CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

アマスチゴテは細胞内寄生虫であるため、T.cruziの宿主感染段階を実験に使用することは困難である。私たちの培養技術により、アマスチゴテは宿主細胞の外で一時的に複製することができるので、寄生虫のこの臨床的に関連する段階で直接実験を行うことができます。この手順のデモンストレーションは、当研究所の技術者である「つくつゆえ」です。

原稿の指示に従って宿主寄生虫の共文化を維持する。Cas9発現用寄生虫が分化の準備ができたら、上澄み物を円錐形のチューブに集め、顕微鏡下でサンプルの品質を確認します。かなりの数の細胞外アマスチゴがある場合は、トリポマスチゴスを分離するためのスイムアウト手順を実行する。

トリポマスチゴトとアマスティゴットの混合物を15分間2、100回G.100回スピンダウンし、上清のほとんどを捨て、チューブに0.5〜1ミリリットルの培地を残します。チューブをゆるくキャップし、ペレットを摂氏37度で1〜2時間インキュベートし、アクティブなトリポマスティゴがペレットから泳ぎ出すことができます。インキュベーション後、トリポマスチゴスを用いて上清を1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。

それを回転させ、5ミリリットルのDMEMでペレットを再中断します。寄生虫をT-25培養フラスコに移し、加湿インキュベーターで5%の二酸化炭素の下で摂氏37度でフラスコをインキュベートする。寄生虫の約95%は24時間後にアマスチゴテに分化する。

遠心分離機は、細胞外アマスチゴの培養を2で15分間、100倍G、上清を捨てる。提供された補液を含むエレクトロポレーションバッファーでペレットを再懸濁し、1ミリリットル当たり8番目の細胞に10倍の最終細胞密度を与える。アリコート100マイクロリットルの再懸濁された寄生虫を1.5リットルのマイクロ遠心分離管に。

その後、ガイドRNAの5〜10マイクログラムを追加し、ピペットで穏やかに混合します。混合物を2ミリメートルのギャップエレクトロポレーションキュベットに移し、エレクトロポレーション装置とパルスを印加する。次に、キュベットの内容物をT-25フラスコに移し、5ミリリットルのプリウォームリット培地を含み、キャップを緩めたままにし、5%の二酸化炭素の下で37°Cでフラスコをインキュベートする。

細胞増殖を、無菌培養の継続または宿主細胞感染後の細胞内アマスチゴとして監視する。細胞の成長をアキセン酸アマスチゴテとしてモニタリングする場合は、フラスコを穏やかに振って細胞外アマスチゴスを溶液中に再懸濁し、培養液の20マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに1マイクロヨウ化プロピジウム溶液と混合する。温度はアマスチゴテの無比増殖を可能にする要因の一つであるため、培養フラスコを必要以上に長く培養器の外に残さなくすることが重要です。

試料をヘモサイトメーターに塗布し、蛍光顕微鏡で観察します。次に、ヨウ化プロピジウムによって染色されない生存可能なアマスティゴの数を数える。ノックアウト細胞の増殖を細胞内アマスチゴトとしてモニタリングするために、シードはDMEMを用いた12ウェルプレートに3T3細胞を宿宿する。

エレクトロポレーションの翌日、遠心分離によってノックアウトアマスティゴを収集し、上清を捨て、2ミリリットルのDMEMで寄生虫を再中断する。宿主細胞培養液から培地を取り出し、再懸濁したアマスチゴスを加える。2日間、5%の二酸化炭素の下で摂氏37度でプレートをインキュベートし、アマスティゴスが感染を確立できるようにします。

2日後、DMEMで宿主細胞の外の細胞外アマスチゴを洗い流し、新鮮なDMEMを加える。さらに2日間インキュベーションを続け、宿主細胞の核と細胞内アマスチゴテを可視化する。必須遺伝子TcCGM1に対してガイドRNAをトランスフェクトしたT.Cruziアマスティゴは、対照群と比較して有意な成長欠陥を示す。

細胞内アマスチゴスとしての増殖をモニタリングする場合、T.Cruzi核に関連する宿主核の割合は、コントロールと比較してTcCGM1ノックアウト群において有意に低い。逆に、パラフラフラーロッドタンパク質TcPAR1の1つに対するガイドRNAのトランスフェクションは、4日間の無分離培養後の細胞増殖に有意に影響を及ぼさないか、または細胞内アマスチゴテの増殖を阻害する。しかしながら、感染後5日間、宿主細胞から出てくるトリポマスチゴの数は、対照共培養と比較してTcPAR1ノックアウト共培養において有意に少ない。

さらに、対照群の宿主細胞内の分化されたトリポマスチゴスは、ノックアウト群のものよりも活性に見えた。この方法は、ガイドRNAをCas9発現アマスチゴテにトランスフェクトする代わりに、アマスチゴテステージに対する外因性遺伝子の効果を研究するためにも使用でき、プラスミドを野生型アマスチゴテにトランスフェクトして外因性遺伝子を発現させることができる。