氷の上で15〜30分間インキュベートします。 注:このインキュベーションステップは必要ないかもしれません。このステップは JaCVAM 検証プロトコルに含まれていましたが、OECD テストガイドライン8,,9には記載されていません。</li>
		<li>腹をきれいなパラフィン(またはペトリ皿または計量船)に移し、メスの刃またはポリテトラフルオロエテン(PTFE)スクレーパーを使用して表面上皮を2回以上静かに掻き取り、破片を取り除きます。ピペットを使用して、1 mLの冷たいミンチバッファーで鉗子とすすいで胃粘膜を拾います。胃組織をきれいな表面または皿に移す。</li>
		<li>スカルデルブレードまたはPTFEスクレーパーの裏部で、ミンチ液(通常は250μL/マウスまたは500-1,000 μL/ラット)で胃上皮を4~5回(必要に応じて)慎重に削り取り、細胞を放出します。必要に応じて、より多くの細胞を回収するために、ほぼ等量のミンチ溶液で組織をすすい取る。ピペットを使用して放出された細胞を含むミンチ液を回収し、氷上のマイクロ遠心分離管に移します。</li>
	</ol></li>
	<li>組織サンプルを細かくする場合は、肝臓または脳組織の3〜4mmのセクションまたは十二指腸の〜5mmを切断し、1 mLの冷たいミンチ溶液を含む標識された1.5または2.0 mLマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを冷たく保ちながら、細かく分散するまでミンチハサミ(≤30 s)を急速にミンチします。サンプルは少し曇りで見えるはずです。しかし、チューブの底に落ち着く部分が残ることは一般的です。</li>
	<li>新鮮な組織を使用するには、氷の上にひき肉または掻き取られた上皮細胞を含むチューブを維持します。収穫の約1時間以内に彗星スライドを準備するために組織を使用する(セクション2で概説)。</li>
	<li>組織サンプルを凍結する場合、切り取られた上皮細胞のミンチまたは回収の直後
	<ol>
<li>チューブ蓋を固定し、液体窒素を含むデュワーフラスコにチューブをドロップします。チューブは、壊死の間液体窒素(≤3時間)に維持され得る。</li>
		<li>取鍋を使用してチューブを取り出し、ドライアイスの上に置いて並べ替えます。ドライアイスの冷凍庫にチューブを移し、箱を-80 °Cの冷凍庫に保管します。</li>
	</ol></li>
	<li>組織の凍結キューブを準備するには、組織のいくつかの小片(直径≤4 mm、長さ約6mm)をカットします。図 1)。
	<ol>
<li>液体窒素を含む中型の計量艇または他の適切な容器に直接それらを直接落とします。</li>
		<li>作品が完全に凍結し、個々の凍結組織キューブをドライアイスに維持されたラベル付きマイクロ遠心分離管またはクライオチューブに移すのを数秒待ちます。凍結プロセス中にピースが凝集しないようにしてください。</li>
		<li>ドライアイスの冷凍庫にチューブを移し、箱を-80 °Cの冷凍庫に保管します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. スライドの準備
<ol><li>
ひき肉/擦り傷付き組織用
	<ol>
<li>湿った氷の上に新鮮なティッシュを含む管を維持する。</li>
		<li>凍結した組織のチューブを室温の水浴に入れて、サンプルが完全に解凍されるまで、冷たく保たれます。すぐにチューブを氷の上に移します。</li>
		<li>アガロースに移すために細胞を引き出す直前(ステップ2.3)、各細胞懸濁液を穏やかに混ぜます。フィルター処理されていないサンプルの場合は、大きなチャンクをチューブの底面に落ち着かせるようにします。スライドがすべてのサンプルに対して準備されるまで、氷上のすべてのチューブを維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
立方体組織用
	<ol>
<li>80°C冷凍庫から組織キューブを含むチューブを取り出し、スライド準備までドライアイスで維持します。</li>
		<li>アリコート1 mLのマーチャント培地(0.14 M NaCl、1.47 mM KH2PO 4、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、10mM NaEDTA、pH 7.4)またはミンチ溶液を各サンプル用のラベル付き1.7 mLマイクロ遠心チューブに入れ、氷上に維持する。4</li>
		<li>組織の解凍を避けるために迅速に働いて、室温組織ミンチ装置の開いた端に組織の立方体を置く(図1)。複数の組織片が使用されてもよい。必要に応じて、凍結した組織を、冷たいモルタルと害虫を使用して小さく切り取って、立方体のサイズを小さくして装置に収まるようにします。</li>
		<li>サイズに合ったシリンジプランジャーを素早くデバイスに挿入して、組織をメッシュエンドに押し込み、冷たいミンチ溶液を含むマイクロ遠心分離管に入れる必要があります。液体を無理にチューブをオーバーフローさせないようにしてください。冷たいミンチ液に約5〜10のデバイスのメッシュ端を浸し、組織を完全に解凍できるようにします。</li>
		<li>細胞がメッシュの毛穴を突き出して見えるまで、プランジャーを完全に押し落とします。その後、プランジャーを約2.5cm引き上げ、完全にもう一度押し下げる。このプロセスを、ミンチ液が濁るまで数回繰り返します。</li>
		<li>必要に応じて、試料を1100rpmで5分間冷蔵遠心分離し、上清の一部を除去することによって細胞密度を高めるために濃縮してもよい。</li>
		<li>各サンプルに対してクリーンティッシュミンチ装置を使用して、すべてのサンプルに対してこのプロセスを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 μLの細胞懸濁液を、37°Cで0.5%低融点アガロースの450 μLを含むチューブに移します。 注:ボリュームは調整できますが、アガロースの量は≤1%でなければなりません。</li>
	<li>前述の10, 11に従ってスライドを準備し、スコアを付けます。</li>
</ol>

<ol><li>van der Leede, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+and+data+interpretation+of+the+in+vivo+comet+assay+in+pharmaceutical+industry%3A+EFPIA+survey+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).</li>
<li>ICH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Conference+on+Harmonisation+of+Technical+Requirements+for+Registration+of+Pharmaceuticals+for+Human+Use+%28ICH%29+S2%28R1%29%3A+Guidance+on+Genotoxicity+Testing+and+Data+Interpretation+for+Pharmaceuticals+Intended+for+Human+Use%5BTitle%5D)+AND+%22ICH%22%5BJournal%5D)">International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use.</a> ICH. , (2012).</li>
<li>EFSA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+opinion+on+genotoxicity+testing+strategies+applicable+to+food+and+feed+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment.</a> EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).</li>
<li>Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%2C+DNA+damage%2C+DNA+repair+and+cytotoxicity%3A+hedgehogs+are+not+always+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead.</a> Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).</li>
<li>Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+experimental+conditions+on+data+variability+in+the+liver+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).</li>
<li>Jackson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+freezing+tissues+and+cells+for+analysis+of+DNA+strand+break+levels+by+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay.</a> Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).</li>
<li>Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Comet+assay+dose-response+for+ethyl+methanesulfonate+using+freshly+prepared+versus+cryopreserved+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).</li>
<li>Uno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JaCVAM-organized+international+validation+study+of+the+in+vivo+rodent+alkaline+comet+assay+for+detection+of+genotoxic+carcinogens%3A+II.+Summary+of+definitive+validation+study+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%3A+In+Vivo+Mammalian+Alkaline+Comet+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22OECD%22%5BJournal%5D)">OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay.</a> OECD. 489, (2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+evaluation+of+six+chemicals+of+known+genotoxic+potential+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).</li>
<li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Alkaline+Comet+Assay+and+Enzyme-modified+Alkaline+Comet+Assay+for+Measuring+DNA+Strand+Breaks+and+Oxidative+DNA+Damage+in+Rat+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 53833(2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+of+styrene-acrylonitrile+trimer+in+brain%2C+liver%2C+and+blood+cells+of+weanling+F344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+the+flavonol+anti-oxidants%2C+alpha-glycosyl+isoquercitrin+and+isoquercitrin%2C+for+genotoxic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential.</a> Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).</li>
<li>Pant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vehicle+and+positive+control+values+from+the+in+vivo+rodent+comet+assay+and+biomonitoring+studies+using+human+lymphocytes%3A+historical+database+and+influence+of+technical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).</li>
</ol>

この研究は、NIHの壁内研究プログラム、国立環境衛生科学研究所(NIEHS)契約HHSN273201300009Cの下で支援されました。しかしながら、ここに含まれる記述、意見、または結論は、必ずしもNIEHS、NIH、または米国政府の発言、意見、結論を表すものではない。

前に示したように7、7、12、13、12,13適切に取り扱うフラッシュ凍結ひき肉組織は、彗星アッセイにおいて良好な結果を提供する。実際、私たちの研究室で調製された凍結したひき肉およびマウス肝臓のベースライン%テールDNA値は、典型的には、新たにひき刻まれたラット肝臓サンプルに対するOECD試験ガイドライン9によって推奨されるように、6%である。良い結果は、細かくして凍結保存されている組織の種類の様々なを使用して複数の実験室によって得られました;同様に、胃腸管内の器官から掻き取られたフラッシュ凍結上皮細胞は、彗星アッセイ77、12、13、1412,13,14</su...

この彗星アッセイは、化学物質や他の環境ストルッサー1にさらされた培養細胞および組織におけるDNA損傷を評価する手段としてますます使用されている。このアッセイは、不完全なDNA修復に関連するDNA二重および一本鎖の破断、アルカリ陰茎病変、および一本鎖の破断を検出することができる。医薬品検査のための医薬品技術要件の国際協議会(ICH)ガイドラインは、生体内の遺伝毒性を評価するためのげっ歯類赤血球微小核アッセイを補完し、腫瘍誘導の標的臓器における作用様式を評価するためのフォローアップテストとして、彗星アッセイなどのDNA鎖破損アッセイを推奨しています。欧州食品安全機関(EFSA)は、生体内彗星アッセイを、体外遺伝毒性試験3における陽性結果の関連性を調査するための適切なフォローアップ試験として推奨している。2014年、OECD試験ガイドラインがげっ歯類彗星アッセイに承認され、遺伝子毒性ポテンシャルの規制試験に使用するアッセイの受容性が高められた。このアッセイは、リラックスしたDNAループと、リセド細胞のヌクレオイドから移行する断片の電気泳動分離に基づいています。基本的に、単一の細胞は、顕微鏡スライドに重ねられたアガロースに埋め込まれています。スライドは溶解バッファーに浸漬され、その後にアルカリ性(pH > 13)溶液が続き、しっかりとコイル状の核DNAがリラックスしてくつろぐことができます。その後、スライドを電界に配置し、負に帯電したDNAを負の電荷から陽極に向かって移動させ、彗星に似た画像を作成します。彗星の頭部と比較して彗星の尾のDNAの相対的な量はDNA損傷の量に直接比例する;尾部のDNA含有量は、典型的には、デジタルイメージングソフトウェアを用いて定量される。
彗星アッセイは断片化したDNAを検出するため、治療による細胞毒性またはストレスに起因する壊死またはアポトーシスに関連するクロマチン断片化によって、暴露誘発DNA損傷の正確な定量化が可能です。さらに、機械的なせん断または不適切なサンプル処理4の結果としてDNA損傷が起こり得る。DNA損傷のベースラインレベルを最小限に抑えるためにスライド調製の前に、収穫された組織を冷やして維持することの重要性は、前に5,6,6に実証されている。多くの研究所は、新鮮なティッシュから彗星アッセイスライドを準備します。しかし、これは、多数の動物を含む研究で動物ごとに複数の組織タイプからのスライドを準備する場合、ロジスティックに困難な場合があります。さらに、これは、スライドの準備と分析がリモートの実験室で発生する場合に問題を提示し、サンプルの出荷を必要とします。例えば、米国の国家毒物学プログラムは、その遺伝子毒物学試験プログラム(https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html)の構成要素として彗星アッセイを含み、時には28日または90日の反復用量毒性試験にアッセイを組み込む。これは、インライフラボによる組織の収集と分析のために別の実験室へのサンプルの転送を必要とします。これを達成するために、組織片が細かく切断され、および/または胃腸管の上皮細胞が掻き取られ、細胞懸濁液が凍結し、その後の出荷および記憶のために冷凍庫に保管され、その後の検査室による分析7まで保存される。サンプルの適切な取り扱いは、凍結組織を使用して高品質のデータを取得するために重要です。しかし、絶えず変化する人員によって行われる壊死時の組織サンプルの再現性操作は、特に彗星アッセイのために日常的に組織を収穫しないインライフラボでは制御が困難である。壊死のスタッフのリフレッシュトレーニングや、経験豊富な研究室のスタッフが新鮮または凍結した組織サンプルを収集するためのモバイルユニットの使用は、多くの場合、あまりにも高価で、実現不可能であるか、単に過小評価されています。
彗星アッセイ分析のために遠隔部位に移送するための高品質の組織サンプルの一貫した生成をより良くするために、組織のフラッシュ凍結キューブからの組織保存の公表された方法6の有用性が検討された。この方法では、凍結した組織の立方体をステンレス鋼組織ミンチ装置(図1)に装填し、冷たい緩衝液を含むマイクロ遠心管に入れる。組織の立方体は、デバイスの端にある小さなゲージメッシュを通して押されます。メッシュのふるいを介して繰り返し組織懸濁液を両側向きに押し付けると、比較的均一な単一細胞懸濁液が生じる。この方法で調製されたサンプルは、ミンチによって調製された新鮮な組織および凍結した組織サンプルと品質において良好に比較した。追加の利点として、ひきびサンプルとは異なり、組織キューブは長期間凍結保存することができ、まだ彗星アッセイで高品質の結果をもたらす。

<table><tbody><tr><td>クライオバイアル</td><td>コーニング コスター</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>デンタルワックスシート</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>72670</td><td></td></tr><tr><td>解剖(ミンチ) マイクロハサミ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-953-1B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>ハンクの平衡塩溶液</td><td>ギブコ</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Teknova</td><td>P0315-10</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>ロンザ</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ (1.7 mL)</td><td>Corning</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>中性緩衝ホルマリン</td><td>ライカ</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>メス刃</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ プランジャー (1 mL)</td><td>Fisher Scientific or Vitality Medical</td><td>14-826-88; 8881901014</td><td>Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe</td></tr><tr><td>ティッシュミンチングデバイス</td><td>NorGenoTech (オスロ、ノルウェー)</td><td>なし</td><td>直径の小さなばらつきが観察され、プランジャーのぴったり感に影響を与える可能性があります。</td></tr><tr><td>ピンセット、プラスチック</td><td>Trade Winds Direct</td><td>DF8088N</td><td>強化ナイロン、非滅菌、鈍い先端、オートクレーブ可能; tradewindsdirect.com</td></tr><tr><td>計量ボート</td><td>Krackler Scientific/Heathrow Scientific</td><td>6290-14251B</td><td></td></tr></tbody></table>

dna損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

この彗星アッセイは、培養細胞や組織、特に化学物質やその他の環境ストストレス剤への暴露後のDNA損傷を評価する手段として人気を集めています。げっ歯類の遺伝子毒性ポテンシャルに対する規制試験における彗星アッセイの使用は、2014年に経済協力開発機構(OECD)の試験ガイドラインの採択によって推進されている。彗星アッセイスライドは、典型的には、壊死時に新鮮な組織から調製される。しかし、凍結組織サンプルは、動物1匹当たりおよび研究ごとに多くの動物からの複数の臓器からのスライドの同時調製に関連する物流上の課題を回避することができます。凍結はまた分析のために暴露施設から別の実験室にサンプルを出荷することを可能にし、凍結組織の貯蔵は、特定の器官のDNA損傷データを生成する決定を延期することを容易にする。アルカリ性彗星アッセイは、露光関連DNAの二重および一本鎖の破断、アルカリ性不安定性病変、不完全なDNA切除修復に関連する鎖破断を検出するのに有用である。しかし、DNA損傷は、機械的なせん断または不適切なサンプル処理手順からも生じ、アッセイの結果を混乱させる可能性があります。壊死時の組織サンプルの収集と処理における再現性は、彗星アッセイのための組織の収穫の経験の様々なレベルを持つ実験室の人員の変動のために制御することが困難である可能性があります。経験豊富なラボスタッフを配置したリフレッシュトレーニングやモバイルユニットの展開を通じて一貫性を高めるにはコストがかかり、必ずしも実現可能とは限りません。彗星アッセイ分析用の高品質サンプルの生成を一貫して最適化するために、カスタマイズされた組織ミンチ装置を用いて組織の凍結された立方体のフラッシュを均質化する方法を評価した。この方法によって彗星アッセイのために調製されたサンプルは、壊死中にミンチすることによって調製された新鮮で凍結した組織サンプルと品質において良好に比較した。さらに、長期保存後の組織の凍結キューブからの細胞における低ベースラインDNA損傷を測定した。

研究1 肝臓は、トウモロコシ油を4日間投与した雄のスプレイグ・ドーリーラットの2つのコホートから収穫され、1週間ずらした。スライドは、ティッシュミンチを挽きたてのティッシュ、凍結したひき肉、および組織ミンチ装置を用いてマーチャントの培地またはミンチ溶液で処理された凍結立方体組織から調製した。第1コホートから得られた動物から得られた凍結組織を、約3.5ヶ月間冷凍保存後に評価した。第2コホートから得られた動物から得られた凍結組織を、約6ヶ月間保存後に評価した。特徴的な「ヘッジホッグ」形態を示す彗星は、大きな損傷を受けた細胞(細胞障害性または機械的ストレスを含む可能性のある不確実な病因)を示すものであり、%尾DNAのスコアリングには含まれていなかった。ハリネズミの割合は、形態の目視検査の際にのみ同定され、OECD TG 4899に従って別々に表された。2つのコホートの動物の平均%尾DNA結果(100個の細胞/動物のスコアリングに基づく)を図2Aに要約する。凍結組織...

このプロトコルは、DNA損傷を評価するために彗星アッセイで使用するための壊死時に高品質の凍結組織サンプルを調製するためのいくつかの手順を説明します:1)細かい組織、2)消化管からの掻き取られた上皮細胞、および3)立方体組織サンプルは、組織ミンチ装置を用いて均質化を必要とする。

DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

このプロトコルは、凍結組織の使用が複数の組織を評価する際の物流を簡素化し、分析のために遠隔実験室へのサンプル転送を可能にし、数ヶ月間組織を分析する決定を延期することができるので重要である。この技術の主な利点は、凍結キューブ組織を使用することは、壊死時に彗星アッセイで訓練された人員を必要とせず、サンプル操作中に導入された技術的な誤りおよび機械的DNA損傷の機会を最小限に抑えることです。この技術は、前臨床薬の開発、環境に入る化学物質の安全性評価、および食品添加物に適用されています。凍結組織は、遺伝子毒性ポテンシャル、DNA修復、化学療法や放射線によるDNA損傷に対する保護効果、および環境バイオモニタリングの評価に使用できます。理想的には、実験は、次の動物から採取された臓器が処理可能になる前に、凍結ステップに各組織サンプルの処理を可能にするように設計されるべきである。凍結組織は、遺伝子毒性ポテンシャル、DNA修復、化学療法または放射線によるDNA損傷に対する保護効果、および環境バイオモニタリングを評価するために彗星アッセイで訴えることができます。テクニカルトレーナーのキャロル・ボビットと調査毒物学ラボマネージャーのアイリーン・ギラスが今日プロセクターを務める予定です。リサーチアソシエイトのリンカーン・マーティンと組織学の技術者アメリ・ラデッサーがサンプルハンドリングをデモンストレーションします。この手順を開始するには、関連付けられた接続組織、臓器、および破片を目的の器官から取り除きます。残りの血液および破片を除去するために、約7ミリリットルの冷たい、作りたてのミンチ液を含む中型の重量を量るボートですぐに激しく臓器をスウィッシュする。十分な冷たいミンチ溶液を含む別のクリーンな重量を量るボートにオルガンを移し、組織を水没させ、さらに処理するまで氷の上に維持する。肝臓の場合は、左葉の5ミリメートルの縦断を切断し、約7ミリリットルの冷たいミンチ溶液をそっとスウィッシュします。その後、約7ミリリットルの冷たいミンチ溶液を含むきれいな中型の計量ボートにティッシュのストリップを置き、さらに処理する準備ができるまで氷の上に維持します。肝臓の一部を取り除き、埋め込みカセットに入れる。将来の病理評価のために実験室標準手順に従って固定、トリミング、パラフィンの埋め込みを行います。十二指腸の場合、胃に近位の十二指腸の10ミリメートルの部分を切断します。十二指腸の一方の端に21〜25ゲージの針を挿入し、任意の破片や細菌を除去するために冷たいミンチ溶液の1ミリリットルでそれを洗い流します。十二指腸をひっくり返し、もう一度1ミリリットルのミンチ溶液で洗い流し、針を捨てます。十二指腸を切開し、約7ミリリットルのミンチ溶液ですすります。その後、再び十二指腸をすすい、さらに処理する準備ができるまで氷上のミンチ溶液でそれを維持します。肝臓について以前に説明したように、将来の組織病理学的評価のために残りの十二指腸の一部をカットして固定する。脳の場合、最初に脳を2つの半球に分け、1つの半球が組織病理学のために保存されているのが有用である。関心のある脳領域を解剖し、それらを穏やかに洗い、肝臓と十二指腸について先に述べたように、さらに処理する準備ができるまで、氷の上でミンチ溶液を維持する。胃のために、前胃を取り除いて捨てます。腺胃を切り開き、約7ミリリットルの冷たいミンチバッファーを含む中型の計量ボートでスウィッシュして食品から自由に洗います。前述のように、組織病理学の評価の可能性を固定するために、十二指腸に近位する腺胃の5ミリメートルストリップを取り除く。残りの胃を約7ミリリットルの冷たいミンチバッファーを含む中型の計量ボートに入れ、氷の上で15〜30分間インキュベートします。この後、お腹をきれいなパラフィンに移し、メスの刃またはプラスチックセルスクレーパーを使用して、表面上皮を少なくとも2回静かに掻き取り、破片を取り除きます。鉗子で胃粘膜を拾い、冷たいミンチバッファーの1ミリリットルでそれをすすいでピペットを使用しています。すすった胃組織をきれいな表面または皿に移し、冷たいミンチ液を加える。メスの刃またはプラスチックセルスクレーパーの裏を使用して、胃上皮を4~5回慎重に掻き取り、細胞を放出します。次いで、ピペットを用いて、放出された細胞を含むミンチ液を回収し、氷上のマイクロ遠心チューブに移す。組織サンプルを細かくする場合は、肝臓、脳、または十二指腸の一部を切断し、冷たいミンチ溶液の1ミリリットルを含む標識されたマイクロ遠心分離管に移す。サンプルが冷たく保たれる一方で、サンプルが最終的に分散されるまで迅速にミンチするハサミを使用してください。サンプルは少し曇って見えるはずです。しかし、チューブの底に落ち着くいくつかの部分が残ることは一般的です。新鮮な間に組織を使用するには、氷の上にサンプルを含むチューブを維持します。組織サンプルを凍結するには、ミンチまたは採取直後にチューブの蓋を固定し、液体窒素を含むデュワーフラスコにチューブをドロップします。組織の収穫の終わりに、サンプル管を取り出すために取鍋を使用し、並べ替えるためにドライアイスの上に置きます。チューブをドライアイスの冷凍庫に移し、箱をマイナス80度で冷凍庫に保管します。組織の凍結キューブを調製するには、いくつかの小さな組織を切断し、液体窒素を含む中型の計量ボートまたは他の適切な容器に数秒間直接それらを直接落とします。破片が完全に凍結した後、凍結した組織キューブをドライアイス上のラベル付きマイクロ遠心チューブ(クライオチューブ)に個別に移します。組織の収穫の終わりに、ドライアイスの冷凍庫ボックスにチューブを移し、マイナス800°Cの冷凍庫に箱を保管します。湿った氷の上に維持され、みじん切りまたは掻き取ったティッシュを使用する場合は、収穫から1時間以内に彗星のスライドを準備します。凍結したひき肉または擦り傷した組織を使用する場合は、凍結した組織のチューブを室温の水浴に入れ、サンプルが完全に解凍されるまで、冷たく保たれます。サンプルが解凍されたら、すぐにチューブを氷の上に移します。立方体組織の場合、キューブを含むチューブを冷凍庫から取り出し、スライド準備までドライアイスで維持します。アリコート 1 ミリリットルの商人の培地またはミンチ溶液を各サンプルに対してラベル付けされた 1.7 ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにし、氷の上に維持します。解凍を避けるために迅速に働いて、室温組織ミンチ装置の開いた端に組織の立方体を置く。素早くサイズに一致したシリンジプランジャーをデバイスに挿入して、組織をメッシュ端に押し込み、冷たいミンチ液を含むマイクロ遠心管に入れる必要があります。冷たいミンチ液に約5〜10秒間デバイスのメッシュ端を浸し、組織を完全に解凍できるようにします。細胞がメッシュの毛穴を突き出して見えるまで、プランジャーを完全に押し落とします。その後、プランジャーを約2.5センチメートル引き上げ、再び完全に押し下げてください。数回繰り返し、ミンチ液が濁るまで繰り返す。スライドを調製するには、セル懸濁液を穏やかに混合し、摂氏37度で0.5%低融点アガロースの450マイクロリットルを含むチューブに50マイクロリットルを移す。テキスト プロトコルで説明されているスライドを準備し、スコアを付けます。最初の研究では、肝臓は1週間ずらした雄のスプレイグドーリー車両制御ラットの2つのコホートから収穫された。スライドは、挽きたてのティッシュ、凍結したひき肉、および凍結立方体組織から調製した。OECDは新鮮なラット肝臓におけるテールDNA%の上限を推奨しているため、これらの結果は、凍結方法のいずれかが組織の評価にうまく機能することを示している。全体として、ヘッジホッグ率はテールDNAの%と平行していたが、凍結組織は大きな変動性を示した。2番目の研究では、雌のB6C3F1マウスを、その車両またはムタゲンエチルメタンスルホン酸を投与した。%尾部DNA結果は、肝臓組織がキューブとして凍結し、その後組織ミンチ装置を用いて処理され、新たにひき肉組織について得られたものと非常によく似た結果をもたらすことを示している。EMS誘発DNA損傷の統計的に有意な増加を、3つの方法すべてで処理された組織サンプルで測定した。3番目の研究では、90日間の化学毒性試験で雌のB6C3F1マウスから採取された肝臓サンプルを分析した。凍結したひき肉組織におけるDNA損傷は、動物の変動に対して実質的な動物を有する、すべての用量群にわたって高かった。テールDNAの結果の割合はハリネズミの割合と相関し、ハリネズミがこれらのサンプルで観察された高レベルのDNA損傷に実質的に寄与したことを示している。対照的に、DNA損傷とハリネズミ%の両方は、ひき肉サンプルと並行して調製されたフラッシュ凍結立方体組織において非常に低かった。したがって、ひき肉サンプル中のハリネズミとして現れた損傷の強い細胞は、明らかに生物学的プロセスの結果ではなく、機械的破壊、または、フラッシュ凍結される前のミンチ処置中の組織温暖化によって導入された可能性が高かった。したがって、ひき肉のデータは信頼性が低いと考えられた。それに比べて、長期間保存した後でも、凍結された立方体組織から高品質のデータを得た。収穫した組織を冷たく湿らせた状態に保ち、サンプルを凍結するために迅速に作業することが重要です。また、凍結した立方体組織は、均質化工程の直前に解凍する必要があります。凍結組織試料は、例えば、酸化的損傷または架橋を検出するための彗星アッセイの改変、および遺伝子発現の変化の評価を含む他の下流の適用に適している。メスの刃を取り扱って組織を切ったり掻き取ったりする際、および凍結プロセス中に液体窒素を取り扱う際には注意が必要です。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオは、有害物質にさらされた後のDNA損傷を検出するための彗星アッセイを示しています。アルカリ性条件下では、DNAは巻き戻されて変性し、電気泳動では、損傷していないDNAと損傷したDNAがアガロースゲル内で異なる方法で移動し、彗星状の構造を形成します。ゆっくりと移動する損傷を受けていないDNAは円形の彗星の頭を形成し、急速に移動する損傷したDNA断片は細長い彗星の尾を形成します。...

細胞内のDNA損傷検出のためのCometアッセイ

コメットアッセイは、アルカリに不安定なサイトや海馬ニューロンを含むすべての細胞のDNAにDNA-DNA/DNA-proteinクロスリンクを含むシングルと二重鎖切断を検出する効率的な方法です。この方法は、DNA損傷の量の違いに起因する電界中のDNAの差のマイグレーションを活用しています。...

コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する

ここでは前例のないスループットDNA損傷のコメットアッセイの検出を可能にするプラットフォームについて説明します。デバイスパターンマイクロアレイへの哺乳動物細胞および96サンプルの並列処理を可能にします。アプローチは、基本レベルのDNA損傷、曝露によって誘導されるDNA損傷とDNA修復の動態の解析を容易にする。...

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

コメットアッセイは、様々な要因によって誘発されるDNA破壊を測定します。 DNAの損傷を引き起こす（酸化ストレスを除く）すべての要因が一定に保持される場合、DNA損傷の量は、酸化ストレスの良い間接的なパラメータです。このプロトコルの目的は、酸化ストレスの間接的な測定のためのコメットアッセイを使用することです。...

全身酸化ストレスの間接的な指標として、コメットアッセイ

コメット ・ アッセイは、単一および二重鎖 DNA を含む DNA 損傷の中断を検出する効率的な方法です。化学療法の治療効果を評価するためがん細胞における DNA...

コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価

コメットアッセイは、DNA損傷を検出するための一般的な手段です。この研究では、コメットアッセイの代表的なバリアントでスライドを実行するためのアプローチについて説明します。このアプローチにより、サンプル数が大幅に増加し、アッセイの実行時間、スライド操作の回数、およびゲルの損傷のリスクが軽減されました。...

細胞DNA損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ

このプロトコルは、コメットアッセイの適用を通じて、FLT3変異細胞におけるI型およびII型阻害剤によって誘発されるDNA損傷の違いを定量化するための効果的な方法を説明しています。...

I型およびII型FLT3阻害剤への曝露後のFLT3変異体発現32D細胞におけるDNA損傷を定量化するためのコメットアッセイ

標的DNA損傷は、DNA損傷剤を三重形成オリゴヌクレオチド(TFO)にテザリングすることで達成できます。改変TFOを使用すると、DNA損傷特異的タンパク質会合、およびDNAトポロジー改変は、本明細書に記載の改変クロマチン免疫沈降アッセイおよびDNAスーパーコイリングアッセイの利用により、ヒト細胞で研究することができる。...

ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

このプロトコルの目標はレーザー microirradiation を使用してさまざまな種類の比較的単純な鎖切断と被害サイト体内に DNA 損傷シグナル伝達と修復因子アセンブリを勉強する、複雑な損傷を含む DNA の損傷を誘発する方法を記述することです。.

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

この記事では、DNA の隔離及び非常に質の悪い DNA の救助を含む標本材料から高スループット シーケンス...

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

学ぶ彗星アッセイにおける凍結組織の調製法。肝臓や脳などの組織をミンス、キューブ、または細胞採取して凍結保存し、DNA損傷評価や遺伝毒性試験に活用できます。

DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

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