Name: ゲノムワイド往復半角化分析によるサッカロマイセス酵母の種間の熱耐性の遺伝学的マッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶ RH-seq法によるSaccharomyces酵母の種間熱耐性遺伝子マッピング。トランスポソン誘発変異と高通量シーケンスを用いて、ゲノムワイドに遺伝的差異を解明し、適応進化のメカニズムを明らかにする。

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J.ループ、R.ハックリー、I.グリゴリエフ、A.アーキン、J.スカーカーが元の研究に貢献してくれたことに感謝します。B.ブラックマン、S.コラデッティ、A.フラムホルツ、V.グアッチ、D.コシュランド、C.ネルソン、A.サシクマールがディスカッションを行いました。また、PiggyBacプラスミドのJ.デュエバー(UCバークレー大学バイオエンジニアリング学科)に感謝します。この研究は、R01 GM120430-A1と、米国エネルギー共同ゲノム研究所(DOE科学ユーザー施設)のRBBへのコミュニティシーケンシングプロジェクト1460によってサポートされました。後者によって行われた作業は、契約No.の米国エネルギー省科学局によってサポートされました。DE-AC02-05CH11231。

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</ol>

著者は何も開示していない。

以前の統計的遺伝的方法に比べてRH-seqの利点は、数倍です。リンケージおよびアソシエーション分析とは対照的に、RH-seqは単一遺伝子マッピング分解能を提供します。したがって、特定の種の個体間の形質変動の研究や、特異的な違いについても重要な有用性を持つ可能性が高い。また、ゲノム全体の相互異端異端分析における以前の試みは、遺伝子欠失変異体のコレクションを使用し、そのうちのいくつかは偽陽性結果9、10につながる可能性のある二次変異を保有する。RH-seq戦略は、個々の変異クローンの背景が最終的な結果にわずかに寄与するように、各遺伝子に多くのヘミジゴット変異体を順番に生成し、表現することによって、この問題を脇に立たします。原理的には、RH-seqは遺伝子座をコード化しない研究も行っていますが、現在の研究では遺伝子のみに焦点を当てています。
RH-seq、いくつかの生物学的およびいくつかの技術的には、成功した開業医がアプローチの有用性を最大化し、最良の結果への道を加速する...

フィールドの夜明け以来、それは野生の個体間の変動の機械的基礎を理解するために遺伝学の主要な目標となっています。関心のある形質の根底にある遺伝子座をマッピングすると、新しい遺伝子は診断や薬剤の標的として即座に使用され、進化の原理を明らかにすることができます。この目的に向けた業界標準は、リンケージまたはアソシエーション1を介して集団全体の遺伝子型と表現型の関係をテストすることです。これらのアプローチは強力であり、彼らは1つの主要な制限を持っています - 彼らは相互不妊の個人間の交差から組換え子孫の大きなパネルに依存しています。そもそも子孫を形成することができない種の研究では役に立たない。したがって、この分野は、生殖的に単離された種2の間の形質の違いを公平に解剖する能力がほとんど持っていなかった。
本研究では、種間の形質変動の遺伝的基盤のゲノムスケール調査に関する新しい方法RH-seq3の技術的基盤を報告する。このアプローチは、相互ヘミジゴット試験4、5の非常に平行なバージョンであり、これは最初に2つの遺伝的に異なる背景の間の対立性の差異の表現効果を評価する方法として考案された特定の軌跡(図1A)。このスキームでは、2つの異なる個体が最初にハイブリッドを形成するために交配され、そのゲノムの半分はそれぞれの親から来ている。この背景には、複数の株が生成され、それぞれが各親の軌跡の対立遺伝子の中断または削除されたコピーを含む。これらの株は、それらは、関心のある軌跡を除いてゲノムのいたるところに浸留し、ハプロイドとみなされ、それぞれが1つの親の対立遺伝子しか欠け、残りの対立遺伝子が由来するので、多角質である。他の親。これらの相互ヘミジゴット株のフェノタイプを比較することにより、遺伝子座の変異体が相互の間の唯一の遺伝的差異であるため、操作された遺伝子座におけるDNA配列変異体が関心のある形質に寄与するかどうかを結論付けることができる。ヘミジゴット株。このようにして、種間の遺伝的差異を、よく制御された実験セットアップでそれらの間の見型的な違いに結び付けが可能である。現在までに、この試験の応用は候補遺伝子フレームワーク、すなわち候補遺伝子座の自然変動が形質に影響を与える可能性があるという仮説が既に手に入っている場合である。
以下では、酵母をモデルシステムとして用いて、ゲノムスケールの相互半角膜スクリーンのプロトコルをレイアウトする。我々の方法は、種間で生存可能な無菌F1ハイブリッドを生成し、トランスポゾン変異形成を受けることによって、ヘミジゴット変異体のゲノム補体を作成する。我々は、ヘミジゴットをプールし、シーケンシングベースのアッセイでそれらの表現型を測定し、所定の遺伝子の2つの親の対立遺伝子を有するプールのクローン間の頻度の違いをテストする。その結果、種間の変異体が関心のある形質に影響を与える遺伝子座のカタログが得られます。我々は、2つの新芽酵母種、サッカロマイセスセレビシエとS.パラドックスの間の熱耐性の違いの遺伝的基礎を解明するためにRH-seqワークフローを実装し、6年前に約500万年前に発散した。

<table><tbody><tr><td>1-2 プラスミド ギガプレップキット</td><td>ザイモリサーチ</td><td>D4204</td><td>必要なキットの数は、各キットのプレップの効率によって異なります。このキットには、5つの個別のプラスミド調製カラムが付属しています。1カラムあたり1 Lを超えると、調製フィルターが目詰まりし、DNAの収量が低く、品質が低下する可能性があるため、各調製カラムに1 Lの飽和大腸菌培養液を流します。</td></tr><tr><td>10X Tris-EDTA(TE)バッファー(100 mM Tris-HClおよび10 mM EDTA)</td><td>Any</td><td>N / A</td><td>フィルターは、0.22 &mu;使用前にmフィルター。</td></tr><tr><td>1M LiOAc</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td>フィルターは 0.22 &mu;使用前にmフィルター。</td></tr><tr><td>300 mg/mL ジェネチシン (G418)</td><td>Gibco</td><td>11811023</td><td></td></tr><tr><td>52% ポリエチレングリコール (PEG) 3350</td><td>シグマ</td><td>1546547</td><td>水に溶解し、0.22 μ;使用前にmフィルター。1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer</td></tr><tr><td>オートクレーブLB液体ブロス</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>任意のブランドの粉末とミリクウォーターを使用してLB液体ブロスを作ります。使用前にオートクレーブで</td></tr>保存してください。<tr><td>カルベニシリン水(100 mg / mL)</td><td>任意の</td><td>N / A</td><td>フィルターで0.22 &mu;使用前にmフィルター。</td></tr><tr><td>5-フルオロロチン酸(5-FOA)[ウラシルまたは酵母窒素ベース(YNB)を含まない0.2%ドロップアウトアミノ酸ミックス]、0.005%ウラシル、2%D-グルコース、アミノ酸なし0.67%YNB、0.075%5-FOA]</td><td>5-FOA:Zymo Research、ドロップアウトミックス:US Biological、Uracil:Sigma、D-グルコース:Sigm)、YNB:Difco</td><td>5-FOA:F9001-5、ドロップアウトミックス: D9535、ウラシル:U0750、D-グルコース:G8270、YNB:DF0919</td><td></td></tr> DMSO <tr><td>pJR487(CEN-/ARS+piggyBac含有プラスミド)</td><td>を</td>保有する任意のN/A <td></td><td></td>大腸菌株 N/A N/A ブレム研究室からのリクエスト。</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハイブリッド酵母 JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)</td><td>該当なし</td><td></td> ブレ<td>ム研究室からのお願い</td></tr><tr><td>SE-150</td>に使用される<td>イルミナHiseq 2500</td><td></td><td></td>は</tr>、<tr><td>可変温度設定の大型振とうインキュベーター</td>を読み取ります <td>任意の</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LB + カルベニシリン寒天プレート(100 &mu;g/mL)</td><td>寒天:BD Difco</td><td>寒天:214010</td><td>LB寒天プレートを通常通り作り、カルベニシリンを100 &mu;乾燥前のg / mL。</td></tr><tr><td>ナノドロップ分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>量子ビット蛍光計</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33240</td><td></td></tr><tr><td>サケ精子DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>39°Cの水浴;C</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>酵母菌 gDNA 調製キット</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>酵母ペプトンデキストロース (YPD) 液体培地</td><td>BD Difco</td><td>ペプトン: 211677, 酵母 抽出物: 212750</td><td>オートクレーブ後にフィルター滅菌した D-グルコースを 2% に加えます。</td></tr><tr><td>YPD + G418寒天プレート(300 &mu;g/mL)</td><td>寒天:BD Difco</td><td>寒天:214010</td><td>YPD寒天プレートを通常通り作成し、G418を300 &mu;乾燥前のg / mL。</td></tr><tr><td>YPD寒天プレート</td><td>寒天:BD Difco</td><td>寒天:214010</td><td></td></tr></tbody></table>

ゲノムワイド往復半角化分析によるサッカロマイセス酵母の種間の熱耐性の遺伝学的マッピング

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

現代遺伝学の中心的な目標は、野生の生物が表現型で異なる方法と理由を理解することです。現在までに、この分野は、種の個体間の交配から組換え子孫間のDNA配列変異体と表現型との関係をトレースするリンケージおよびアソシエーションマッピング法の強度に大きく進歩した。これらのアプローチは、強力ですが、生殖的に分離された種間の形質の違いに適していません。ここでは、互換性のない種に容易に適用できる自然形質変動のゲノム全体の解剖のための新しい方法について説明する。私たちの戦略、RH-seqは、相互ヘミジゴット試験のゲノム全体の実装です。我々はそれを利用して、その姉妹種S.パラドックスに対する酵母サッカロマイセスセレビシエの顕著な高温増殖の原因となる遺伝子を同定した。RH-seqはトランスポゾン変異を利用して相互ヘミジゴットのプールを作成し、ハイスループットシーケンシングを介して高温競争を通じて追跡されます。ここで説明した RH-seq ワークフローは、新芽酵母クレードの古代の複雑な形質を解剖する厳格で公平な方法を提供し、遺伝的マッピングのためのゲノムカバレッジを確保するためにリソース集約的な深いシーケンシングが必要であることを警告します。シーケンシングコストが低下するにつれて、このアプローチは真核生物全体での将来の使用に大きな期待を持っています。

我々はS.セレビシエとS.パラドックスを交配して無菌ハイブリッドを形成し、トランスポゾン変異形成を行った。各変異型クローンは、1つの遺伝子の1つの対立遺伝子が破壊されるヒプロイドハイブリッドであるヘミジゴットであった(図1A、図2)。我々は39°Cでの成長によって互いにヘミツゴテスを競い合い、対照として別々の実験で、28°C(図1B)で、各培養からDNAを分離した。各ヘミジゴットの適合性を報告するために、DNAが断片化され、アダプターにライゲーションされたプロトコルを使用して、バルクシーケンシングを介して豊富さを定量し、続いてトランスポジット挿入位置の増幅を行いました(図1C)。この増幅のプライマーがプロトコルで提供されるものと異なり、効率が悪い場合、バックグラウンド読み取りはシーケンスデータで優勢になり、使用可能な読み取りが少なく...

シーケンシング(RH-seq)を介した相互異形性は、種間の形質の違いの遺伝的基礎をマッピングする強力な新しい方法である。ヘミジゴットのプールはトランスポゾン変異によって生成され、その適合性は、高いシーケンシングを使用して競争力のある成長を通じて追跡されます。得られたデータの分析は、形質の基礎となる遺伝子を特定します。

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

我々の方法は、種内ではなく種間のゲノム全体のスケールで形質の違いの遺伝的基盤を解剖することができる最初の一つである。この手法の主な利点は、高スループット、高解像度、および広く適用可能です。この手順を開始するには、JR507冷凍庫在庫株をマイナス80°Cの貯蔵から取り出し、YPD寒天プレート上の単一コロニーにストリークアウトします。2日間、またはコロニーが出現するまで摂氏26度でインキュベートする。次に、JR507の単一コロニーを有する250ミリリットルガラスフラスコに100ミリリットルの液体YPDを接種し、200RPMで24時間または定常相に達するまで振りながら28°Cでインキュベートする。翌日、一晩培養したod600を測定する。バックは、新しい1リットルフラスコに新鮮な液体YPDで一晩培養の一部を希釈し、ゼロポイント2のod600と500ミリリットルの体積を持つ新しい文化を作成します。このプロセスをさらに 3 回繰り返して、すべての新しいカルチャに同じ一晩のカルチャを使用して、ゼロ ポイント 2 の od600 を持つ合計 4 つのカルチャを作成します。200 RPMで揺れながら、すべての文化を摂氏28度で6時間インキュベートします。この後、500ミリリットルの培養物のうちの2つを組み合わせて、1リットルの培養物を作り出します。残りの2つの500ミリリットルの培養物を組み合わせて、2番目の1リットルの培養物を作ります。まず、1リットルの培養物をそれぞれ2050ミリリットルのアリコートに分割し、プラスチック製の円錐管に入れ、合計40本のチューブを使用します。20本のチューブを脇に置きます。残りの20個のチューブを1000倍Gで3分間遠心し、酵母細胞をペレット化する。上清を捨て、ボルテックスで25ミリリットルの滅菌水で各ペレットを再懸濁する。遠心分離機はGの1000倍で3分間行う。上清を捨て、ボルテックスにより1X Tris-EDTAゼロ点1モル酢酸リチウム緩衝液の5ミリリットルで各ペレットを再懸濁する。遠心分離機はGの1000倍で3分間行う。上清を捨て、ボルテックスにより5ミリリットル1XトリスEDTAゼロ点1モル酢酸リチウム緩衝液で再度各ペレットを再懸濁する。遠心分離機はGの1000倍で3分間行う。細胞が遠心分離している間、ポリエチレングリコール、酢酸リチウム、およびTris-EDTAバッファーを含む溶液の少なくとも120ミリリットルを調製する。このソリューションを氷の上に保管してください。形質転換のために血漿DNAを調製するために、最初に4ミリリットルのサケ精子DNAを摂氏100度で5分間沸騰させる。この後、すぐに5分間氷の上で冷却します。冷たいサケ精子DNAの4ミリリットルと1ミリリットル当たり538ナノグラムの濃度でpJR487の20ミリリットルを混合する。この混合物を氷の上に置いておいて、使用する準備ができるまで。次に、各細胞ペレットの上に600マイクロリットルの血漿および精子DNA混合物を加える。各ペレットに3ミリリットルの酢酸リチウムTE混合物を加えます。私たちは、上下にピペットをピペットし、その後渦巻きによって中断します。室温で10分間チューブをインキュベートします。その後、26分間摂氏39度の水浴で各チューブに熱ショックを与え、各チューブを数分ごとに反転させます。チューブを1000倍Gで3分間遠心分離する。上清を捨て、各ペレットを10ミリリットルのYPDでボルテックスで再懸濁させた。この後、すべての20チューブを新しいガラスフラスコに組み合わせます。433ポイント4ミリリットルの液体YPDを新しい1リットルガラスフラスコに加えます。その後、フラスコに66ポイント6ミリリットルの細胞を移す。変換されたセルのボリューム全体を使用するには、この転送プロセスをさらに 2 回繰り返します。次に、新しい500ミリリットル培養のod600を測定する。200 RPMで揺れながら、3つの文化をすべて摂氏28度で2時間インキュベートします。この後、1ミリリットル当たり300マイクログラムの最終濃度に各フラスコにマイクロリットルG418あたり300ミリグラムのゼロポイント5ミリリットルを加える。フラスコを摂氏28度と200RPMの揺れインキュベーターに戻します。残りの20個の円錐管でこのプロセス全体を繰り返します。この時点で、6つの1リットルのフラスコがあり、それぞれにG418を加えた500ミリリットルの細胞を含んでいるはずです。200 RPM で約 2 日間、または各フラスコで約 2 ポイント 3 の od600 が到達するまで、6 つのフラスコすべてを摂氏 28 度でインキュベートします。次に、6 つのフラスコをすべて組み合わせて、単一のカルチャを作成します。この結合培養を使用して、500ミリリットルのYPDおよびG418を有する2つの新しい1リットルフラスコをゼロポイント2のod600に接種する。約2ポイント2のod600に達するまで、200 RPMで揺れ、摂氏28度で一晩これらの新しい文化をインキュベートします。この後、両方の培養を単一の培養物に結合し、結合培養のod600を測定する。遠心分離機この培養物の25ミリリットルをGの1000倍で3分間用いた。テキスト プロトコルで説明されているように、25 ミリリットルのセルの合計 od600 単位の数を計算します。上清を捨て、1ミリリットル当たり55個の1ポイント8のod600を持つ細胞懸濁液を作成するのに十分な水で細胞を再懸濁する。ガラスビーズを使用して、再懸濁細胞の1ミリリットルを5-FOAの12の大きな正方形の完全な合成寒天プレートのそれぞれにプレートします。1~2日間、または芝生がプレートに形成されるまで、各プレートを摂氏28度でインキュベートします。次に、小さな滅菌スキージを使用して、プレートの半分から細胞をスクラップし、35ミリリットルの滅菌水を含むチューブに入れます。残りの6枚のプレートに対してこのプロセスを繰り返し、水中の細胞の2つのチューブを生成します。細胞懸濁液を単一フラスコに組み合わせ、水をブランクとして使用して懸濁液のod600を測定する。od600が44ポイント4ミリリットルに達するまで、水を使用して細胞濃度を調整します。次に、細胞の冷凍庫の在庫を準備し、テキストプロトコルで概説されているようにマイナス80°Cで保存します。この研究では、S.CerevisiaeとS.Paradoxusが交配して生殖不能ハイブリッドを形成し、突然変異誘発に転置される。各変異原性クローンは、1つの遺伝子の1つの対立遺伝子が破壊されるジプロイドハイブリッドであるヘミジゾーテである。ヘミジゴは高温で競われ、DNAは各培養物から分離される。DNAはシャーリングされ、アダプターに結び付けられ、トランスポゾンとゲノムの間の接合は、トランスポゾン特異的なプライマーおよびアダプタ特異的プライマーによって増幅される。アンプリコンからのバルクシーケンス読み込みカウントをカウントし、母集団におけるクローンの適合性を報告します。このシーケンシングからの結果を手にして、与えられた遺伝子のヘミジゴテの豊富さは、2つのクラスのヘミジゴテ間の2つの温度で比較することができる。S.Cerevisiaeアレールだけが野生のタイプと機能的であったクローン、およびクローンはS.Paradoxusアレーレだけに依存していました。この代表的な実装では、8つのハウスキーピング遺伝子で強いシグナルが検出されます。いずれの場合も、ハイブリッド中のS.Cerevisiaeアレーレ内のトランスポゾン挿入は、高温での成長を損なった。これらの低siは、S.CerevisiaeとS.Paradoxusを区別する耐熱特性の候補決定因子を表した。この実験が完了したので、寒さや塩耐性など、これらの種の間で異なる他の形質を解剖することができます。

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遺伝学

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