Name: カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶC. elegansにおけるシナプス・筋肉・ミトコンドリアの形態学的変化の定量的解析手法。CellProfilerとFijiを用いて、遺伝子変異の影響を客観的に評価し、疾患関連研究への応用可能性を示します。

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私たちは、貴重な議論と入力のためのノイマンラボのメンバーに感謝します。いくつかの株は、研究インフラプログラム(P40 OD010440)のNIHオフィスによって資金提供されているCGCによって提供されました。著者らは、C.エレガンスに関する豊富な情報に関するWormBaseに感謝し、モナッシュ大学モナッシュマイクロイメージングに関するインストルメンテーション、トレーニング、技術サポートの提供を認めています。この研究は、CMTAA研究助成金(2015年と2018年)、NHMRCプロジェクト助成金1101974および1099690によってB.Nに授与されました。

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<li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li>
<li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. , (2017).</li>
<li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+C.+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Genetics. , (2014).</li>
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<li>Koushika, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Caenorhabditis+elegans+cytoplasmic+dynein+components+reveal+specificity+of+neuronal+retrograde+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo.</a> Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).</li>
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<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+High-Resolution+Second-Harmonic+Generation+Imaging+of+Endogenous+Structural+Proteins+in+Biological+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
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<li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ilastik%3A+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%222011+IEEE+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging%3A+From+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans%2C+Drosophila+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+image+restoration+and+segmentation%3A+A+generalized+linear+model%2Fbregman+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Computer+Vision%22%5BJournal%5D)">Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective.</a> International Journal of Computer Vision. , (2013).</li>
<li>Rizk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantification+of+subcellular+structures+in+fluorescence+microscopy+images+using+Squassh%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh.</a> Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).</li>
<li>Akella, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEC-17+is+an+alpha-tubulin+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase.</a> Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).</li>
<li>Neumann, B., Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MEC-17+leads+to+microtubule+instability+and+axonal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration.</a> Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).</li>
<li>Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+alpha-tubulin+K40+acetyltransferase+alphaTAT1+promotes+rapid+ciliogenesis+and+efficient+mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).</li>
<li>Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maintenance+of+synaptic+structure+is+mediated+by+the+alpha-tubulin+acetyltransferase+MEC-17%2F%CE%B1TAT1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1.</a> bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).</li>
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<li>Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+regulation+of+mitofusin-2+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease.</a> Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).</li>
<li>Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+genes+associated+with+Charcot-Marie-Tooth+type+2+lead+to+common+behavioural%2C+cellular+and+molecular+defects+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , 605584(2019).</li>
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<li>Zhu, P. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+Intermolecular+Domain+Interactions+of+the+C-terminal+GTPase+Effector+Domain+of+the+Multimeric+Dynamin-like+GTPase+Drp1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).</li>
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<li>Trevisan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Mitochondria+Dynamics+Reveals+Separate+Roles+for+Form+and+Function+in+Mitochondria+Distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution.</a> Cell Reports. , (2018).</li>
</ol>

著者らは、彼らが競合する利益を持っていないと宣言します。

形態学的変動は、顕著な差異を手動でカウントするか、または任意の閾値を使用して、野生型表現型と比較して欠陥を決定することにより、しばしば評価されてきた。しかし、最近では、形態学の比較研究に定量的な方法が用いられ、細胞レベルと細胞内レベルの変化を公平に測定・記述することが求められている。フェノタイプ間の微妙でありながら生物学的に関連する違いを特定する能力は、環境因子または遺伝病によって引き起こされる形態の変化を制御する基礎となる分子機構を理解するための強力な手段である。計算能力と顕微鏡イメージング解像度の継続的な増加は、成長の容易さとC.elegans遺伝学の汎用性と相まって、洗練された自由なイメージングソフトウェアの組み合わせのための完璧なプラットフォームを提供しています細かい詳細な共焦点画像を使用します。ここでは、シナプスの大きさとタンパク質の局在化、体壁の筋肉面積と繊維の長さ、および遺伝的背景の範囲におけるミトコンドリア形態を評価し、定量化する方法を実証した。
これらの分析は微妙な形態学的な違いを定量化する能力を実証していますが、限界があります。これらの分析のそ...

線虫カエオルハブ炎エレガンス(C.エレガンス)は、ヒト疾患に関与する生物学的および分子過程を明らかにするモデルシステムとしてますます利用されている。成虫線虫は体長がわずか1mm以上で、最大300個の卵1個の大きな雄鶏を作り出すことができます。孵化後、C.エレガンスは成人に達するために3〜4日しか必要とし、約2〜3週間2週間生きる。培養の容易さのために、C.elegansは現在、ヒト疾患の治療法を同定するために費用対効果の高い、迅速な薬物スクリーニングを行うための生体内動物モデルの中で最も人気のあるモデルの1つである。さらに、その遺伝的保全、よく定義された行動パラダイム、蛍光または光顕微鏡のための透明な体、および遺伝子操作の容易さは、遺伝子変異の細胞および分子の結果の研究を容易に達成可能にする3. C. エレガンスゲノムは、約60-80%のオルソロジーをヒト遺伝子と共有し、それらの遺伝子の約40%が疾患に関連することが知られています。C.エレガンスでモデル化され、研究されているヒト疾患には、神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、シャルコット・マリー・トゥース病)、筋肉関連疾患()デュシェンヌ筋ジストロフィー)、および代謝疾患(高血糖)2、4.ほとんどのヒト障害では、疾患誘発性細胞および小器官の局在化および形態的変化が起こり、線虫モデルで容易に評価することができる。
蛍光マーカーは、顕微鏡下での動的可視化のための組織や小器官の標識に広く使用されています。しかし、C.エレガンスでは、遺伝的変異による形態的不規則性を評価する従来の方法は、主に視覚的記述に依存している。定性評価は、より広い範囲の方が意味線の記述(シナプス形態、GFPの束、特定の軸線形状、筋線維の厚さなど)をカバーし、形態学的変化の鳥の目のビューを提供することができますが、それらはあまり適していません。異なるグループ間の小さなバリエーションを比較します。さらに、定性的評価は視覚的、主観的な評価に基づいており、形態学的異常の過度または過少評価につながる可能性があります。最後に、定性的な観測値は個人によっても大きく異なり、データレプリケーションが困難になります。
近年、画像を定量的に分析できる、ユーザーフレンドリーで容易に利用できる計算アルゴリズムが数多く開発されている。しかし、このような画像解析ソフトウェアの利用は、特に体壁の筋肉やミトコンドリアに関連する形態学的研究に対して、C.エレガンスの研究に遅れをとっている。C.エレガンスの基礎構造解析を改善するために、容易に入手可能なオープンソース画像解析ソフトウェアの一部は、筋肉ミトコンドリア、体壁筋およびシナプスに対する遺伝子変異の影響を定量的に比較するために試みられた。形態。これらの実験手順は、これらのプログラム(フィジー、ilastik、CellProfiler、SQUASSH)を使用してシナプスサイズとシナプスタンパク質の局在化、体壁の筋肉面積と繊維長、およびミトコンドリアサイズの変化を評価する方法を詳細に概説します。線虫の遺伝的変異の結果としての循環性。

<table><tbody><tr><td>寒天</td><td>Merck</td><td>1.01614.1000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td>倒立プラットフォーム</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Zeiss Axio Imager M2</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバーガラス #1</td><td>Thermo scientifique</td><td>MENCS22221GP</td><td></td></tr><tr><td>Glassカバースリップ #1.5</td><td>ツァイス</td><td>474030-9000-000</td><td>SCHOTT</td></tr><tr><td>製 ガラススライド</td><td>サーモサイエンティフィク</td><td>MENS41104A/40</td><td></td></tr><tr><td>ライトLED</td><td>ショット</td><td>KL 300 LED</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン (カゼイン由来ペプトン)</td><td>メルク</td><td>107213</td><td>リソジェニーブロス(LB)培地</td></tr><tr><td>酵母エキスの成分</td><td>メルク</td><td>103753</td><td>リゾジェニーブロス(LB)培地</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>106404</td><td>リソジェニーブロス(LB)培地</td></tr><tr><td>ペプトン(肉由来ペプトン)</td>用原料 メル<td>ク</td><td>107214</td><td>線虫増殖培地(NGM)寒天</td></tr>用<tr><td></td><td>原料</td><td>Sigma A1296</td><td>線虫増殖培地(NGM)寒天用原料</td></tr><tr><td>塩化</td><td>ナトリウムメルク</td><td>106404</td><td>線虫増殖培地(NGM)用成分 寒天</td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>線虫増殖培地(NGM)用成分</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>メルク</td><td>102382</td><td>線虫増殖培地(NGM)寒天用成分</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>メルク</td><td>105886</td><td>線虫増殖培地(NGM)寒天用成分</td></tr><tr><td>リン酸ジカリウム</td><td>メルク</td><td>105101</td><td>線虫増殖培地(NGM)用成分 寒天</td></tr><tr>リン酸<td>二水素カリウム</td><td>メルク</td><td>104873</td><td>線虫増殖培地(NGM)寒天用成分</td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>メルク</td><td>106586</td><td>M9緩衝液用成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>106404</td><td>M9緩衝液用成分</td></tr><tr><td>リン酸</td><td>二水素カリウムメルク</td><td>104873</td><td>M9 バッファーの成分</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>メルク</td><td>105886</td><td>M9 バッファーの成分</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>コーニング</td><td>CLS7095D5X-200EA</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>コーニング</td><td>CLS430589-500EA</td><td></td></tr><tr><td>プラチナワイヤー</td><td>シグマ</td><td>267201-2G</td><td></td></tr><tr><td>スパチュラ</td><td>メットアプリ</td><td>2616</td><td></td></tr><tr><td>テトラミソール塩酸塩</td>シ<td>グマ</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

疾患の根底にある細胞機構を定義することは、新しい治療法の開発に不可欠です。これらのメカニズムを解明するために頻繁に使用される戦略は、候補遺伝子の突然変異を導入し、組織および細胞小器官の形態の変化を定性的に記述することです。しかし、定性的記述は微妙な表現の違いを捉えず、集団内の個人間の表現型の変動を誤って表現し、しばしば主観的に評価される。ここで、市販のバイオ画像処理ソフトウェアと組み合わせたレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて線虫ケートカエノルハブ炎エレガンスにおける組織および小器官の形態を研究する定量的アプローチについて説明する。シナプスの完全性(サイズと統合蛍光レベル)、筋肉の発達(筋肉細胞サイズとミオシンフィラメントの長さ)、およびミトコンドリア形態(円形およびサイズ)に影響を与えるフェノタイプの定量的分析を行った。これらの細胞構造に対する遺伝子変異の影響。これらの定量的アプローチは、線虫内の他の組織および小器官の形態を容易に定量的に評価するために容易に使用することができるので、ここで説明する用途に限定されない。

C.エレガンスは、その単純さ、既知の細胞系統、透明性、および利用可能なツールに起因する異なる組織や器官の形態を研究するための理想的なモデル生物です。ここでは、生きた蛍光イメージングと無料のバイオ画像処理ソフトウェアを用いて、シナプスや筋肉を含む小器官(ミトコンドリアなど)や組織を研究するための定量的アプローチを提供する。
通常のシナプス開発にはMEC-17発現の厳格な規制が必要
神経系におけるα-チューブリンアセチルトランスフェラーゼMEC-1714,15,16の機能をさらに理解するために、タンパク質を過剰発現するC.エレガンスにおけるタッチ受容体ニューロンにおけるシナプス形態学を研究した17.これらの細胞構造は、信号が...

本研究では、自由に利用可能な画像処理ツールを用いて、C.エレガンスにおけるシナプスサイズと局在化、筋肉形態、ミトコンドリア形状の定量的測定を概説する。このアプローチにより、C.エレガンスにおける将来の研究は、遺伝的変異の結果としての組織および小器官構造変化の程度を定量的に比較することを可能にする。

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

組織や小器官の形態の変化を定量化する能力は、遺伝子機能と遺伝子変異の影響を理解するために重要です。私たちのプロトコルは、線虫、C.elegansのシナプス、筋肉、ミトコンドリアの形態を非主観的に評価するために自由に利用可能なソフトウェアを使用する方法を説明します。多くの以前の研究は、形態学的変化を比較するための定性的な方法に依存してきました。しかし、これらは微妙な表現の違いを捉えない可能性があり、変化を過度に過小評価して過小評価する可能性があり、主観的に評価されるため、問題になる可能性があります。当社の定量的手法は、形態変化を評価するためのより堅牢で偏った手段を提供します。これらの方法は、遺伝子機能と疾患関連突然変異の結果を定義するために、他の細胞構造またはモデル生物の形態学的変化を研究するために容易に使用することができる。まず、イメージング用のスライドを準備します。溶かしたアガロースを顕微鏡スライドに落とし、すぐに別の顕微鏡スライドで液滴を押し下げ、アガロースを静かに平らにします。アガロースを1分間乾燥させ、2つのスライドを慎重に分離し、スライドの1つに固めたパッドを残します。顕微鏡ステージにスライドを置き、アガロースパッドの中央に麻酔薬の5〜10ミリリットルの滴を追加します。熱殺菌されたピックを使用して、溶液が乾燥する前にストックプレートから麻酔液滴に10〜15匹の動物を素早く移します。その後、アガロースパッドのすぐ上に置いて、静かに落とすことによってカバースリップを適用します。488および552ナノメートルの光学ポンプセミ導体ダイオードレーザーに結合され、画像キャプチャソフトウェアを備えた線走査共焦点顕微鏡でシナプス領域を画像化します。ワームを見つけ、40倍に切り替え、浸漬媒体を塗布します。552ナノメートルレーザー、tagRFPフルオロフォアの1%パワー、488ナノメートル、GFPフルオロフォアの2%パワーで蛍光体を励起することにより、シナプス領域を視覚化します。ハイブリッド光検出器を使用して画像をキャプチャし、フルオロフォアの過度の露出を防ぐためにゲインを設定します。Zスタック画像を収集し、目的に応じて最適なZステップサイズを使用してシナプス全体をカバーします。シナプス領域を分析するには、まず、CellProfiler 3.1.5 ソフトウェアにイメージをロードします。NameAndType モジュールをセットアップし、UIS-115 トランスジーンから表された拡散タグRFP を使用して、手定義でシナプス領域を決定します。パイプラインに MeasureObjectSizeShape モジュールとメジャーオブジェクト強度モジュールを追加して、手定義のシナプスのサイズと蛍光を測定します。次に、CalculateMathモジュールを追加し、JSIS37から得られた積分強度ユニットをUIS-115から得られたもので割ることによって、相対的な集積蛍光強度を計算します。すべての測定値と計算をエクスポートが完了した場合。筋肉細胞の領域を測定するには、フィジーのソフトウェアで画像を開き、ポリゴン選択を使用して、単一の斜めの筋肉細胞の周りを慎重にトレースします。アンカー ドットをドラッグして、最後のポリゴンのラインを調整してトレースを改善します。ソフトウェアの上部にある [分析] タブに移動し、[測定] をクリックして、選択した領域を計算します。退化または欠落した領域を持つ筋肉細胞の場合、ポリゴン選択ツールで欠落領域をトレースし、もう一度[測定]をクリックします。複数のギャップがある場合は、それぞれを別々にトレースします。セル全体の面積に対するギャップ領域の比率を計算します。比率が高い場合は、筋肉変性の程度が高いことを示します。また、不足している領域がない場合、比率はゼロとして計算されます。エラスティックを開き、[新しいプロジェクトの作成] で [ピクセル分類] を選択します。その後、プロジェクトの名前を変更して保存します。[入力データ] タブに移動し、[新規追加] をクリックし、[別のイメージを追加] をクリックします。ポップアップ ウィンドウを TIF ファイルのあるフォルダに移動し、目的の画像を選択します。[機能の選択] タブで[フィーチャの選択]をクリックし、緑色のチェックボックスで示されたすべてのピクセル フィーチャを選択します。このステップで選択するピクセルは、次のステップでピクセルのクラスを区別するために使用されます。トレーニングパネルを使用して、個々のGFP発現ミオシンフィラメントと不要な背景を区別します。ラベルを追加をクリックし、フィラメント間の不要な背景とスペースをスクロールして、分類器のトレーニングを開始します。2つ目のラベルを追加し、フィラメントに名前を変更し、多数のフィラメントをスクロールします。[Live Update] をクリックして、分類が正しく行われていることを確認します。必要に応じて、さらにスクロールを追加してトレーニングを微調整します。トレーニング分類が実行されたら、[予測エクスポート]パネルに移動し、[確率をソースとしてエクスポート画像設定を選択]をクリックします。切り抜きサブ領域 x と y にチェックが付いて、c がチェックされていないかどうかを確認します。c の開始値と終了値としてゼロと 1 を選択し、データ型を符号なし 8 ビットに変換します。[再正規化] にチェックマークを付けて、出力ファイルのビデオを png に変更し、必要に応じてファイルとディレクトリの名前を変更します。エクスポート設定ウィンドウを閉じ、セグメント化されたイメージをエクスポートします。その後、フィジーのソフトウェアでpngファイルを開きます。デフォルト設定を使用してイメージのしきい値を調整し、スケルトン化プラグインを適用すると、別の結果表が作成されます。このプロトコルは、シナプス開発におけるα-チューブリンアセチルトランスセリアーゼMEC-17の機能を探求するために使用されてきた。後部/横方向微小管またはPLMシナプスの画像の定量分析は、MEC-17の過剰発現が正常なニューロン機能を破壊することを示す。MEC-17を過剰発現する野生型制御動物と比較して、シナプス前領域およびシナプス完全性が有意に低下している。これらの技術は、CMT2関連遺伝子の突然変異を運ぶシャルコー・マリー・トゥース2またはCMT2のC.elegansモデルを分析するためにも使用されています。体壁筋形態の視覚的評価は、野生型制御と比較して試験動物の欠損の2.5〜3.5倍の増加を明らかにした。fzo-1およびunc-116の突然変異を有する動物は、筋線条化、細胞の破片の蓄積、および筋線維変性の喪失を経験した。dyn-1の突然変異を有する動物は筋肉形態の欠陥が有意に少なかった。fzo-1およびunc-116変異体は、全単細胞領域に対するギャップの比率が5〜6倍増加し、野生型動物と比較して平均繊維長が劇的に短くなった。サンプル間での比較を行うためには、画像取得に最適な条件を決定し、これらの条件が一貫して使用されるようにすることが重要です。これらの技術は、研究者が定量的アプローチと異なる遺伝的背景間の形態学的変化を比較することを可能にする。これにより、主観性が低下するため、生成されるデータの表現性を高めることができます。

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Research

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Biology

生物学

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