Name: フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーによるγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定法。DNA二重鎖切断の修復失敗の影響を評価し、放射線治療やがん治療の研究に応用できます。

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ドイツがん研究センター(DKFZ)のフローサイトメトリー施設チームの支援に感謝します。

<ol><li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab%3A+the+NEAR+protocol+%28NCT00115518%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122(2006).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
<li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor%2FPlatelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy%2C+temozolomide%2C+and+the+novel+TGF-%CE%B2+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage%2C+Aging%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA Damage, Aging, and Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).</li>
<li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response%3A+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li>
<li>Escribano-Díaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell+Cycle-Dependent+Regulatory+Circuit+Composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+Controls+DNA+Repair+Pathway+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice.</a> Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li>
<li>Münz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li>
<li>Dean, P. N., Jett, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+DNA+distributions+derived+from+flow+microfluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry.</a> Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).</li>
<li>Fox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+computer+analysis+of+synchronous+DNA+distributions+obtained+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry.</a> Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).</li>
<li>Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+features+that+discriminate+between+foci+induced+by+high-+and+low-LET+radiation+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts.</a> Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).</li>
<li>Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+light+microscopy+shows+nanostructure+of+carbon+ion+radiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci.</a> FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

注目の方法は使いやすく、二本鎖の破壊(DSB)誘導および修理、細胞周期の効果およびアポトーシス細胞死を含むDNA損傷応答の速く、正確で、再生可能な測定を提供する。これらのエンドポイントの組み合わせは、個々のアッセイよりも相互関係のより完全な画像を提供します。この方法は、放射線生物学、治療および保護の分野における包括的な遺伝毒性アッセイとして広く適用することができ、より一般的には腫瘍学(例えば、環境リスク因子評価、薬物スクリーニングおよび遺伝学の評価のために)腫瘍細胞の不安定性)。
このプロトコルの最も重要なステップは、セルの固定です。明確に定義された細胞集団と異なる細胞周期相の最適な分解能を持つクリーンなサンプルを得るためには、付着細胞に培養容器から切り離し、完全に丸い形状を形成するのに十分な時間を与える必要があります。細胞は、細胞束なしで単一の細胞懸濁液として固定溶液に移されるべきである。それらを分離するには、細胞を上下にピペットするか、困難な場合には細かい針を数回通過する必要があります。固定時間は、すべてのサンプル間で一定に保たれるべきであり、70%エタノールで細胞を再懸濁する...

腫瘍学の目標は、正常な細胞に害を与えることなく、癌細胞を殺すか、または不活性化することです。多くの治療法は、がん細胞に遺伝子毒性ストレスを直接的または間接的に誘導するが、正常な細胞にも広がる治療法もある。化学療法または標的薬物は、照射された腫瘍1、2、3、4、5の放射線感受性を増強するために放射線療法と組み合わされることが多く、これは、正常な組織の損傷を最小にするために放射線量。
電化放射線および他の無毒剤は、塩基修飾、鎖架面および単一または二本鎖の破断を含む異なる種類のDNA損傷を誘発する。DNA二本鎖切断(DSB)は最も重篤なDNA病変であり、その誘導は放射線化学療法における電光放射線および様々な細胞静止薬の細胞殺傷効果の鍵である。DSBはゲノムの完全性を損なうだけでなく、突然変異6、7の形成を促進する。そのため、異なるDSB修復経路、およびアポトーシスのような回復不能な損傷を受けた細胞を排除するメカニズムが進化中に開発された。DNA損傷応答全体(DDR)は、DNA損傷認識および細胞周期停止から到達するシグナル伝達経路の複雑なネットワークによって調節され、DNA修復を可能にし、修復障害の場合にプログラムされた細胞死または不活性化に8。
提示されたフローサイトメトリック法は、DSB誘導および修復、ならびに修理失敗の結果をカバーする1つの包括的なアッセイで、ジェノト毒性ストレス後のDDRを調査するために開発されました。広く適用されたDSBマーカーγH2AXの測定と、古典的なsubG1分析とカスパーゼ-3活性化のより具体的な評価を用いて、細胞周期およびアポトーシスの誘導の分析を組み合わせた。
これらのエンドポイントを1つのアッセイで組み合わせることで、時間、労力、コストコストを削減できるだけでなく、DSB誘導および修復の細胞周期特異的測定、ならびにカスパーゼ-3活性化を可能にします。このような分析は、独立して行われるアッセイでは不可能ですが、毒性ストレス後のDNA損傷応答を包括的に理解するために非常に関連性が高い。細胞増殖性化合物などの多くの抗癌剤は、細胞分裂に対して向けられており、その効率は細胞周期段階に強く依存する。異なるDSB修復プロセスの可用性は、修復精度のために重要である細胞周期段階および経路選択にも依存し、順番にセル9、10、11の運命を決定する。 12.さらに、DSBレベルは、ジェノキシック化合物または放射線の線量だけでなく、細胞のDNA含有量にも依存するため、DSBレベルの細胞周期特異的測定はプール分析よりも正確です。
この方法は、神経膠芽腫13の抵抗機構を克服し、骨肉腫14、15における電離放射線と標的薬物との相互作用を解剖するために、異なる放射線療法の有効性を比較するために使用されてきた。および非定型奇形性ラブドイド癌16.さらに、記載された方法は、間葉系幹細胞17、18、19、20、21に対する無線および化学療法の副作用を分析するために広く使用されている。 22,23,24, 治療誘発正常組織損傷の修復に不可欠であり、再生医療に潜在的な応用を有する.

<table><tbody><tr><td>1,000 & マイクロ;Lフィルターチップ</td><td>ネルベプラス</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1,000 &Lピペット</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 & micro;mメッシュの細孔径</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL チューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;Lフィルターチップ</td><td>ネルベプラス</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 & マイクロ;Lピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジン-2-フェニルリンドール (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>200 & micro;g/mL でアリコートを -20 &deg で保存します。C</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗 H2A.X リン酸化 (Ser139) 抗体、RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>希釈 1:20</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ウサギ抗活性カスパーゼ-3 抗体、AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>希釈 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSClean solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>測定後のサイトメーター洗浄ルーチン用</td></tr><tr><td>BD FACSRinse solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td>測定<td>後のサイトメータークリーニングルーチン</td></tr><tr><td>Dulbecco's リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>水に1倍の濃度で溶解</td></tr><tr><td>安定グルタミンを含むダルベッコの改変イーグルス培地</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>プロトコルで使用される細胞株の例のルーチン細胞培養材料</td></tr><tr><td>エタノール 絶対</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Excelソフトウェア</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBSスーペリア(ウシ胎児血清)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td> プロトコルFlowJo v10ソフトウェアLLCオンライン注文<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>で使用されるサンプル細胞株のルーチン細胞培養材料 <tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>染色されたサンプルから顕微鏡スライドのオプション調製のための埋め込み培地</td></tr><tr><td>折り畳まれたセルロースフィルター、グレード3hw</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>LSRIIまたはLSRFortessaサイトメーター</td><td>BDバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>カルバイオケム</td><td>474787</td><td>アポトーシスポジティブコントロールのためのオプション薬</td></tr><tr><td>マルチフュージ 3SR+</td><td>ヘレウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>4.5%溶液を新鮮に調製します。PBSで80°Cに加熱して希釈します。Cはヒュームフードの下でゆっくりと攪拌します。熱損失を防ぐために、フラスコをアルミホイルで覆います。溶液を室温まで冷まし、最終容量を調整します。溶液をセルロースフィルターに通します。</td></tr><tr><td>リン酸化ヒストン H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor&reg; 555 Conjugate) RRID: AB_10694639</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3475</td><td>Dilute 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes, 5 mL</td><td>コーニング</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (修飾 TNF 関連アポトーシス誘導リガンド)</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>アポトーシスポジティブコントロールのためのオプション薬</td></tr><tr><td>T25 細胞培養フラスコ</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>プロトコルで使用される細胞株の例のルーチン細胞培養材料</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-025500</td><td>プロトコル</td></tr><tr><td>U87 MG膠芽腫細胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>プロトコルで使用された例示の細胞株</td></tr>のルーチン細胞培養材料</tbody></table>

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγh2axとアポトーシスの細胞周期特異的測定

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

提示された方法またはわずかに変更されたバージョンは、臨床腫瘍学で使用される様々な抗癌治療の特定の治療応答および副作用を研究するために考案された。放射線療法や多数の抗がん剤によって引き起こされる、遺伝子毒性ストレス後のDNA損傷応答の定量的および縦方向の分析を可能にします。この方法は、DNA損傷応答のすべての段階をカバーし、DNA二本鎖切断(DSB)の誘導および修復、修復障害の場合のアポトーシスによる細胞周期停止および細胞死のエンドポイントを提供する。これらの測定値を組み合わせることで、細胞周期依存的な治療効果に関する情報が提供され、細胞増殖とDNA損傷に対する対処メカニズムの相互作用を詳細に研究することができます。化学療法剤や電位化放射線を含む多くのがん治療薬の効果は、特定の細胞周期相に応じて制限されるか、または強く変化するので、相関分析は、治療効果を評価するために堅牢で実行可能な方法に依存しています。細胞周期特異的な方法でDNAに。これは、シングルエンドポイントアッセイと提示された方法の重要な利点では不可能です。この方法は、任意の特定の細胞株に限定されず、腫瘍および正常組織細胞株の多数で徹底的にテストされている。環境リスク因子評価、薬物スクリーニング、腫瘍細胞における遺伝的不安定性の評価など、放射線腫瘍学以外の多くの分野で包括的な遺伝毒性アッセイとして広く応用できます。

ヒトU87またはLN229神経膠芽腫細胞を4Gyのフォトンまたは炭素イオン放射で照射した。細胞周期特異的γH2AXレベルおよびアポトーシスは、ここに示す流れサイトメトリック法を用いて照射後48時間までの異なる時点で測定した(図3)。いずれの細胞株でも、炭素イオンは、同じ物理線量での光子放射と比較して、より低速に低下し、24~48時間で有意に上昇したγH2AXピークレベルを誘導した(図4A)。これは、炭素イオンが、あまり効率的に修復されなかった光子よりもDNA二本鎖破断(DSB)のピークレベルが高いことを示した。いずれの放射線タイプでも、γH2AXレベルはG1細胞で最も高く、おそらくDSB修復は細胞周期のこの段階で非相同末結合の経路に限定されているためである。
DSB誘導速度が高く、修復運動が遅いことに伴い、炭素イオンはG2相(図3B)でよ...

提示された方法は、DNA二本鎖切断(DSB)、細胞周期分布およびアポトーシスの定量分析を組み合わせて、DSB誘導および修復の細胞周期特異的評価と修復失敗の結果を可能にする。

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

この方法は、細胞周期依存治療効果に関する情報を提供し、細胞増殖とDNA損傷に対する対処機構の相互作用を可能にし、深く研究する。この方法は、二本鎖のフラグ認識と修復、細胞周期効果、アポトーシスによる最終的な細胞死を含むDNA損傷応答からの重要なエンドポイントを1つの包括的なアッセイに組み合わせたものです。我々は、臨床腫瘍学における放射線化学療法治療の特定の治療応答および副作用を主に調査するためにこの技術を用いてきた。このアッセイは、放射線生物学と放射線療法の分野における相関研究に非常に有用であるが、腫瘍学の他の様々な分野にも適用することができる。標準的な細胞採取手順に従って培養液から細胞を採取した後、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁する。そして、ボンネット内の固定溶液の2ミリリットルに細胞を移す。室温で10分間のインキュベーションを行った後、遠心分離により細胞を回収し、上清をデカントする。細胞を単一の細胞懸濁液として固定し、すべてのサンプルの固定時間を一定に保つことが重要です。接着細胞に、分析のために丸みを帯びた細胞を得るために取り外すのに十分な時間を与える。その後、70%エタノールの3ミリリットルで細胞をタップし、再懸濁させてペレットを緩めます。染色前に細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈め、タップしてペレットを緩める。その後、3ミリリットルの洗浄液で2回連続洗浄し、1ミリリットルの洗浄液で1回洗浄して細胞を再懸濁します。各洗浄の間に上清を捨てる。最後の洗浄後、ペレットを邪魔することなく上清を慎重に吸引し、目的の抗体カクテルの100マイクロリットルで発光ペレットを再懸濁する。室温で1時間後、遠心分離により細胞を採取し、ペレットを乱すことなく上清を慎重に吸引する。次に、100~250マイクロリットルのDNA染色液で緩んだペレットを再懸濁し、35マイクロメートルのメッシュ細孔サイズのサンプルチューブの細胞ストレーナーキャップを通して細胞を分配する。フローサイトメトリーでセルを解析するには、サイトメーターウィンドウのパラメータタブを開き、表に示されているパラメータを選択します。次に、ワークシート ウィンドウを開き、示されているとおりにプロットを作成します。コントロールサンプルをサイトメーターにロードし、実行ボタンを押します。ブラウザ ウィンドウで最初のチューブを選択し、チューブ名をクリックします。インスペクターウィンドウのパラメータタブで、前方およびサイドスキャッタとDAPIの検出器電圧を調整します。スタンバイボタンを押して、ソフトウェアのワークシートの設定を続行します。ポリゴン ゲート ツールを使用して、前方散布領域と側面散布領域プロットのセルの母集団を定義し、矩形ゲート ツールを使用して DAPI と DAPI エリア プロットを使用する単一セルの母集団を定義します。コントロール G を押して人口階層を表示し、デフォルトのゲート名をクリックして名前を変更します。続いて、すべてのヒストグラムを右クリックして、コンテキストメニューから表示母集団と単一セルを選択します。制御および処理されたサンプルを取得して、抗体結合フルオロフォアの検出電圧を最適化し、信号の全ダイナミックレンジをカバーします。サンプルを測定するには、サイトメーターの実行ボタンを押し、ソフトウェアの取得ダッシュボードを使用してサンプルを測定します。次に、ファイル、エクスポート、および実験を選択してダイアログボックスでディレクトリのエクスポートを選択し、データをドットFCSファイルとして保存します。データを評価するには、ドット FCS ファイルをフロー サイトメトリック解析ソフトウェアのサンプル ブラウザにドラッグ アンド ドロップします。また、ポリゴン ツールを使用して、前方散布図と側面散布図でのセルの母集団を定義し、解析から破片を除外します。DAPI と DAPI 領域プロットでは、矩形ツールを使用して単一セルの母集団を定義し、セルの二重または束を解析から除外します。DAPI領域ヒストグラムでは、二等分法ツールを使用して、正常なDNA含量を有する単一細胞と分解されたDNAを有するアポトーシス細胞とを区別します。ツール生物学と細胞周期を選択して細胞周期モデリングツールを開き、ディーン・ジェットフォックスを選択してG 1 SおよびG 2 M相の細胞の頻度を推定します。G 1 S と G 2 と M の位相ゲートを、セル周期母集団の DAPI 面積プロットと対 DAPI エリア プロットで作成し、セル周期特異的ガンマ H 2 A X 測定を可能にします。二等分法ツールを使用して、細胞周期母集団のAlexa 555領域ヒストグラムにおけるホスホヒストンH 3個の正および負の細胞を区別し、単一細胞の母集団のAlexa 647領域の3つの正および負の細胞をCASベースに区別します。コントロール T を押してテーブルエディタを開き、指示に示されたとおりにテーブルを設定します。次に、[ファイル] を選択して、メニュー リボンの出力セクションで形式と出力先を設定し、データをスプレッドシート にエクスポートします。炭素イオンは、同じ物理的線量の光子放射と比較して、よりゆっくりと減少し、24〜48時間で有意に上昇したままの神経膠芽腫細胞において、より高いガンマH 2 AXピークレベルを誘導する。炭素イオンと光子放射の両方について、ガンマH2 AXレベルは、DNA二重鎖破断修復が細胞周期のこの段階で結合する非相同端の経路に限定されるため、G1相細胞で最も高かった。二重鎖破断誘導率の上昇と修復運動の遅れに合わせて、炭素イオンは、G 2相でより強く、より長く持続する細胞周期の逮捕を誘導し、光子よりも高いアポトーシス率を誘導する。治療効果の強さに応じて、異なる細胞周期相の分解能は困難な場合があります。一部の細胞株では、DAPI濃度は細胞周期プロファイルの品質に大きな影響を与え、調整する必要があります。フローサイトメトリー後の残りのサンプルからスライドを作成して、ガンマH 2 AX病巣の数、大きさ、形状を評価し、焦点とパル核ガンマH 2つのAX染色を区別することができます。我々の方法を用いて、間葉系幹細胞は電離放射線およびトポイソメラーゼ阻害に対して比較的耐性であるが、グリオミヤシンに対して感受性であることを示すことができる。PFAの煙は有毒であるので、固定液を準備するときおよび固定段階の間に常にヒュームフードを使用する。また、DAPIを扱うときに手袋を着用することを忘れないでください。

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がん研究

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学ぶフローサイトメトリーによるγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定法。DNA二重鎖切断の修復失敗の影響を評価し、放射線治療やがん治療の研究に応用できます。

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

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