Name: 疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶレンチウイルスCRISPR/Cas9を用いたマウス造血幹細胞のゲノム編集法。疾患モデル開発に有用で、従来法より迅速かつ低コストに特定変異を導入できる。

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S.S.は、アメリカ心臓協会のポスドク・フェローシップ17POST33670076によって支援されました。K. W. は、NIH 助成金 R01 HL138014、R01 HL141256、および R01 HL139819 によってサポートされました。

動物の被験者を含むすべての手順は、バージニア大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. レンチウイルス粒子の生成と精製
注:最適化されたガイドRNAを含むレンチウイルス粒子は、Addgeneによって提供される詳細なプロトコルによって生成することができます: <https://media.addgene.org/cms/ファイル/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf)>。高チターレンチウイルスの調製および貯蔵のための最適化された方法は、他の場所で議論されています 17,18.簡単に言えば、レンチウイルスは、レンチウイルスベクタープラスミド、psPAX2、およびpMD2.GをHEK 293T細胞に共トランスフェクションすることによって産生される。培養上清は48時間後トランスフェクションで採取し、超遠心分離によって濃縮される。レンチウイルス力価は、市販のqPCRベースのアッセイによって決定される。この手順は、バイオセーフティクラスIIキャビネットで実行する必要があります。
<ol><li>コラーゲンの1:200溶液を調作する(0.0005%)1x PBSで。</li>
	<li>6ウェルプレートにコラーゲン溶液を塗り、37°C、5%CO2~30分間インキュベートします。</li>
	<li>種子293T細胞をウェル当たり1x106細胞の密度で、37°C、5%CO2〜2hでインキュベートする。</li>
	<li>3つのトランスフェクションプラスミドを1つのウェルに対して調製するには、レンチウイルスベクターの0.9 μg、psPAX2の0.6 μg、pMD2.Gの0.3 μgを組み合わせ、脱イオン水を加えて10μLの総体積を達成します。井戸の数に応じて、それに応じて量を調整します。各プラスミドの量と比率は、研究者のニーズに合わせてさらに最適化する必要があります。.</li>
	<li>希釈されたPEI MAX(1.0mg/mL)の1x PBSの50 μLと5μLをプラスミド混合物に慎重に加え、室温(RT)で15分間インキュベートします(表1)。</li>
	<li>混合物にDMEMの1 mLを追加します。</li>
	<li>6ウェルプレートから吸引培地を、プラスミド混合物の1mLを加え、37°C、5%CO2〜3時間でインキュベートする。</li>
	<li>新鮮なDMEMの2 mLでメディアを交換し、37 °C、24時間のCO25%でインキュベートします。</li>
	<li>新鮮なDMEMを1mL加え、37°Cでインキュベートし、さらに24時間(合計インキュベーション時間は48時間)の場合は5%CO2をインキュベートします。</li>
	<li>培養上清を50mLチューブに移し、遠心分離機を3,000 x gで15分間移し、自由浮動細胞を除去します。</li>
	<li>0.45 μm フィルターを通して上清をフィルター処理します。</li>
	<li>濾液をポリプロピレン遠心管に移します。</li>
	<li>4 °Cおよび72,100 x gのr最高で3時間の超遠心分離機。</li>
	<li>慎重に上清を吸引し、白いペレットの後ろに残します。</li>
	<li>無血清無血質細胞膨張培地の100μLを通気なしでペレットを再中断する。</li>
	<li>10 μLのアリコートを保持してウイルスの定量を測定し、必要になるまで-80 °Cで残りのアリコートをすべて保存します。</li>
	<li>10 μLウイルスアリコートを使用して、製造元の指示に従ってqPCRベースのアッセイでウイルスを刺激します。</li>
</ol>2. マウス骨髄からの系統陰性細胞の単離と伝達 (図1A)
注:通常、十分な細胞を単離するために、脛骨、大腿骨、およびフエリのペアは、各マウスから収穫される。骨盤および脊柱の骨はまた系統陰性細胞の源として収穫されてもよい。
<ol><li>骨髄細胞の分離<ol>
<li>8-10週齢の雄CRISPR/Cas9ノックインマウスを5%イソフランで安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行い、70%のエタノールで皮膚を消毒する。</li>
		<li>解剖はさみを使用して、胸部のすぐ下の皮膚に横切開を行い、脚と腕を露出させるために両方向に皮膚を遠離して剥離します。</li>
		<li>股関節を脱臼して下肢を股関節から慎重に分離します。大腿骨の頭部に沿って切断し、股関節から大腿骨を完全に取り除きます。膝を外し、骨のエピフィシスをそのままにしながら、大腿骨と脛骨を分離するために関節で切断します。足首関節を外し、足と余分な筋肉を剥離します。</li>
		<li>解剖はさみを使用して、上肢を切り離すために肩の上にカットします。肩を外し、肘関節で切断して骨を採取する。</li>
		<li>セルロース繊維ワイプを使用して、大腿骨、脛骨、フセリから筋肉を慎重に除去します。このプロセス中に骨が壊れないように特別な予防措置を講じてください。</li>
		<li>分離した骨をRPMIを含む50mLの円錐形チューブに入れ、氷の上に置きます。 注:バイオセーフティクラスIIキャビネットでは、以下の手順を実行する必要があります。</li>
		<li>無菌の100mm培養皿に骨を移します。</li>
		<li>鈍い鉗子で骨をつかみ、解剖はさみを使用して、慎重に両方のエピフィスをカットします。 注:切断が不十分になると骨髄のフラッシュが不完全になりますが、過度に積極的な切断は細胞喪失につながります。</li>
		<li>10 mL注射器を氷冷RPMIで充填し、22Gの針を使用して、シャフトから骨髄を新しい100mm培養皿に洗い流します。 注: ボーン シャフトが十分にフラッシュされている場合、ボーンは白く半透明になります。そうでない場合は、骨の端部を再切断し、再びフラッシュします。</li>
		<li>すべての骨髄が収集された後、18 G針で10 mL注射器を通して骨髄を数回通過させることによって単細胞懸濁液を作る。10x を繰り返して、単一セルの懸濁液を確保します。</li>
		<li>70 μmの細胞ストレーナーを通して50 mL円錐管に細胞懸濁液をフィルターする。</li>
		<li>4 °Cで10分のための310 x gの遠心分離機。</li>
		<li>上清を吸引し、次の細胞分離プロセスに最適化された分離バッファーの適切なボリュームで細胞ペレットを再中断します。</li>
	</ol></li>
	<li>系統陰性細胞の単離とレンチウイルスの伝導 注:マウス系統陰性細胞は、Cas9トランスジェニックマウス3、またはマウスの他の株の骨髄から単離され、製造業者の指示に従って系統枯渇キットを使用する。典型的には、系統陰性細胞は骨髄核細胞全体の2%~5%を占め、純度は通常、単離後の90%を超える。単離された系統陰性細胞は、20 ng/mL組換えマウスTPOおよび50 ng/mL組換えマウスSCFを補充した無血清無血性血化細胞拡張培地で培養され、その後、多重性で16時間レンチウイルスベクターでトランスメアリングされる。感染 (MOI) = 100。<ol>
<li>系統陰性細胞を単離するには、製造元の指示に従って系統細胞枯渇キットを使用してください。</li>
		<li>単離後、血清フリー血統細胞膨張培地の1mLで系統陰性細胞を再中断した。</li>
		<li>1.5 x 106細胞/mL(5 x 105系統陰性細胞/マウス)の密度で6ウェルプレートに細胞をシードします。</li>
		<li>組換えマウス TPO と SCF をそれぞれ 20 ng/mL および 50 ng/mL の最終濃度でウェルに追加します。</li>
		<li>37°Cで細胞を5%CO2~2hの予備インキュベートする。</li>
		<li>MOI=100、4 μg/mLポリブレン、ペニシリン/ストレプトマイシンをウェルに加え、37°Cでインキュベートし、16-20h(図1B)に5%CO2を加えます。</li>
		<li>翌日、レンチウイルス変換細胞を15mL円錐管に集め、遠心分離機を300gで10分間集める。</li>
		<li>上清を注意深く吸引し、マウス当たり200μLのRPMIでペレットを再中断します。マウスに移植されるまでRTで細胞を保つ(セクション3)。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 細胞を照射したマウスへの移植
<ol><li>骨髄移植の日に、レシピエントマウスを8スライスパイケージに入れ、全身照射(550 Rad/dose、総用量=1100 Rad)の2回の投与量にさらし、各照射セッションの間に約4時間を投与する。</li>
	<li>2回目の照射セッションの後、インスリン注射器を用いてレトロ軌道静脈神経叢(合計200μL)を介して各麻酔レシピエントマウスに系統陰性細胞を注入する(図1C)。</li>
	<li>照射後、マウスは殺菌ケージに収容され、14dの抗生物質を補充した柔らかい食事と飲料水を提供する必要があります。</li>
	<li>骨髄移植後3~4週間で末梢血を分析し、トランスメーションドナー細胞の生着を確認する(セクション4)。</li>
</ol>4. 末梢血のキメラを評価する
<ol><li>5%イソファルランでマウスを麻酔し、毛細管を用いてレトロ軌道静脈から血液サンプルを採取し、K2EDTAチューブに集める(1つの毛細管内の体積は、以下のアッセイに対して十分である)。</li>
	<li>K2EDTAチューブから20μLの血液を5mL丸底ポリスチレン試験管に移し、氷の上に置きます。</li>
	<li>赤血球をlyseするためにRBCリシスバッファーの1.5 mLを追加します。氷の上で5分間インキュベートします。</li>
	<li>ライシスバッファーを中和するには、FACSバッファー(1.5 mL/サンプル)でサンプルを洗浄します。</li>
	<li>4 °Cで5分間rの最高で609 x gの遠心分離機。上清を捨てます。</li>
	<li>モノクローナル抗体のカクテルで細胞をインキュベート(100 μL FACSバッファー/サンプルで希釈)を暗闇の中で20分間RTでインキュベートします。抗体の完全なリストは、上記の材料セクションで提供されています。</li>
	<li>FACSバッファ(2 mL/サンプル)で細胞を1回洗浄します。609 x gの r最大(1,800 rpm) で、4 °C で 5 分間遠心分離機。上清を完全に廃棄します。</li>
	<li>4°Cで10分間、固定バッファー(100μL/チューブ)を含むパラホルムアルデヒドで細胞を固定します。</li>
	<li>FACSバッファー(3 mL/サンプル)で細胞を1回洗浄します。609 x gの r最大(1,800 rpm) で、4 °C で 5 分間遠心分離機。上清を完全に廃棄します。</li>
	<li>FACSバッファーの400 μLでペレットを中断します。</li>
	<li>フローサイトメトリーによる分析まで4°Cでサンプルを保管してください。</li>
</ol>

<ol><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li>
<li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+vav%2C+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li>
<li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid%2C+Spontaneous%2C+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li>
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<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
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<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li>
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</ol>

著者は何も開示していない。

このプロトコルの利点は、従来のマウストランスジェニックアプローチと比較して、迅速かつ非常に費用対効果の高い方法で血化細胞の特定の変異を収容する動物モデルの作成です。この方法論により、造血細胞遺伝子操作を1ヶ月以内にマウスの生成が可能となることがわかった。このプロトコルには、さらに検討が必要な重要な手順がいくつかあります。
gRNA配列のスクリーニング
生体内実験を行う前に編集効率を評価するために、インビトロでgRNAをテストすることをお勧めします。gRNAの効率は、無細胞インビトロ転写およびスクリーニングシステムを用いて試験される。転写されたgRNAは、アガロースゲル電気泳動を用いて、組換えCas9タンパク質の存在下でテンプレートDNAを切断する場合の効率を測定することによって検証される。市販のキットは、この目的のために利用可能です。
ここで、インデル変異は、編集された領域から増幅されたPCR産物のTAクローニング、それらのプラスミドで細...

血液学と免疫学の多くの研究は、Mx1-Cre、Vav-Creなどの血液系特異的なCreドライバを利用する従来および条件付きトランスジェニック/ノックアウトマウスを含む遺伝子組み換えマウスの利用可能性に依存しています。1,2,3,4,5.これらの戦略は、時間がかかり、財政的負担になる可能性があり、新しいマウス株の確立を必要とします。ゲノム編集技術の革命的な進歩は、適切な技術的専門知識6、7、8、9とわずか3〜4ヶ月で新しいマウス株の生成を可能にしました、実験を追求する前にマウスのコロニーを増幅するためにはるかに多くの時間が必要です。さらに、これらの手順はコストがかかります。例えば、ジャクソン研究所は、ノックアウトマウス生成サービスの現在の価格を1株当たり16,845ドル(2018年12月現在)でリストしています。したがって、従来のマウストランスジェニックアプローチよりも経済的かつ効率的な方法がより有利である。
クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート/CRISPR関連タンパク質9(CRISPR/Cas9)技術は、迅速かつ効率的なRNAベースの配列特異的ゲノム編集のための新しいツールの開発につながっています。もともと侵入病原体DNAを破壊する細菌適応免疫機構として発見されたCRISPR/Cas9システムは、真核細胞および動物モデルにおけるゲノム編集の有効性を高めるためのツールとして使用されてきた。CRISPR/Cas9機械を造血幹細胞(例えば、エレクトロポレーション、核産生、脂肪減少、ウイルス送達など)に送達するアプローチが数多く採用されています。
ここでは、Cas9発現マウス造血幹細胞に効果的に感染し、ガイドRNA発現構造、プロモーター、調節配列、およびコードする遺伝子を一緒にパッケージ化する能力のために細胞をトランスデュースするためにレンチウイルスシステムが採用されています。蛍光レポータータンパク質(すなわち、GFP、RFP)。この方法を用いて、マウス造血幹細胞のex vivo遺伝子編集が達成され、続いて致死的に照射されたマウス10における骨髄の再構成に成功した。本研究に用いられるレンチウイルスベクターは、レポーター遺伝子から上流に上流の内部リボソーム入口部位を持つ共通コアEF1aプロモーターからのCas9およびGFPレポーター遺伝子を発現する。ガイドRNA配列は、別個のU6プロモーターから発現される。このシステムは、次いで、候補クローン無毛症ドライバ遺伝子Tet2およびDnmt3a10における挿入および欠失変異を作成するために使用される。しかし、この方法による経流効率は比較的低い(~5%-10%)。伝達効率を制限し、生産中にウイルス力を減少させるベクター挿入物(13 Kbp)の大きさのために。
他の研究では、より大きなウイルスRNAサイズがウイルス産生とトランスダクション効率の両方に悪影響を及ぼすことが示されている。例えば、挿入サイズの1kbの増加は、ウイルス産生を〜50%減少させることが報告され、および経転移効率はマウス造血幹細胞11において50%以上に減少する。したがって、システムの効率を向上させるためにウイルスインサートのサイズを可能な限り小さくすることが有利である。
この欠点は、Cas9トランスジェニックマウスを採用することによって克服することができ、Cas9タンパク質は構成的または誘導可能な方法12のいずれかで発現される。構成的なCRISPR/Cas9ノックインマウスは、ローザ26遺伝子座のCAGプロモーターからCas9エンドヌクレアーゼおよびEGFPをユビキタスな方法で発現する。これにより、コアEF1aプロモーターの制御下にあるU6プロモーターおよびRFPレポーター遺伝子の制御下でsgRNAを用いて構築し、レンチウイルスベクターを用いてゲノム編集を達成することができる。このシステムにより、造血幹細胞の遺伝子の編集に成功し、約90%の経流効率を示しました。したがって、このプロトコルは、標的遺伝子変異が人工系に導入されるマウスを迅速かつ効果的に作成する方法を提供する。私たちの研究室は、主に心血管疾患プロセス13、14、15におけるクローンヘマチオピスの役割を研究するために、このタイプの技術を使用していますが、それはまた、血液学の研究に適用可能です悪性腫瘍16.さらに、このプロトコルは、HSPCにおけるDNA突然変異が、人工システムにおける他の疾患または発達過程にどのように影響するかの分析に拡張することができる。
堅牢なレンチウイルスベクターシステムを確立するためには、高価気力ウイルスストックと血行細胞の移植および移植のための最適化された条件が必要とされる。プロトコルでは、セクション1の高チテーターウイルスストックの調製に関する指示が提供され、セクション2におけるマウス造血幹細胞の培養条件を最適化し、セクション3における骨髄移植の方法、および評価を行う。セクション4の移植。

<table><tbody><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Sulfamethoxazazole and Trimethoprim injection</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>293T 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216--</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>APC-抗マウス Ly6C (クローン AL-21)</td><td>BD Biosciences</td><td>560599</td><td>抗体</td></tr><tr><td>APC-Cy7-抗マウスCD45R(RA3-6B2)</td><td>BDバイオサイエンス552094</td><td></td><td>抗体</td></tr><tr><td>BDルアーロック使い捨て注射器、10mlBD</td><td></td><td></td><td>309604一般供給</td></tr><tr><td>BDマイクロテーナー採血管、K2EDTA追加BD</td><td>バイオサイエンス</td><td>365974</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>BDプレシジョングライド針、18G</td><td>305195 BD</td><td>一般供給</td><td></td></tr><tr><td>BDプレシジョングライド針、22 G&nbsp;</td><td>BD</td><td>305155</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>BV510-抗マウス CD8a (クローン 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100752</td><td>抗体</td></tr><tr><td>BV711-抗マウス CD3e (クローン 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100349</td><td>抗体</td></tr> 子<tr><td>牛の皮膚からのコラーゲン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9007-34-5</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>Corning Costar 超低アタッチメント マルチプルウェルプレート、6 ウェル&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS3471</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 ノックインマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>028555</td><td>マウス</td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>クリア H2O</td><td>70-01-5022</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>ダルベッコ 'のモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM) - 高グルコース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td>メディウム</td></tr><tr><td>eBioscience 1X RBC 溶解バッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>00-4333-57</td><td>溶液</td></tr><tr><td>ファルコン 100 mm TC処理細胞培養ディッシュ</td><td>ライフサイエンス</td><td>353003</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>ファルコン 5 mL 丸底ポリスチレン試験管</td><td>ライフサイエンス</td><td>352054</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>ファルコン 50 mL 円錐形遠心分離管</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>352098</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>ファルコン 6 ウェル クリア フラットボトム TC 処理マルチウェル細胞培養プレート&nbsp;</td><td>ライフサイエンス</td><td>353046</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド マイクロヘマトクリット キャピラリーチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-362566</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 滅菌細胞ストレーナー、70 &mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>General Supply</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)</td><td>Invitrogen</td><td>11-0042-85</td><td>Antibodies</td></tr><tr><td>Fixation Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554655</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td><td>Clontech</td><td>632636</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Isothesia(イソフルラン)溶液</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Lenti-X qRT-PCR滴定キット&nbsp;</td><td>Takara</td><td>631235</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHV004SL</td><td>general supply</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Solution</td></tr><tr><td>PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)</td><td>eBioscience</td><td>25-1152-82</td>抗体<td>と関連製品</td></tr><tr><td>PEI MAX</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td>溶液</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン混合物</td><td>ロンザ</td><td>17-602F</td><td>溶液</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-抗マウス Ly6G (クローン 1A8)</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td></td></tr>抗体 <tr><td>pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>57823</td><td>プラスミド</td></tr><tr><td>pMG2D</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>プラスミド</td></tr><tr><td>ポリブレン感染/トランスフェクション試薬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td>溶液</td></tr><tr><td>ポリプロピレン遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>326823</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>プラスミド</td></tr><tr><td>RadDisk&ndash;げっ歯類照射器ディスク</td><td>Braintreeサイエンティフィック</td><td>IRD-P M</td><td>一般供給</td></tr><tr><td>組換えマウスSCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>溶液</td></tr><tr><td>組換えマウスTPO&nbsp;</td><td>ペプロテック&nbsp;</td><td>315-14</td><td>Solution</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>09600</td><td>Solution</td></tr><tr><td>TOPO TA クローニングキット One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>K457501</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Solution&nbsp;</td></tr></tbody></table>

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスcrispr/cas9媒介ゲノム編集

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

従来のトランスジェネシスアプローチを使用して造血幹細胞の遺伝子を操作することは、時間がかかり、コストがかかり、困難な場合があります。ゲノム編集技術とレンチウイルス媒介トランスジーン送達システムの進歩の恩恵を受け、造血幹細胞で遺伝子が特異的に操作されるマウスを確立する効率的かつ経済的な方法がここに記載されています。レンチウイルスは、特定の遺伝子と赤色蛍光レポーター遺伝子(RFP)を標的とするガイドRNA(gRNA)を用いてCas9発現系統陰性骨髄細胞をトランスデュースするために使用され、次いでこれらの細胞を致死照照照射C57BL/6マウスに移植する。非標的gRNAを発現するレンチウイルスで移植されたマウスは、対照として使用される。トランスプリエド造血幹細胞の移植は、末梢血のRFP陽性白血病のフローサイトメトリック解析により評価される。この方法を用いて、移植後4週間でミエロイド細胞の約90%、リンパ球細胞の約70%のトランスダクションを達成することができる。ゲノムDNAはRFP陽性血液細胞から単離され、標的部位DNAの一部をPCRによって増幅してゲノム編集を検証します。このプロトコルは、血化調節遺伝子のハイスループット評価を提供し、血化細胞関与を有する様々なマウス疾患モデルに拡張することができる。

上記のプロトコルを用いて、マウス当たり約0.8〜1.0 x 108個の骨髄細胞が得られた。我々が得る系統陰性細胞の数は、マウスあたり約3 x 106細胞である。典型的には、骨髄系統陰性細胞の収率は、全骨髄核細胞の4%〜5%である。
トランスメ因細胞のキメラ(RFP陽性)は、末梢血の流れサイトメトリーによって評価される(図2A、B)。血液は、レトロ軌道静脈から単離され、適切なマーカーは、各血統細胞集団(すなわち、好中球、単球、T細胞など)のアイデンティティを決定するために使用されます。(図3A、B)。ゲノムDNAはRFP陽性血液細胞から単離することができ、標的部位DNAの切片をPCRで増幅し、配列分析のためにTAクローニングベ...

CRISPR/Cas9システムによるマウス造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の高効率ゲノム編集のためのプロトコルは、造血系特異的遺伝子改変を用いたマウスモデルシステムを迅速に開発する。

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

造血幹細胞に特異的に遺伝子操作を行うマウスを確立する効率的で経済的な方法を開発しました, ゲノム編集技術とレンチウイルス媒介トランス遺伝子デリバリーシステムを使用.このプロトコルの利点は、従来のマウストランスジェニックアプローチと比較して、造血細胞に特異的な変異を含む動物モデルを迅速かつ費用対効果の高い方法で作成できることです。この手順を実証することは、私の研究室の研究者であるイン・ワンです。レンチウイルス粒子を生成するには、コラーゲン溶液で6つのウェルプレートをコードし、摂氏37度と5%の二酸化炭素で30分間インキュベートします。次いで、293T細胞をプレートにシードし、さらに2時間インキュベートします。一方、レンチウイルスベクターの0.9マイクログラム、psPAX2の0.6マイクログラムおよびpMD2の0.3マイクログラムを組み合わせることによって、3つのトランスフェクションプラスミドの混合物を調製する。G及び1ウェルあたり10マイクロリットルに脱イオン化した。次に、プラスミド混合物に50マイクロリットルの1X PBSと5マイクロリットルの希釈されたPEI MAXを慎重に加え、室温で15分間インキュベートする。インキュベーションの後、DMEMを1ミリリットル加えます。6つのウェルプレートから培地を吸引し、各ウェルにプラスミド混合物を1ミリリットル加えます。さらに3時間プレートをインキュベートします。メディアを新鮮なDMEMに交換し、24時間インキュベートします。新鮮なDMEMを1ミリリットル加え、さらに24時間インキュベートします。合計48時間のインキュベーションの後、上清を50ミリリットルチューブに移し、3000倍Gで遠心分離機を15分間送り、自由浮遊細胞を取り除きます。上清を0.45マイクロメートルのフィルターでフィルターし、超遠心分離機で3時間フィルターします。上清を慎重に吸引し、白いペレットを残します。ペレットを100マイクロリットルの無血清造血細胞拡張培地で再懸濁します。10マイクロリットルのアリコートを保管してウイルス用タイターを測定し、残りのサスペンションをマイナス80°Cで保存して使用する準備ができるまで保管します。骨を単離した後、RPMIで50ミリリットルの円錐形チューブに入れ、チューブを氷の上に置きます。バイオセーフティキャビネットで、骨を無菌100ミリメートル培養皿に移します。その後、鈍い鉗子で骨をつかみ、解剖はさみを使用して慎重に両方の骨端を切断します。10ミリリットルのシリンジに氷冷RPMIを充填し、22ゲージの針を使用して、シャフトから新しい100ミリメートル培養皿に骨髄を洗い流します。すべての骨髄が採取された後、18ゲージ針で10ミリリットルの注射器を通して骨髄を通過させることによって、単一の細胞懸濁液を作る。70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に細胞懸濁液をろ過します。その後、原稿の方向に従って管を遠心分離し、上清を吸引する。最適化された分離バッファーの適切な量で細胞ペレットを再中断します。系統陰性細胞を分離するには、製造業者の指示に従って系統細胞枯渇キットを使用します。無血清造血細胞拡張培地で単離された系統陰性細胞を再懸濁する。2時間の間、5%の二酸化炭素で37°Cで細胞を事前インキュベートします。次に、原稿の指示に従ってレンチウイルスを追加し、さらに16〜20時間インキュベーターに細胞を残します。翌日、レンチウイルス導入細胞を15ミリリットル円錐形チューブに集め、10分間Gの300倍に遠心分離する。NHAガイドラインによると、リースグループレベル2でレンチウイルスベクターを扱うことが重要です。施設の規制に基づき、予防措置を講じる必要があります。上清を慎重に吸引し、1本のマウスにつき200マイクロリットルのRPMIでペレットを再懸濁します。マウスに移植するまで、細胞を室温に保ちます。2回目の照射セッションの後、インスリン注射器を用いて、経線陰性細胞を各麻酔マウスにレトロ眼窩注射する。骨髄移植後3~4週間後、毛細管を用いてレトロ眼窩静脈から血液サンプルを採取する。20マイクロリットルの血液を丸底のポリスチレン試験管に移し、氷の上に置きます。RBCリシスの後、モノクローナル抗体のカクテルを暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を洗浄、固定、遠心分離し、FACSバッファーの400マイクロリットルに細胞ペレットを再中断します。フローサイトメトリーで分析するまで、サンプルを摂氏4度に保ちます。系統陰細胞伝達の成功はRFPのフローサイトメトリック検出と評価することができる。7日間のインビトロ培養の後、平均して75.7%の細胞が導入されたことが実証されている。フローサイトメトリーは、トランスサイクリックおよび非トランスデューセド造血幹細胞で再構成した後のマウス末梢血の解析にも使用されています。好中球の平均94.8%、単球の93.5%、および82.7%のB細胞がRFPを発現する。RFP陽性血液細胞からのゲノムDNAは、PCR増幅され、配列解析のためにサブクローニングされている。様々な突然変異が検出され、69%のクローンがフレーム外または早期停止突然変異を示す。この手順を成功させるためには、高いウイルス対策ストックの調製と造血細胞のトランスダクションおよび移植のための最適化された条件が必要である。この手法を応用して、心血管疾患の法則を研究しています。しかし、それはまた、造馬性悪性腫瘍を研究するために有用である.この方法により、造血系における新しい遺伝子の機能を高効率かつ高い方法で研究することができます。私たちは、トランスジェニックマウスの可用性上にこれを収集します。

lentiviral-crisprcas9-mediated-genome-editing-for-study-hematopoietic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

CRISPR/Cas9 を使用して、編集対象となる遺伝子は、遺伝子の生物機能の理解を促進しています。ここでは、その発癌性の活動を研究するためにサイトカイン依存性造血細胞のモデル カルレティキュリン変異に CRISPR/Cas9...

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9...

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

組立 Cas9 を利用した複雑なリボ核タンパク質 (RNP)...

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン...

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

ここに提示される、チューブエレクトロポレーションを用いて哺乳動物細胞における効率的なCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介遺伝子編集のためのプロトコルである。...

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

造血幹細胞生物学および造血悪性腫瘍をよりよく研究するためには、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の体細胞変異を忠実にモデル化するための新しい戦略が必要です。ここでは、CRISPR/Cas9とデュアルrAAVドナー形質導入の使用を組み合わせることにより、HSPCにおけるヘテロ接合機能獲得変異をモデル化するためのプロトコルについて説明します。...

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

THP-1細胞株は、さまざまな生物学関連研究領域において、ヒト単球/マクロファージの機能を調べるためのモデルとして広く使用されています。この記事では、効率的なCRISPR-Cas9ベースのエンジニアリングとシングルセルクローン単離のためのプロトコルについて説明し、堅牢で再現性のある表現型データの生成を可能にします。...

エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

ここでは、CRISPR/Cas9技術とCell Counting...

CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

学ぶレンチウイルスCRISPR/Cas9を用いたマウス造血幹細胞のゲノム編集法。疾患モデル開発に有用で、従来法より迅速かつ低コストに特定変異を導入できる。

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

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