Name: RNA シーケンシングを使用した円形 RNA の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶ円形RNAシーケンスライブラリー調製法。RNase R処理と入力量の最適化により、あらゆる総RNAサンプルから高感度にサークルRNAを検出し、発現分布と機能的役割の解明に貢献します。

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アリゾナ州サンシティのバナーサン健康研究所脳体寄付プログラム(BBDP)に感謝しています。BBDPは、国立神経疾患・脳卒中研究所(U24 NS072026パーキンソン病および関連障害のための国立脳・組織資源)、国立加齢研究所(P30AG19610アリゾナアルツハイマー病コアセンター)、アリゾナ州保健サービス省(契約211002、 アリゾナ・アルツハイマー研究センター)、アリゾナ生物医学研究委員会(アリゾナ・パーキンソン病コンソーシアムに4001、0011、05-901、1001を契約)、マイケル・J。フォックスパーキンソン病研究財団27.この研究はまた、DHSとアリゾナ州(ADHS14-052688)によって支持されました。また、アンドレア・シュミット(バナー・リサーチ)とシンシア・レチュガ(TGen)の行政支援に感謝します。

本研究は、人間の福祉に関するすべての制度、国内、国際的なガイドラインに準拠して行われています。脳組織は、AZのサンシティにあるバナーサン健康研究所脳体寄付プログラムから得られました。脳と身体の寄付プログラムの運営は、西部機関審査委員会(WIRBプロトコル#20120821)によって承認されています。すべてのサブジェクトまたはその法的代理人がインフォームド コンセントに署名しました。市販の(非脳)生体検体はプロテオゲネックスから購入した。
1. RNase R治療
注:以下の工程では、反応体積は50μLの総体積に調整される。これは、RNA クリーンアップおよびコンセントレータ キットで使用される最小サンプル量です (材料表を参照)。さらに、ここで説明する最適化されたプロトコルは、合計 RNA の 4 μg の入力量に対する場合です。入力量 >4 μg には、RNase R 処理のインキュベーション時間を長くすることをお勧めします。
<ol><li>全RNAをマイクロ遠心管内の39°L RNaseフリー水中で4μgに希釈し、ピペットでよく混ぜます。</li>
	<li>別のチューブで、RNase Rを1x RNase R反応バッファーで2 U/μLの作動濃度に希釈します。即時使用のために十分に行います。</li>
	<li>ピペット39μLの全RNAと10x RNase R反応バッファーの5μLを1.5mL反応管に入れ、ピペットによってよく混合する(50°Lは全反応量となる)。次に、RNase R(2 U/μL)を6μL加えます。</li>
	<li>ピペットを完全な反応量(50°L)に調整し、10回上下にピペットをピペットでよく混ぜます。</li>
	<li>チューブを37°水浴に10分間置き、反応量が水浴に浸されていることを確認してください。</li>
	<li>チューブを氷の上に置き、すぐにRNAのクリーンアップと濃度(セクション2)に進みます。</li>
</ol>2. RNA クリーンアップおよびコンセントレータ キットを使用した RNA の精製
注:高品質RNA(RIN>8、DV200>80%)を使用する場合、RNase R処理によりRNAの約60%が失われる可能性があります。4μgの入力を使用して、処理されたRNAの2〜2.5μgがセクション1の後に残っていると推定される。
<ol><li>開始する前に、100%エタノールの48 mLを緩衝濃縮物に加えてRNA洗浄バッファーを準備し、ピペットでよく混合します。精製柱を回収管に配置し(「材料表」を参照)、チューブラックに配置します。 注:次のすべての手順に対して、次の遠心分離設定を使用します。DNase I治療が既に行われている場合は、この段階でDNase I治療をスキップしてください。</li>
	<li>RNase R処理サンプルに2巻のRNA結合バッファーを追加し、ピペットによってよく混合します(総体積:150°L)。</li>
	<li>RNA結合バッファーとRNase R処理サンプル混合物に100%エタノールの1容量を加え、ピペットによってよく混合します(総体積:300°L)。</li>
	<li>ボリューム全体を列に転送し、30 s. 破棄フローの列を遠心分離します。</li>
	<li>400 μLのRNA準備バッファをカラムに直接追加し、カラムを30sの遠心分離し、流れを破棄します。</li>
	<li>700 μLのRNA洗浄バッファをカラムに直接追加し、カラムを30sの遠心分離し、流れを廃棄します。</li>
	<li>400 μLのRNA洗浄バッファをカラムに直接追加し、カラムを2分間遠心分離し、カラムを新鮮なRNaseフリーの1.5 mLチューブに転送します。</li>
	<li>カラムフィルターのすぐ上にあるピペットチップを保持し、カラムフィルターのみに水が着陸するようにすることで、RNaseフリー水を11°L直接カラムに追加します。</li>
	<li>カラムを室温で1分間インキュベートし、遠心分離機を1分間インキュベートします。</li>
	<li>カラムを廃棄する前に、RNaseフリーチューブ内の流れを確認してください。溶出に成功した場合は、サンプルを-80°Cで保存するか、直ちにライブラリの準備を進めます。約10°Lの最終的な総溶出量は、ライブラリの構築に使用されます。 注:停止点: RNA を -80 °C に -80 °C のままにしてから、ライブラリの準備を続行します。</li>
</ol>3. circRNAライブラリ準備
注:このセクションで使用するほとんどの試薬を含むキットについては、材料表を参照してください。
<ol><li>rRNAの枯渇と断片化<ol>
<li>精製RNAの10μLをステップ2.10から新しい96ウェル0.3 mL PCRプレートでクリーンウェルに転送します。井戸に、5μLのrRNA結合緩衝液を加え、続いて5μL rRNA除去ミックスを加えます。軽くピペットを10回上下に混ぜます。</li>
		<li>シールプレートとインキュベートは、事前にプログラムされた予熱サーモサイカーブロックで68°Cで5分間インキュベートします。5分間のインキュベーションが完了したら、プレートをベンチに置き、室温で1分間インキュベートします。</li>
		<li>プレートからシールを取り外します。35 μL のボルテックス室温 rRNA 除去ビーズをサンプルに加えます。ピペットを45°Lに調整し、ピペットを10~20倍に上下に調整して十分に混ぜます。室温で1分間インキュベートプレート。</li>
		<li>プレートを磁気スタンドに移し、スタンドで1分間、または溶液がクリアされるまでインキュベートします。すべての上清(約45°L)を同じプレート上の新しいウェル、または新しいプレートに転送します(使用しているサンプルの数によって異なります)。</li>
		<li>RNAクリーンアップビーズ(材料表参照)をよく分散するまでボルテックスし、各サンプルに99μLのビーズを添加する。ピペットを10倍上下に混ぜます。室温でプレートを10分間インキュベートします。</li>
		<li>プレートを磁気スタンドに移し、さらに5分間、または溶液がクリアされるまでインキュベートします。井戸から上清をすべて取り除き、捨てます。</li>
		<li>プレートを磁気スタンドに残したまま、ビーズを破壊することなく、作りたての80%EtOHを200°L添加します。30sをインキュベートし、エタノールを取り出して廃棄します。合計 2 つのワッシュに対して繰り返します。</li>
		<li>溶出バッファーの11 μLを各ウェルに加え、ピペットを10回上下に加えます。室温で2分間インキュベートし、溶液が消えるまで磁気スタンドに移します(1~5分)。</li>
		<li>上清の8.5°Lを井戸から同じプレート上の新しい井戸または新しいプレートに移します。溶出、プライマー、フラグメントハイミックスの8.5°Lを各ウェル含有サンプルに加えます。ピペットを10回上下に切り、徹底的に混ぜます。</li>
		<li>シールプレートとインキュベートは、事前にプログラムされた予熱サーモサイカーブロックで94°Cで8分間インキュベートします。4°Cに達したらサーモサイカーから取り出し、遠心分離機を短時間で取り出します。 注:すぐに合成ファーストストランドcDNAプロトコルに進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>cDNAの合成<ol>
<li>調製するサンプルごとに、9 μL ファーストストランド合成ミックスを1μLの逆転写酵素と混合します(材料表を参照)。混合物の8°Lをサンプルに加えます。ピペットを上下に6回混ぜます。<ol>
<li>シールプレートとインキュベートは、次のパラメータを使用して、事前にプログラムされた、予熱されたサーモサイカーブロック上でインキュベートする:25°C10分、15分の場合は42°C、15分で70°C、4°Cホールド。直ちに第2鎖合成に進む。</li>
		</ol>
</li>
		<li>各サンプルに5μLのリサスペンションバッファを加え、その後に20°Lのセカンドストランドマーキングマスターミックスを加えます。ボリューム全体を6回上下にピペットします。</li>
		<li>シールプレートとインキュベートは、事前にプログラムされた、予熱されたサーモサイカーブロックを1時間16°Cに設定します。インキュベーションの後、サーモサイカーからプレートを取り出し、室温まで平衡化させます。</li>
		<li>ボルテックスPCR精製ビーズ(材料表参照)を使用し、サンプルの各ウェルに90μLビーズを追加します。ピペットを10回上下に切り、徹底的に混ぜます。室温で10分間インキュベートする。</li>
		<li>ビード/サンプルミックスを磁気スタンドに移し、5分間または液体が消えるまでインキュベートします。上清を取り除いて捨てる。</li>
		<li>各サンプルに200 μLの80%EtOHを加えます。30sの室温で磁気スタンド上のサンプルをインキュベートする。1x を繰り返します。</li>
		<li>ビーズを室温で6分間乾燥させ、磁気スタンドから取り出します。</li>
		<li>リサスペンションバッファの19.5°Lでビーズを再サスペンドします。ピペットを10回上下に切り、徹底的に混ぜます。室温で2分間インキュベートし、磁気スタンドに移し、さらに1分間、または液体がクリアされるまでインキュベートする。</li>
		<li>新しい井戸/新しいプレートに上清の17.5 μLを転送します。 注:すぐに進まない場合、サンプルは-20°Cで最大7日間保存できます。</li>
	</ol></li>
	<li>図書館の準備<ol>
<li>Aテーリングミックスの12.5°Lを各ウェルに加えます。ボリューム全体を上下に10回ピペットして混ぜます。</li>
		<li>次のパラメータを使用して、事前にプログラムされた予熱されたサーモサイカーブロック上の反応を37°Cに設定してインキュベートします:30分の場合は37°、5分間は70°C、4°Cホールド。サンプルが4°Cに達したら、直ちにアダプターライゲーションに進みます。</li>
		<li>各サンプルに2.5μLのリサスペンションバッファ、ユニークなRNAアダプタの2.5°L、およびライゲーションミックスの2.5°Lを追加します。ピペットを10倍上下に混ぜます。</li>
		<li>事前にプログラムされた、予熱されたサーモサイカーブロック上のサンプルを30°Cで10分間インキュベートします。</li>
		<li>各サンプルにストップライゲーションバッファを5μL加え、ピペットを上下に加え、混ぜます。</li>
		<li>各サンプルに42μLの混合PCR精製ビーズを加え、十分に混ぜます。手順 3.2.6 ~ 3.2.10 に従いますが、リサスペンションボリュームを 52 μL に、最終溶出ボリュームを 50 μL に変更します。</li>
		<li>手順 3.3.6 の 50 μL 溶出で PCR 精製ビード プロトコルをもう一度繰り返しますが、リサスペンションボリュームを 22 μL に、最終溶出量を 20 μL に変更します。 注:すぐに進まない場合、サンプルは-20°Cで最大7日間保存できます。</li>
		<li>各サンプルにPCRプライマーカクテル5μL、PCRマスターミックス25°Lを加えます。10回上下にピペットで混ぜます。次のパラメータを使用して、事前にプログラムされた予熱されたサーモサイカーブロック上の反応をインキュベートする: 98 °C 30 s;その後、10sの場合は98°C、30sでは60°、30sの場合は72°Cの8サイクル。その後、5分間72°C、その後4°ホールド。 注:シーケンス処理に十分な量のライブラリを生成するには、PCR サイクルの総数の最適化が必要な場合があります。</li>
		<li>PCRビーズ精製のプロトコル(ステップ3.2.4~3.2.9)に従い、50μLの混合PCR精製ビーズを追加し、最終的な溶出量を30°Lの最終溶出量で32.5μLに変更します。 注:サンプルは-20°Cで保存する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>核酸分析装置を用いた定量・品質管理<ol>
<li>テープと試薬が室温で30分間平衡化できるようにします。</li>
		<li>2μLのライブラリをHS D1000バッファの2°Lと混合し、互換性のあるウェルプレートに追加します。</li>
		<li>互換性のあるホイルシールでしっかりとシールし、2,000 rpmで1分間渦を密閉します。</li>
		<li>ソフトウェアプロンプトに従って、アナライザーのプレートをスピンダウンしてロードします。 注:ライブラリのサイズは約 260 bp にする必要があります。</li>
	</ol></li>
</ol>4. データ分析ワークフロー
<ol><li>シーケンス RNA-seq ライブラリー (材料の表を参照)は、82 bp のペアエンド読み取りを生成します。bcl2fastq ツール (v0.2.19) を使用して、ベースコール ファイル (.bcl) の形式の生シーケンシング データを FASTQ に変換します。</li>
	<li>circRNA を検出します。 注:アンサンブルcircRNA検出アプローチが単一検出ツール21、22を使用する場合に比べてより良いパフォーマンスを発揮するという以前に報告された証拠に基づいて、circRNA検出に複数のツールを使用することをお勧めします。ここでは、circRNAは、find_circ、CIRI、CIRCexplorer、マッププライス、ナイフ、およびDCCの6つの既存のcircRNA予測アルゴリズムを使用して同定され、各アルゴリズムに推奨されるパラメータ設定を適用しました。<ol>
<li>開発者が提供する指示に従って、Linux ハイパフォーマンス・コンピューティング・クラスターに各 circRNA 検出アルゴリズムをダウンロードしてインストールします。</li>
		<li>各ツールに推奨されるアライナーを使用して、参照ゲノム(GRCh37)に対してRNA-seq FASTQを位置合わせします。</li>
		<li>アライメントに従って、それぞれの推奨パラメータ設定を適用してcircRNA検出アルゴリズムを実行します。</li>
		<li>各ツールは、検出されたcircRNAのリストを含む複数列の結果ファイルを出力し、circRNA座標とサポート読み取りの数を抽出して、各サンプル/テスト条件で検出された候補の数を定量化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CIRI、Mapsplice、および DCC によって出力される circRNA 座標を 0 ベースの座標に変換して、他の 3 つのアルゴリズムと一致させます。</li>
	<li>2 つ以上のサポート読み取りまたは下流の分析と比較を含む circRNA を選択します。表 1は、各サンプルに対して生成されたシーケンス読み取りの合計数と共に、この調査で評価されたすべてのパラメーターとをまとめたものです。</li>
	<li>サンプル/テスト条件ごとに、検出された circRNA の数を、そのライブラリに対して生成されたマップされた読み取りの数 (100 万件あたり) に正規化します。[代表的な結果]で詳しく説明されているように、箱ひげ図のさまざまなツール/サンプルにわたる結果を要約します。</li>
</ol>

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<li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

本研究では、2つの市販のライブラリー調製キット、前処理オプション、および入力RNA量を試験し、circRNAシーケンシングライブラリの構築のためのcircRNA濃縮プロトコルを最適化した。この研究の評価に基づいて、circRNAシーケンシングライブラリを作成する際の重要な側面と重要なステップの数が明らかです。我々の評価は、検出されたcircRNAの数の増加によって反映されるRNase R前処理の有用性を確認する。全体として、RNase R前処理および4μgの入力RNAを用いたイルミナTruSeqライブラリキットを使用した場合のサークRNAの多様性が高いことが観察された。これらの結果は、RNase R濃縮ステップがcircRNA2の検出に有益であるという以前の知見と一致する。
circRNAライブラリ構築のその他の重要な側面には、シーケンシングに使用できる総RNAの量と、RNAが抽出した組織の種類が含まれます。総RNAの4μgの入力は、検出されたcircRNAの最大数を生み出すことを発見したが、RNAAseq研究の大半は、より高い量を得...

円形RNA(CircRNA)は、真核生物転写1、2、3における広範な発現を考えると注目を集めている内因性の非符号化RNAである。それらは、互いに逆スプライスを取り除いたときに形成され、したがって、最初はアーティファクト4、5をスプライシングしていると考えられていました。しかしながら、最近の研究では、circRNAが細胞型、組織、および発達段階特異的発現3、6を示し、進化的に保存されている2、3が実証されている。さらに、それらは、タンパク質間相互作用7のメディエーションに関与している7、マイクロRNA(miRNA)結合3、8、9、10、および親遺伝子転写11の調節である。
古典的なRNAシーケンシング(RNA-seq)では、mRNAのポリA選択の結果としてライブラリの構築中にcircRNAが完全に失われたり、その低い存在量を考えると分離が困難な場合があります。しかしながら、最近のcircRNA特性評価研究は、CircRNA2、12、13を濃縮するためにRNase Rを用いた前処理工程を組み込んだ。RNase Rは、円形RNA構造の後ろに残して、線形RNAを消化するエキボリボヌクレアーゼです。CircRNAエンリッチメントプロトコルは、RNase R前処理ステップの有無にかかわらず、市販されている2つの全トランストランスクリプトームライブラリ構築キットからデータを生成および比較し、さまざまな量の合計RNA入力(1〜4μg)を使用することによって最適化されました。最適化されたプロトコルは、次に5つの異なる脳領域(小脳[BC]、下頭頭葉[IP]、中側頭蓋[MG]、後頭前皮質[OC]および上前頭回[SF])および4つの他の組織タイプ(肝臓[LV]、肺[LU]、リンパ節[LN]および膵臓[PA])にわたるcircRNAの豊富さを評価するために使用された。RNA-seqライブラリをペアにエンドシーケンスし、データを6つの異なるcircRNA予測アルゴリズムを使用して分析した:find_circ 3、CIRI14、マッププライス15、KNIFE16、DCC17、およびCIRCexplorer18。我々の分析に基づいて、RNase R前処理および4μgの総入力RNAとの孤立した総RNAライブラリー調製キットを使用した場合、最も多くのユニークなcircRNAが検出されました。ここでは、最適化されたプロトコルについて説明します。以前に報告された19、20として、他の組織タイプと比較して脳内で最も高い濃縮が観察された。

<table><tbody><tr><td>1,000 & マイクロ;Lピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>20 & マイクロ;Lピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>SR L 10F</td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;L ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>SR L 200F</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation アクセサリー(ホイルカバー)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5154</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation アクセサリー(チップ)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5153</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレート用接着フィルム</td><td>VWR</td><td>60941-064</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズ 450 mL</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63882</td><td>PCR 精製</td></tr><tr><td>Eppendorf twin.tec 96ウェルPCRプレート</td><td>VWR</td><td>951020401</td><td></td></tr><tr><td>高感度 D1000試薬</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>高感度 D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 シーケンシングシステム</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td><td>Illumina</td><td>PE-410-1001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td><td>Illumina</td><td>FC-410-1002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq PE Rapid Cluster Kit v2</td><td>Illumina</td><td>PE-402-4002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td><td>Illumina</td><td>FC-402-4022</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Total RNA Kit</td><td>Roche</td><td>KK8400</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学グレードのエタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer Assay Tubes</td><td>Supply Center by Thermo Fischer</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td><td>Supply Center by Thermo Fischer</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNA cleanup and concentrator - 5</td><td>Zymo</td><td>RCC-100</td><td>精製カラム、コレクションチューブが含まれています</td></tr><tr><td>RNAClean XP ビーズ</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td></td><td>RNA Cleanup ビーズ</td></tr><tr><td>Rnase R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td><td>ThermoFisher (LifeTech)</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Nucleic Acid analyzer</td></tr><tr><td>TElowE</td><td>VWR</td><td>10128-588</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>20020596</td><td>Kit used in section 3</td></tr><tr><td>Two-Compartment Divided Tray</td><td>VWR</td><td>3054-1004</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Water</td><td>Supply Center by Thermo Fischer</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Universal control RNA</td><td>Agilent</td><td>740000</td><td></td></tr></tbody></table>

rna シーケンシングを使用した円形 rna の同定

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

円形RNA(circRNA)は、マイクロRNA(miRNA)調節、タンパク質間相互作用のメディエーション、親遺伝子転写の調節などの機能に関与する非コードRNAのクラスです。古典的な次世代RNAシーケンシング(RNA-seq)では、circRNAは通常、mRNAライブラリの構築中にポリA選択の結果として見落とされるか、または非常に低い存在量で発見され、したがって分離および検出することは困難です。ここで、circRNAライブラリ構築プロトコルは、ライブラリ調製キット、前処理オプションおよび各種全RNA入力量を比較することによって最適化された。RNase R前処理の有無にかかわらず、市販の2つの全トランストランスクリプトームライブラリ調製キット、および可変量の合計RNA入力(1〜4μg)を使用して、試験した。最後に、複数の組織タイプ;肝臓、肺、リンパ節、および膵臓を含む;だけでなく、複数の脳領域;小脳、下頭頂葉、中側頭回、後頭皮質、および上頭前頭回を含む;組織型全体にわたるcircRNAの存在量を評価するために比較した。6つの異なるcircRNA検出ツール(find_circ、CIRI、マッププライス、ナイフ、DCC、およびCIRCexplorer)を用いた生成されたRNA-seqデータの分析により、RNase R前処理と4μg RNA入力を備えた孤立した合計RNAライブラリ調製キットが最適であることを明らかにした。circRNA の最大相対数を識別するためのメソッド。以前の知見と一致して、circRNAの最も高い濃縮は、他の組織タイプと比較して脳組織で観察された。

市販のユニバーサルコントロールRNA(UC)を用いて生成されたデータと、プロトコルにリボ枯渇ステップを含む2つのライブラリ調製キットを使用して、最初に評価された。分析ワークフロー (データ分析ワークフロー、セクション 4) を使用して、全体的に、Kapa データセットと比較して TruSeq データセットでより多くの circRNA が検出されました (図 1)。リボソームRNA(rRNA)のパーセンテージは、低い入力量(1、2 ug)のための両方のキットからのデータセットで5%未満でしたが、Kapaデータセットは4、5、および10 ug入力のためのより高いrRNA含有量を持っていました(表2)。したがって、検出されたcircRNAの数およびrRNA枯渇効率に基づいて、TruSeqキットを用いてさらなる実験を行った。
次に、RNase R前処理の意義を、RNase R前処理ライブラリと非前処理ライブラリから生成したデータとを比較することによって試験した。このことから、健康な高齢者のMGから...

円形RNA(circRNA)は、タンパク質間の転写調節および媒介相互作用に役割を有し得る非コードRNAである。circRNAシーケンシングライブラリの構築のための異なるパラメータの評価に続いて、RNase R前処理を用いた立ち往生した全RNAライブラリ調製を利用してプロトコルをコンパイルし、ここで提示する。

RNA シーケンシングを使用した円形 RNA の同定

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

このプロトコルは、キットタイプ、RNase R処理、入力量、およびcircRNA検出への影響など、circRNAライブラリ調製の主要な側面を評価した結果です。それは最適なサークRNAの検出を可能にし、ユーザーの必要性に応じて調節可能な変数のデータを提供する。異なるサンプルタイプのcircRNAを同定することは、その発現の分布をよりよく理解するのに役立ち、これらの分子の機能的役割を解明する段階を設定します。この方法は、任意の合計RNAサンプルに適用することができる。プロトコルを開始する前に、RNAサンプルを氷の上に保管しておくことが重要です。準備前にアジレントバイオアナライザまたはテープステーションでRINとDV200の値を評価し、RNAを使用する場合は適切な手順に従ってください。まず、合計RNAをRNaseフリーウォーターの39マイクロリットルで4マイクログラムに希釈し、上下にピペットして混合します。別のチューブでは、1x RNase Rバッファーを使用して、RNase Rをマイクロリットル当たり2単位の作業濃度に希釈します。ピペット39マイクロリットルの全RNAと5マイクロリットルの10倍RNase R反応バッファーを1.5マイクロリットル反応チューブに混合し、混合します。希釈したRNase R.の6マイクロリットルを加え、ピペットを完全な反応量に調整し、上下にピペットを10回混ぜます。チューブを摂氏37度の水浴に10分間入れ、完全な反応量が水浴に浸かっていることを確認します。次いで、チューブを氷の上に置き、すぐにRNAのクリーンアップと濃縮を進めます。始める前に、濃縮物に100%エタノールの48ミリリットルを混合してRNAウォッシュバッファーを調製し、精製カラムを回収管に入れます。準備ができたら、RNase R処理サンプルに2つの量のRNA結合バッファーを加え、よく混ぜます。100%エタノールの150マイクロリットルを混合物に加え、合計300マイクロリットル、全容をカラムに移し、遠心分離機を30秒間加えます。流れを取り除き、400マイクロリットルのRNA準備バッファーをカラムに直接加えます。遠心分離機を30秒間、流れを捨てます。その後、カラムに700マイクロリットルのRNAウォッシュバッファーを加え、遠心分離機を30秒間加え、流れを通して廃棄します。さらに400マイクロリットルのウォッシュバッファー、遠心分離機を2分間加え、カラムを新鮮なRNaseフリーの1.5ミリリットルチューブに移します。柱フィルターの真上にピペットチップを持って、RNaseフリー水11マイクロリットルを柱に直接慎重に加えます。サンプルを室温で1分間座らせてから、1分間遠心分離します。1.5ミリリットルのチューブに流れが通っていることを確認し、カラムを捨てます。精製されたRNAサンプルは、マイナス80°Cで保存することも、ライブラリの調製にすぐに使用することもできます。精製した全RNAの10マイクロリットルを96ウェルPCRプレート内のクリーンウェルに移します。rRNA結合バッファーの5マイクロリットルを追加し、rRNA除去ミックスの5マイクロリットルを追加し、試薬を混合するために上下にピペットを穏やかにピペット。プレートを密封し、事前にプログラムされ、予熱されたサーモサイクラーブロックで摂氏68度で5分間インキュベートします。インキュベーションの後、プレートを室温で1分間座らせます。プレートからシールを取り出し、35マイクロリットルの渦中室温rRNA除去ビーズをサンプルに加えます。ピペットを45マイクロリットルに調整し、ピペットを10~20回上下に調整して完全に混合します。プレートを室温で1分間座らせます。プレートを磁気スタンドに移し、1分間、または溶液がクリアされるまでインキュベートします。上清をプレート上の新しい井戸に移します。次に、磁気スタンドからプレートスタンドにプレートを移します。ボルテックスRNAクリーンアップビーズは、それらが十分に分散されるまで、サンプルにビーズの99マイクロリットルを追加します。ピペットを上下に混ぜ合わせ、室温で10分間インキュベートします。プレートを磁気スタンドに移し、5分間放置するか、溶液がクリアするまで放置し、井戸からすべての上澄み物を取り出して捨てます。磁気スタンドにプレートを残したまま、ビーズを破壊することなく、準備したての80%エタノールを200マイクロリットルのウェルに加えます。エタノールを井戸に30秒間放置し、取り除いて捨てます。ウェルに溶出バッファーの 11 マイクロリットルを追加し、ピペットを上下に混合します。プレートを室温で2分間インキュベートし、磁気スタンドに戻し、溶液がクリアされるまでそこに保管します。8.5マイクロリットルの上清を同じプレート上の新しいウェルに移し、サンプルを含む各ウェルに8.5マイクロリットルのエルテ、プライマー、フラグメントハイミックスを加えます。ピペットを10回上下して完全に混ぜ、プレートを密封し、摂氏94度に予熱したサーモサイクラーで8分間インキュベートします。サンプルを摂氏4度に冷却し、サーモサイクラーからプレートを取り出し、遠心分離機を短くします。このプロトコルについて、TruSeqとKAPAの2つのライブラリ調製キットを評価しました。全体として、TruSeqキットを使用した場合、より多くの円形RNAおよび低い割合のリボソームRNAが検出されたので、TruSeqはさらなる実験のために選択された。RNase R前処理の意義は、前処理されたライブラリと非処理されたライブラリから生成されたデータを比較することによって評価した。予想通り、未治療ライブラリと比較して、より多くの円形RNAが一貫して前処理されたライブラリで同定された。入力RNAの量は、より高い多様性の円形RNAを検出するために最適化されました。ライブラリーは、1マイクログラム、2マイクログラム、4マイクログラムの入力RNAを用いて作成し、4マイクログラムの全RNAを使用した場合には、円形RNA種の最も高い多様性が観察された。最適化されたプロトコルは、4つの健康なドナーからの5つの脳領域および6人の健康なドナーからの他の組織タイプの円形RNAの豊富さを比較するために使用された。全体として、他の組織タイプと比較して、脳内で円形RNaseの存在量が高いことが観察された。手袋を着用する、RNaseワイプまたはスプレーでベンチとピペットを徹底的に洗浄する、事前にRNAを氷の上に保つなど、RNAを扱う場合は、適切な手順に従うことを忘れないでください。この手順に従って、同定されたcircRNA接合部のサンガーシーケンシングなどの直交検証を行うことができる。新しいcircRNAの発見とその存在のさらなる証拠は、その生物学的機能を探求するための新しい研究分野を切り出す。

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

円形RNAを生成するレポーター遺伝子のクローン化と解析を行います。これらのレポーター遺伝子は、線形スプライシングを解析する構築物よりも大きく、Alu要素を含んでいます。円形RNAを調べるため、細胞にトランスフェクトされ、リニアRNAを除去した後にRT-PCRを用いてRNAを解析します。...

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

ここでは、哺乳動物細胞由来のRNA:タンパク質(RNP)複合体の内因性RNA結合部位または「フットプリント」を濃縮するプロトコルを提示する。このアプローチは、RNPサブユニットの2つの免疫沈殿を伴い、したがって、並行してRNA免疫沈殿(RIPiT)と呼ばれています。...

ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq)

円形RT-PCRベースの戦略を用いたトウモロコシミトコンドリオンにおける一次写物と処理された転写物の判別とマッピング

このプロトコルでは、ダイバージェントプライマーを使用して細胞内の環状RNA(circRNA)レベルを正確に定量するためのデジタルドロップレットPCR(dd-PCR)の詳細な方法について説明します。...

デジタル液滴PCRを用いた環状RNAの定量

ここで提出されたプロトコルは、宿主と病原体の相互作用を研究するRNAシーケンシングトランスクリプトームデータからcircRNAを予測し、機能的に特徴付けるために必要な完全な インシリコ...

インシリコで 宿主-病原体相互作用におけるcircRNAの同定と特性評価

Absolute quantification RNA Sequencing (AQRNA-seq) は、生物学的混合物中のすべての低分子 RNA の状況を定量するために開発された技術です。ここでは、AQRNA-seqのライブラリー調製とデータ処理の両方のステップを実証し、飢餓誘発性休眠中の Mycobacterium bovis...

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

単一細胞配列決定は、高解像度でゲノムの変化に対処するため、ますます人気とアクセス可能なツールです。我々は、単一の細胞内のコピー数の変化を識別するために、単一細胞の配列決定を使用するプロトコルを提供します。...

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

ここでは、 in vivoでの分子内および分子間のRNA-RNA相互作用のゲノムワイドなマッピングを可能にする、 P soralen架橋、 L鎖およびS選択H鎖のS equencingの方法を詳述します（SPLASH）。 SPLASHは、酵母、細菌およびヒトを含む生物のRNA相互作用を研究するために適用することができる。...

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

ギャラクシーとDAVIDバイオインフォマティクストレーニングなしの研究者が分析し、RNA-配列データを解釈できるようにする一般的なツールとして浮上しています。私たちは、 線虫の研究者は、アクセスをRNA-配列実験を行い、銀河を使用してデータセットを処理し、DAVIDを用いた遺伝子リストから意味のある生体情報を取得するためのプロトコルを記述します。...

のトランスクリプトーム解析<em&gt; C</em&gt;。<em&gt;エレガンス</emギャラクシープロジェクトのタキシードスイートを通じて&gt; RNAシーケンスデータ

スポット (tRNA を観察するための合理化されたプラットフォーム) の名前、元のトランスファー RNA 解析プラットフォームについて述べる。スポットは、生体試料中唯一の 3 つの手順で、24 時間以内にすべての tRNAs...

代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング

学ぶ円形RNAシーケンスライブラリー調製法。RNase R処理と入力量の最適化により、あらゆる総RNAサンプルから高感度にサークルRNAを検出し、発現分布と機能的役割の解明に貢献します。

RNA シーケンシングを使用した円形 RNA の同定

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