Name: ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぼう、ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製法。Escherichia coliまたはNicotiana benthamianaを用いたバイオ合成酵素による代謝産物の効率的な製造とクロマトグラフィー精製のプロトコルです。

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我々は、pIRSとpGGxZmAN2の構造を提供してくれたルーベン・ピータース博士(アイオワ州立大学、米国)に感謝します。NSFプラント・バイオティック・インタラクション・プログラム(P.Z.への助成金#1758976)、DOE早期キャリア研究プログラム(助成金#DE-SC0019178 to P.Z.)、DOE共同ゲノム研究所コミュニティサイエンスプログラム(助成金#CSP2568 to P.Z.)、NSFによるこの研究に対する財政的支援大学院研究フェローシッププログラム(K.M.M.)とUCデイビス・ディーンのメンターシップ・アワード・フェローシップ(K.M.M.)は感謝の気持ちを持っています。

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

ジテルペノイド天然物のより広範な調査と適用は、所望の化合物の十分な量を合成し、精製するために、単純で安価なプロトコルを必要とする。幅広い種から利用可能なジテルペノイド代謝酵素の数の急激な増加は、微生物および植物ベースの宿主システムを使用してジテルペノイドの酵素生産のための広範なインベントリを提供します。さらに、多くのジテルペノイド経路のモジュラーアーキテクチャは、自然と新しい自然のようなジテルペノイド自然の配列を生成するために、「プラグ&プレイ」組み合わせ工学アプローチで同じまたは異なる種からの酵素の使用を可能にします製品2,14,26,35.
大腸菌は、その堅牢性、スケーラビリティの容易さ、副産物汚染の低減のための限られた化学的複雑さ、およびDNAの組み立ておよび発現に利用可能な豊富なツールにより、天然物生体合成に好ましい微生物宿主です。最適化。私たちの経験では、ここで説明するプラットフォームは、ここで提案されたものを含む多くの下流アプリケーションに適しているジテルペンオレフィンとアルコールの数百mgまでの製品収量を生産するのに適しています。工業規模を満たしていないが、ここで説明する生産プラットフォームは、タキサジエンやスクラロール33などの関連するジテルペノイドに対して成功裏に実証されているように、さらなる経路、宿主、発酵の最適化の基盤として役立つことができる。 、34.レート制限MVAまたはMEP経路遺伝子の過剰発現は、競合経路への前駆体供給の不十分さや前駆体フラックスなどのジテルペノイド生合成の収量制限因子を克服するために成功裏に確立された13、 32、33、39.いくつかの研究で成功したが、テルペノイド代謝真核性P450sおよび大腸菌中の他の膜結合酵素の発現および触媒活性が低いことが、可能性の高い制限因子33、39である,48,49,50,51,52.コドン最適化配列およびタンパク質修飾の使用、例えば、小平性網膜シグナルペプチドの除去またはプラスティアルシグナルペプチドの導入は、可溶性P450発現14、38を増加させるのに有用であることが証明されている 、49、50、53。このような修飾は、本研究において例的経路として用いられるトウモロコシCYP71Z1839の微生物共発現にも用いられた。記載されたプロトコルは、同じ誘導性プロモーターの下で、構成毎に1つまたは2つの遺伝子を運ぶプラスミドの使用に基づいている。大規模な遺伝子組み合わせが望まれる場合は、複数のプラスミドと抗生物質の使用による変換効率と培養の増加を軽減するために、利用可能な様々なマルチ遺伝子カセットまたは遺伝子積み重ねシステムを使用することをお勧めします13.
遺伝学およびゲノム資源のより広い利用可能性に伴い、植物宿主システムはまた、天然物の製造にますます適しています。利点は、光合成によって動力を与えられる必要な天然前駆体を産生する植物の能力を含み、従って前駆体分子54、55を補う必要なしに製品形成を可能にする。N. ベンタミアナは、テルペノイドおよびその他の天然物経路の生体内機能特性および組み合わせ発現に既に広く使用されている14,35,36,40.N.ベンタミアナを宿主系として使用することの顕著な利点は、ジテルペノイド前駆体の内因性産生、天然遺伝子配列の使用、真核生物P450sの簡略化発現、組み合わせ遺伝子形質転換の容易さ(以下一時的な共変換には別個の抗生物質は必要ありません)、および葉材料からのターゲット製品の簡単な抽出。必要に応じて、ジテルペノイド産生は、前駆体供給36、41を増加させるために主要なMEP経路遺伝子の共発現を通じて増強することができる。N.ベンタミアナにおけるスケーラブルなジテルペノイド生産の制約は、十分な植物バイオマスを生成する必要があるため、液体微生物培養に比べてより複雑であり、化学的に複雑な製品の精製が行われる。植物組織、及び、例えば、内因性酵素36、43、44、45による酸化、グリコシル化または脱リン酸化を通じて標的産物の望ましくない代謝を可能にする 、46、47。しかしながら、この手順は、アグロインフィルトレーション56に使用される植物の数を増やすことによってmg製品量にスケールアップすることができる。
ここで説明する製品抽出および精製プロトコルは、大腸菌およびN.ベンタミアナ、ならびにS.セレビシエおよび他の植物または微生物宿主システムと互換性があり、簡単にコスト効率の高いアプローチを提供します。生物学と化学の両方の実験室で設定され、高価な精製装置を必要としません。分離漏斗を用いた代謝物抽出は、クロマトグラフィー精製前の効率的な抽出および位相分離に適しています。じょうごのサイズは、より大きな培養量を可能にし、大規模な培養物から抽出するために必要な実験時間を短縮するために容易に調整することができます。炭化水素と酸素化化合物の両方を含むドラブレキシン群に対して、異なる極性のジテルペノイドを抽出するのに理想的なヘキサン/酢酸エチル勾配の使用が見つかりました(図3)。対象製品の特性に応じて、他の溶媒混合物が有利な場合がある。しかし、分離漏斗技術を用いて抽出および位相分離を成功させるために、溶媒を水と共に解析してはなりません。また、蒸発による製品損失を考慮して、低分子単一およびセスキテルペノイドおよび他のVOCなどの揮発性有機化合物(VOC)を製造する際に考慮する必要があります。より大きなスケール(〜2L)シリカカラムを使用した異なるレベルの酸素化のクロマトグラフィー分離は、製品分離を改善し、反復精製の必要性を最小限に抑えるため、当社の経験において有利です。小さい列ボリュームを使用する場合の手順。カラムの容積および行列は、所望の培養量および天然物のタイプに対して必要に応じて調整することができる。このプロトコルを使用して達成することができる標的製品の純度は、生理活性アッセイや酵素活性分析での使用など、多くの下流アプリケーションに適しています。しかし、NMRによる構造解析など、より高い純度レベルが求められる場合は、(半)準備HPLCを用いた追加の精製により、製品の純度を効率的に高めることができます。
ここで説明するこのプロトコルは、ジテルペノイド天然物の生産のために最適化されていますが、単体、セスキ、トライテルペノイド、ならびに単に所望の酵素を生成するだけで他の天然物クラスに容易にカスタマイズすることができます。組み合わせ式14,57用モジュール .しかし、モノ・セスキ・テルペノイドのような揮発性の高い化合物、または例示されるより高い極性および機能的修飾を伴う化合物については、製品抽出および精製の手順の変更を考慮する必要があります。多くのトリテルペノイド、フェニルプロパノイド、および他の天然物クラスのグリコシル化。
天然物の製造のための産業規模のプラットフォームは利用可能ですが、ここで説明するプロトコルは、ほとんどの実験室で容易に設定することができる安価でカスタマイズ可能なツールを提供します。トウモロコシのドラブレキシンの生産によって示されるように、このアプローチを使用して達成することができる製品の量と純度は、通常、様々な下流の分析と使用を容易にするために十分であるが、そうでない種々の生物活性研究、生物間の相互作用の分析、ならびに酵素基質としての使用、または半合成アプローチの開始材料として限定される。

ジテルペノイドは、多くの生物1で重要な役割を果たす12,000以上の主に多環性20炭素天然物の化学的に多様なグループを含む。真菌および植物はジテルペノイドの最大の多様性を産生するが、細菌はまた、生理活性ジテルペノイドを形成することが示されている(レビュー2、3、4、5を参照)。その広大な構造多様性に根ざし、ジテルペノイドは、生物学的機能の多くを果たしています。ジバレリン成長ホルモンのようないくつかのジテルペノイドは、発達過程に不可欠な機能を持っています 5.しかし、ジテルペノイドの大半は、化学的防御と組織間相互作用のメディエーターとして機能します。これらの中で、トウモロコシ(Zea mays)や米(オリザサティバ)などの主要な食品作物における抗菌性ジテルペノイドの害虫および病原体防御におけるジテルペン樹脂酸は、最も広範囲に及んでいる。勉強6,7.これらの生物活動は、商業用途のための豊富な化学貯蔵所を提供し、選択されたジテルペノイドは、現代の生活の重要な医薬品、食品添加物、接着剤、および他のバイオ製品として使用されています8,9 、10.ジテルペノイドの自然多様性と生物学的機能に関する研究を進め、最終的にはより広範な商用アプリケーションを促進するためには、純粋な化合物の費用対効果の高い調製のためのツールが必要とされています。植物材料からの大規模な分離は、パルプおよび製紙産業8の副産物として製造されるジテルペン樹脂酸などのいくつかのジテルペノイドバイオ製品のために確立されている。しかしながら、特定の組織のみおよび環境刺激による厳しい規制下でのジテルペノイドの蓄積は、多くの場合、天然生産者2からの十分な製品量の分離を制限する。さらに、ジテルペノイドの構造的な複雑さは、化学合成を通じてその生産を妨げるが、そのようなアプローチはいくつかのケースで成功しているが、11、12。高度なゲノムおよび生化学的技術の利用可能性により、酵素生産プラットフォームは、ジテルペノイド化合物の範囲を生産するための注目を集めています(レビュー13,14を参照してください, 15,16,17,18)
ジテルペノイドを含む全テルペノイドは、2つの異性異性イソポ価前駆体、イソペニルジリン酸イソフォニルジリン酸イソ開天体ジリン酸(IPP)およびジメチリンジリン酸ジリン酸ジメチルジリン酸ジリン酸ジメチル(DMAPP)19に由来し、メバロネード(MVA)またはを介して形成される。メチルリトリトール-5-リン酸(MEP)経路。テルペノイド生合成は、細菌中のMEP経路および真菌中のMVA経路を通って進行し、植物は細胞系MVAおよび形成性MEP経路を有し、後者はジテルペノイド形成20に向かう主要な経路である。プレニルトランスフェラーゼによるIPPおよびDMAPPの凝縮は、全てのジテルペノイドに対する中心20炭素前駆体をもたらし、ゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)20を得る。GGPP形成の下流には、2つの酵素ファミリー、テルペンシンタゼス(TPpS)およびシトクロムP450モノオキシゲナーゼ(P450s)がテルペノイド代謝の広大な化学多様性の形成を大きく制御する21,22。ジターペン合成酵素(diTPSs)は、コミットされた炭水化物駆動の循環とGGPPの再配置を触媒し、様々な立体特異的二重、ポリ、またはマクロ環状ジターペン足場1、3、23を形成する。 24.これらの足場の酸素化およびさらなる機能的装飾は、P450酵素によって促進され、他の酵素ファミリー22、25を選択する。TPSとP450sは、一般的にモジュラー生合成ネットワークを形成することができる種特異的なマルチ遺伝子ファミリーとして存在し、共通の青写真に沿って異なる酵素モジュールを組み合わせることで、化合物2の広い範囲の形成を可能にします。26. 近年のモジュラーテルペノイド経路で動作する機能的に異なる酵素の急速な発見は、部分的または完全な経路の代謝工学のための汎用性の高い部品リストとしての使用の機会を拡大しています。微生物および植物ベースの生産プラットフォームの両方。例えば、酵母(サッカロマイセスセレビシエ)は、抗マラリア薬アルテミシニン27、セキテルペノイドバイオ燃料などのテルペノイド生体製品の製造のための多酵素経路の設計に成功している。ビサボレンおよびファルネセン28が、ジテルペノイド29、30、31も選択する。同様に、工業規模の製造のための設計されたエシェリヒア大腸菌プラットフォームは、抗癌薬として使用されるタキソール前駆体タキサジエン、ジテルペンアルコール、スクラノールを含むいくつかのジテルペノイド代謝物のために確立されています。、香料業界で使用される 13,32,33,34.遺伝子工学と変換技術の進歩はまた、植物天然物9、14、35、36を生産するための植物ホストシステムをますます実行可能にしました。特に、近いタバコの相対的なニコチアナ・ベンタミアナは、アグロバクテリウム-複数の遺伝子組み合わせの媒介変換の容易さのために、テルペノイド経路解析および工学のために広く使用されているシャーシとなっています。、内因性前駆体の効率的な生合成、および高バイオマス14、35、36。
テルペノイド生合成のためのこれらの確立されたプラットフォームに基づいて、我々は、ジテルペノイドの酵素生産と単一化合物の精製のための使いやすく、コスト効率の高い方法をここで説明する。提示されたプロトコルは、増強されたジテルペノイド前駆体生合成のために設計された大腸菌およびN.ベンタミアナプラットフォームが、異なるdiTPSおよびP450酵素の組み合わせ発現にどのように利用できるかを示している。所望のジテルペノイド化合物。構造的に異なるジテルペノイドを産生および精製するためのこのプロトコルの適用は、トウモロコシ(Zea mays)、ドラブレキシンと呼ぶ、2つのdiTPSと1つのP450を新生する内因性生合成の例によって示されている。酵素。オレフィンから酸素化誘導体に至るまでの異なるドラブレレキシンの精製は、分離漏斗抽出を大規模なシリカカラムクロマトグラフィーと、準備高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)と組み合わせることによって達成される。記載されたプロトコルは、ジテルペノイドの生産のために最適化されていますが、関連するテルペノイドクラス、ならびに酵素資源が利用可能な他の天然物に容易に適合することができます。このアプローチを用いて製造された化合物は、核磁気共鳴(NMR)解析による構造特性解析、酵素機能研究の基板としての使用、および広範囲を含むがこれらに限定されない様々な下流用途に適している。生能アッセイ。

<table><tbody><tr><td>1020 トレイ</td><td>温室メガストア</td><td>CN-FLHD</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸</td><td>シグマ</td><td>M8250-500g</td><td>MES</td></tr><tr><td>4 インチ テック スクエア ポット</td><td>マッコンキー 卸売 栽培者の供給</td><td>JMCTS4</td><td></td></tr><tr><td>5977 エクストラクター XL MS</td><td>アジレント</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>7890B GC</td><td>アジレント</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>シグマ</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>細菌酵母抽出物</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP9727-2</td><td></td></tr>ビー<tr><td>カーCTechGlassBK-2001-015B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャップ、9 mmブルースクリュー、PFTE</td><td>アジレント</td><td>5185-5820</td><td>GCバイアルキャップ</td></tr>カル<tr><td>ベニシリン</td><td>ジェネシー25-532</td><td></td><td>炭水化物</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>フィッシャー</td><td>50247423</td><td>クロ</td></tr><tr><td>ルクロマトグラフィーカラム</td><td>CTechGlass</td><td>CL-0015-022</td><td></td></tr><tr><td>クリア湿度ドーム</td><td>温室メガストア</td><td>CN-ドーム</td><td></td></tr>コリ<tr><td>ローラーメッキビーズ</td><td>シグマ</td><td>71013</td><td>ガラスビーズ</td></tr><tr><td>クアーズテック磁器モルタル</td>フィ<td>ッシャー12-961A</td><td>モルタル</td><td></td></tr><tr><td>クアーズテック磁器 磁器乳棒</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-961-5A</td><td>乳棒</td></tr><tr><td>デルタ-アミノレブリン酸塩酸塩</td><td>シグマ50981039</td><td></td><td>アミノレウボリン酸</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィ</td><td>ッシャーA962-4</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>フィ</td><td>ッシャーE1454</td><td></td></tr>ファ<tr><td>ルコン50mL円錐形遠心分離管フィ</td><td>ッシャー14-432-22</td><td>ファルコンチューブフィ</td><td></td></tr><tr><td>ッシャーブランド使い捨てキュベット</td><td>フィッシャー</td><td>14-955-127</td><td>キュベット</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド シャーレ クリアフッド付き</td><td>フィッシャー</td><td>FB0875713</td><td>シャーレ</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド ポリプロピレン マイクロチューブ 収納ラック</td><td>フィッシャー</td><td>05-541</td><td>マイクロチューブラック</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサンズ</td><td>フィッシャー</td><td>H292-4 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>HP-5MS</td><td>Agilent</td><td>19091S-433</td><td>GCカラム</td></tr><tr><td>インレットアダプター</td><td>CTechGlass</td><td>AD-0006-003</td><td>ガラスインレットアダプター</td></tr><tr><td>イソプロピル &beta;-D-1-チオガラクトピラノシド</td><td>フィッシャー</td><td>BP1755-100</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>フィッシャー</td><td>BP9065</td><td>カン</td></tr><tr><td>KIM-KAP キャップ、使い捨て、ポリプロピレン、キンブルチェイス</td><td>VWR</td><td>60825-798</td><td>通気性試験管の蓋</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Acros</td><td>223210010</td><td>MgCl<サブ>2</サブ></td></tr><tr><td>マグネシウム硫酸塩</td><td>シグマ</td><td>M7506-500g</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>Miracle-Gro水溶性万能植物食品</td><td>Miracle-Gro</td><td>2756810</td><td></td></tr><tr><td>ミキサーミルMM200Retsch20.746.0001</td><td></td><td></td><td>ティッシュミル</td></tr><tr><td>Nalgene Fernbach 培養フラスコ</td><td>Sigma</td><td>Z360236</td><td>2.8 L フラスコ</td></tr><tr><td>ニューブランズウィック I26</td><td>エッペンドルフ</td><td>M1324-0000</td><td>振とうインキュベーター</td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seed</td><td>USDA Germplasm Repository</td><td>Accession TW16</td><td>N. benthamiana</td></tr><tr><td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td><td>Lucigen</td><td>60442</td><td>C41-DE3細胞</td></tr><tr><td>パラフィルムMラッピングフィルム</td><td>フィ</td><td>ッシャーS37440</td>パラ<td>フィルム</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td>シ<td>グマ</td><td>P-9541KCl</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水</td><td>フィ</td><td>ッシャーP288-3</td>リン酸<td>二カリウム</td></tr>リン酸<tr><td>カリウム一塩基性</td><td></td><td></td><td>リン酸一カリウム</td></tr>パイ<tr><td>レックス使い捨て培養チューブ、リムレス</td><td>シグ</td>マ<td>CLS9944516</td><td>試験管</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウムソル</td><td>トフィッシャー</td><td>501368477</td>ピル<td>ビン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>レトルトリングスタンドCTechGlass</td><td></td><td>ST00</td><td>リングスタンド</td></tr><tr><td>リボフラビン</td><td>アムレスコ</td><td>0744-250g</td><td></td></tr><tr><td>リファンピシン</td><td>シグマ</td><td>R7382</td>リ<td>フ</td></tr><tr><td>ロトバップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サンド、50-70メッシュ粒度</td><td>シグマ</td><td>274739-1KG</td><td></td></tr><tr><td>シリカ</td><td>フィッシャー</td><td>AC241660010</td><td>シリカゲル</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>5271-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>SS266-1</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>スペクチノマイシン</td><td>フィッシャー</td><td>501368607</td><td>スペック</td></tr><tr><td>スクイブ セパリー ファンネル</td><td>CTechGlass</td><td>FN-1060-006</td><td>セパリー ファンネル</td></tr><tr><td>サンシャイン ミックス #1</td><td>Sungro 園芸</td><td></td><td>培養土</td></tr><tr><td>Thermo Scientific スナップキャップ 低保持 マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>21-402-902</td><td>マイクロチューブ</td></tr><tr><td>トライアングル漏斗</td><td>CTechGlass</td><td>FN-0035</td><td>漏斗</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>フィッシャー</td><td>BP14212</td><td></td></tr><tr><td>バイアル、スクリュー、2 mL、琥珀色、WrtOn</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td>GC バイアル</td></tr><tr><td>分光光度計、V-1200</td><td>VWR</td><td>634-6000P</td><td>分光光度計</td></tr><tr><td>ZORBAXエクリプスXDB-C18</td><td>Agilent</td><td>990967-202</td><td>HPLCコラム</td></tr><tr><td>ZORBAXエクリプスXDB-CN</td><td>Agilent</td><td>990967-905</td><td>HPLCカラム</td></tr></tbody></table>

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

ジテルペノイドは、生命の王国全体に広く分布し、発達過程、組織間相互作用、および環境適応に重要な生物学的機能を有する、多様なクラスの低分子天然物を形成する。これらの様々な生物活動により、多くのジテルペノイドは医薬品、食品添加物、バイオ燃料、その他のバイオ製品として経済的に重要です。高度なゲノムと生化学的アプローチにより、ジテルペノイド代謝遺伝子、酵素、経路に関する知識が急速に増加しています。しかし、ジテルペノイドの構造的な複雑さと、多くの場合、単一の種における個々の化合物の狭い分類分布は、その効率的な生産のための制約要因のままである。代謝酵素のより広い範囲の利用可能性は今、この重要な代謝産物基のより深い調査を容易にするために十分な力価と純度でジテルペノイドを生産するためのリソースを提供します。微生物および植物ベースの酵素共発現のための確立されたツールに基づいて、我々は、エシェリヒア大腸菌またはニコチアナベンタミアナのいずれかでジテルペノイドの酵素生産のための容易に操作され、カスタマイズ可能なプロトコルを提示し、シリカクロマトグラフィーおよび半準備HPLCを介した所望の製品の精製。トウモロコシ(Zea mays)ドラボレキシンジテルペノイドの群を例にとり、ジテルペン合成酵素(diTPS)とシトクロムP450モノオキシゲナーゼ(P450)酵素のモジュラー組み合わせが異なるジテルペノイド足場を生成するためにどのように使用できるかを強調する。精製化合物は、代謝物構造解析、酵素構造機能研究、インビトロおよびプランタ生体活性実験など、さまざまな下流アプリケーションで使用できます。

大腸菌を用いたジテルペノイド産生のスケマティックワークフロー 図1は、ジテルペノイド産生の説明ワークフローを示す。ここで概説されたプロトコルは、ジテルペノイド生合成用の前述の大腸菌プラットフォーム13、32により大量培養物の使用およびシリカを介した所望のジテルペノイド産物の精製に適合した。クロマトグラフィー。このプロトコルの使用方法を示すには、 我々は、2つのdiTPS、ZmAN2(Zm0001d029648)とZmKSL4(Zm0001d032858)、多機能P450(CYP71Z18、Zm00001d14)を含むトウモロコシから最近同定されたドラブラレキシン経路を使用しました。還元酵素 (ZmCPR2, Zm00001d026483) (図 2)簡単に言えば、大腸菌BL21DE3-C41有能な細胞はpCDFDuet:IRSおよびpACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2プラスミド13、32で予め形質転換された。pCDFDuet:IRSプラスミドは、1-デオキシ-D-xylulose-5-リン酸シンターゼ(dxs)、1-デオキシ-D-xylulose-5-リン酸還元酵素(dxr)を含むジテルペノイド前駆体産生のための主要な酵素を含有し、およびイソペンテニルジリン酸イソメラーゼ(idi)は、大腸菌13におけるジテルペノイド形成を増加させることが示された。pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2プラスミドには、トウモロコシのエント-コパリル二リン酸合成酵素ZmAN2とアビーグランディスからのGGPPシンティーゼが含まれています。ドラボラレキシン生合成におけるコミットされた反応を触媒する酵素は、プラスミドpET28b:ZmKSL4およびpETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z18として共形した。シーケンスとプラスミド構造の詳細については、Mafu et al. 201839を参照してください。
抽出された酵素産物のGC-MSクロマトグラムを図3Aに示し、ドラブラキエン(1.2±0.25mg/L培養)、エポキシドラブラノール(0.65±0.2mg/L培養)、エポキシドララノール(11.4.4)の3つのドラブレキシン化合物の形成を示す。±1.1 mg/L培養)をジテルペノイドスクラノールを用いて標準曲線に基づいて定量した。スクラレオールは、ドラブレキシンと比較して、その類似の構造と化学的特性のために、基準標準として使用されました。典型的に観察されるマイナーな副産物には、クロラムフェニコール、インドール誘導体オキシドールおよびインドール−5-アルデヒド、および前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)が含まれる(図3)。Indoleは一般的に一次副産物を表すが、GC-MS器具の完全性を維持するために7分の設定された溶媒遅延よりも短い保持時間のために、ここに示されていない。
N.ベンタミアナを用いたジテルペノイド産生の概略ワークフロー 図4は、N.ベンタミアナにおけるドラブレキシン経路の発現の概要を示す。ここで説明する製品については、以下の構成物をA.ツメファシアン株GV3101に別々に変換した:pLife33:p19(p19遺伝子サイレンシングサプレッサータンパク質を発現)、pLife33:ZmCYP71Z18、pLife33:ZmAN2、pLife33:ZmKSL4。トウモロコシドラブレキシン経路遺伝子の全長天然配列は、大腸菌およびA.ツメファシエンスにおける伝播のためのカナマイシン耐性を持つバイナリT-DNAベクターpLife3341に用いた。上流テルペノイド経路遺伝子の共発現は任意であり、前駆体のゲラニエル二リン酸はN.ベンタミアナにおいて内因性に形成される。しかし、いくつかの研究は、N.ベンタミアナ14、36、41でジテルペノイド形成を増加させるために、このようなアプローチを成功裏に採用している。図3に示すように、共発現はドラブラディアンおよび15,16-エポキシドラバレンの産生に成功した。大腸菌の酵素共発現とは異なり、15,16-エポキシドラブラノールは代謝産物抽出物では検出されなかった。
葉抽出物中の15,16-エポキシドラブレンの存在は、N.ベンタミアナにおけるCYP71Z18の活性を実証した。15,16-エポキシドラブラノールは、微生物培養からの抽出後に安定であることが示された(図3)ならびに以前の研究39でトウモロコシ根組織から分離した後、ヒドロキシル化産物がグリコシル化されているのはもっともらしいと思われる。内因性グリコシルトランスフェラーゼによって、その後、真空中に隔離され、抽出36、43、44、45の抽出のためにここで使用される有機溶媒混合物との抽出にアクセスできないようにする 、46.N.ベンタミアナにおける経路工学の文脈における同様の望ましくない製品の改変は、以前の研究47で報告されている。大腸菌における共発現に示すように、N.ベンタミアナにおける一過性発現は、参照質量スペクトルデータベースとの比較に基づいて異なる鎖長の線形アルカンを含むいくつかの副産物の抽出をもたらす。葉材料から抽出された化合物価価は、平均2.4 +/- 0.5 mgドラブラディエンおよび0.9 +/- 0.3 mg 15,16-エポキシドラバレン/g乾燥葉組織当たりであることが判明した。これらのチテーターは、異なる実験セットアップを考えると、大腸菌共発現系と直接比較することはできません。
ジテルペノイド精製 ジテルペノイド精製は、シリカカラムクロマトグラフィーおよびその後の半準備HPLCを用いて達成された。プールされた大腸菌培養物の12Lからの代謝産物抽出物を、3つの焦点ドラブレレキシン化合物を分離するためにシリカカラムクロマトグラフィーを用いて精製した(図3A)。シリカクロマトグラフィーは、ジテルペンオレフィンと酸素化誘導体の簡単な分離を可能にし、シリカマトリックスに保持されている主要な汚染物質であるオキシンドを容易に除去できるため、標的化合物の高純度を達成するのに理想的です(図 3A)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> 図1:大腸菌におけるジテルペノイド産生のワークフローおよび液体細菌培養物からの代謝産物精製破線のボックスは、追加の精製が必要なオプションの手順を示しています。(A)分離漏斗を用いた抽出大腸菌培養物の代表的な画像。(B)シリカクロマトグラフィーを用いた代謝産物抽出物精製の代表画像。  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> 図2:この研究で用いられるドラブレキシン生合成経路および遺伝子構築物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> 図 3: GC-MS の結果。図示は、(A)大腸菌及び(B)N.ベンタミアナにおける酵素共発現アッセイを用いて得られた精製ジテルペノイド産物の代表的なGC-MSクロマトグラムである。製品の同定は、米国国立標準技術研究所(NIST)質量スペクトルライブラリーの本物の基準と参照質量スペクトルとの比較に基づいています。1、オキシドール;2、インドール-5-アルデヒド;3,ピロロ[1,2-a]ピラジン-1,4-ジオン、ヘキサヒドロ-3-(2-メチルプロピル)-;4,6-O-アセチル-1-[[4-ブロモフェニル]チオ]-a-d-グルコシドS、S-二酸化物;5、 ドラブラディエン;6, 15,16-エポキシドラブレン;7,ピロロ[1,2-a]ピラジン-1,4-ジオン、ヘキサヒドロ-3-(フェニルメチル)-;8, 15,16-エポキシドラブラノール;9 と 12, 不明;10、クロラムフェニコール;11, 3,7,11,15-テトラメチル-2-ヘキサデセン-1-ol;13 -16、アルカネ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> 図4:N.ベンタミアナにおけるジテルペノイド産生(A) N.ベンタミアナにおけるジテルペノイド産生のワークフローおよび葉材からの代謝清質精製. (B)浸透実験の準備ができているN.ベンタミアナ植物の代表的な画像は、剪定する前に。(C)剪定後のN.ベンタミアナ植物の代表的な画像。(D)注射器浸潤葉の画像。暗い地域が浸透している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、エシェリヒア大腸菌またはニコチアナ・ベンタミアナにおける生合成酵素の組み合わせ発現を通じて、ジテルペノイド代謝物を製造および精製するためのプロトコルを簡単に提示し、クロマトグラフィー製品を提供します。浄化。得られた代謝産物は、分子構造特性解析、酵素機能研究、生理活性アッセイを含む様々な研究に適しています。

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

このプロトコルは、異なる下流分析に使用することができ、異なる代謝産物のターゲットの範囲のためにカスタマイズすることができる精製ジテルペノイドを製造するのに適しています。この方法の主な利点は、特殊な代謝産物のミリグラム量を生成する簡単で安価な方法です.共発現に用いる遺伝子や酵素を交換することで、この方法を改変して、モノテルペノイドやセシテルペノイド、フラボノイドなどの代謝産物クラスを含む他のテルペノイドを生成することができます。ジテルペノイド代謝産生および形質転換のために、化学的に有能な大腸菌細胞を氷上で温めることから始める。培養液が解凍されたら、1構築あたり25マイクロリットルのコンピテントセルを冷蔵1.5ミリリットルマイクロチューブに加え、共発現に使用される各構成体のマイクロリットル溶液当たり100ナノグラムの1マイクロリットルを加える。マイクロチューブラックを横切ってチューブを削ることによって、10分ごとに穏やかな混合で30分間氷の上に混合物をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、細胞混合物を摂氏42度で1分間熱ショックし、細胞を氷の上に少なくとも2分間戻します。次に、37°CのSOC培地を200マイクロリットルのチューブに加えます。そして、1時間の培養を摂氏37度、毎分200回転でインキュベートします。インキュベーションの最後に、約10個のオートクレーブガラスビーズと100マイクロリットルの細胞を37°C温めたリソジニーブロス寒天プレートに適切な抗生物質を加えます。そして、均一に細胞を分配するために所定の位置に蓋をしてプレートを水平に振ります。その後、ガラスビーズを静かに廃棄物容器にタップし、一晩で37°Cでプレートをインキュベートし、表面側を下にコーティングします。翌日、インキュベーターからプレートを取り出します。適切な抗生物質を使用して調製したリソゲニーブロス培地5ミリリットルを、計画された1リットル培養ごとにプラスチック通気性キャップを持つ15ミリリットルの無菌ガラスチューブ1つに加え、ピペットチップを使用して寒天プレートから個々の形質転換された大腸菌コロニーを選びます。準備された15ミリリットルのチューブのそれぞれに1つの選択されたコロニーを追加し、付随する通気性プラスチックキャップで各チューブをキャップします。その後、キャップされた大腸菌の小さな文化を37°Cの振動インキュベーターに12〜24時間置きます。翌日、適切な抗生物質を用いて小さな培養物1リットル当たり1リットルのフラスコで900ミリリットルの素晴らしいスープに100ミリリットルの100ミリリットルを加える。そして、フラスコを摂氏37度、毎分140回転で約30分間置きます。素晴らしいスープが暖かい場合は、各接種培養の5ミリリットルの体積全体を培養ごとに1リットルの培養フラスコに加えます。そして、約3時間毎分140回転で揺れインキュベーターにフラスコを置きます。600ナノメートルの光学濃度が0.6に達したら、インキュベーターの温度を16°Cに下げます。インキュベーターが冷却されたら、1モルIPTGの1ミリリットル、1リットルリボフラビン当たり4グラムの1ミリリットル、各培養物に1リットル当たり150グラムの新鮮なアミノレブリニン酸を1ミリリットル加える。ジテルペノイドの生産のために、十分な前駆体形成を確実にするために、各培養物に1モルのピルビン酸の25ミリリットルを加える。次に、16°Cで培養し、1分間に140回転で72時間培養し、適切な培養物に毎日25ミリリットルのピルビン酸ナトリウムを加える。代謝物の分離と精製のために、発煙フードのリングスタンドにセパレーター漏斗を固定します。そして、漏斗の下に廃棄物容器を置きます。セパネルに酢酸エチルとヘキサンの50/50溶液の500ミリリットルを注ぎます。そして、漏斗に興味のある形質転換された大腸菌共発現培養物の500ミリリットルを加える。ファンネルにガラスストッパーを置き、漏斗を5〜10回振って抽出溶媒と培養を混合し、漏斗が逆さまになっている間に頻繁にスピゴットを開き、漏斗を脱気するために煙のフードに向けます。ちょうど示したように揺れと脱気の第二ラウンドの後、約1分間リングスタンドに漏斗を直立に置きます。最上溶媒層が水性培養層から分離した場合、ストッパーを取り除き、大腸菌層を廃ビーカーに排出し、漏斗内に溶媒層を保持する。次いで、第1の抽出に使用した同じ500ミリリットルの溶媒を用いて培養液の残りの500ミリリットルで抽出を繰り返し、抽出した代謝物を含む溶媒をクリーンフラスコに排水する前に行う。ここでは、代表的な抽出酵素産物の代表的なガスクロマトグラフィー質量分析クロマトグラムが示されている。一般的に観察されるマイナーな副産物には、クロラムフェニコールおよびインドール誘導体オキシンドールおよびインドールピバラアルデヒドが含まれる。シリカカラムクロマトグラフィーによるジテルペノイド精製後、ジテルペノイドスクラロールを用いた標準曲線に基づいて定量化した3種類のドラプラキシン化合物が得られる。シリカクロマトグラフィーは、高純度の目的化合物を達成するのに理想的です。ジテルペンオレフィンと酸素化誘導体の簡単な調製が可能であり、シリカマトリックス上に保持されている主要な汚染オキシンドールを容易に除去します。また、テルペノイド経路遺伝子の共発現は、N.ベンタミアナでジテルペノイドを産生するために使用することができ、結果としてドラブラジエンおよび15、16エポキシドーラブレンの産生をもたらす。抽出中に使用される溶媒は、目的の代謝産物の物理的な化学的特性に合わせて最適化されるべきであり、2つの異なる層を維持するために水と混合可能であってはなりません。この手順に従って、精製された代謝産物は、構造解析および抗生物質酸を含む下流分析に使用することができる。この技術は、ここに示されたものを含む新しいジテルペノイドの発見を可能にし、これらの代謝産物をその化学構造および新しい二種について分析することを可能にした。セパネルで有機溶剤を使用する場合は、注意してください。ラボの安全基準に従って、必ず生物学的廃棄物を処分してください。

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ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

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