Name: CRISPR-Cas9を用いたミツバチ脳部における抗RDLおよび抗mGlutR1受容体抗体検査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶ CRISPR-Cas9を用いたミツバチ脳部の遺伝子編集と免疫細胞化学解析による受容体抗体検査法。GABAAおよびグルタミン酸受容体の機能と学習・記憶における役割を探究します。

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この作品は、BHS:ヒューマンフロンティア科学プログラムに対する以下の賞によって支えられた。NIH NIGMS (R01 GM113967);NSFアイディアズラボ(1556337)。DmGluRAのペプチドと抗体は、ISがフォンダシオン・プール・ラ・レシェルシュ・メディカルのプログラム・デュルゲFRM/ポスドクUFP20060306548によってサポートされたとき、研究室Dr.RDLガイドとqPCRドロップオフアッセイの設計に協力してくれた統合DNAテクノロジー(IDT)のダニエラ・ジュンケイラ・マロシとアレックス・ハンターに感謝しています。

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著者たちは開示するものは何もない。

アンチRDLおよび反mGlutR1の特性評価 まず、抗RDLおよび抗m-mGlutR1抗体を免疫ブロットと固定ミツバチの脳のスライスに事前吸着することによって特徴付けました。各抗体は、その既知のアイソフォームをすべて認識するように作られ、西洋の分析は、彼らが予測された分子量に対応するバンドを認識することを示しています。次に、両方の抗体は、ミツバチの脳切片で産生された共役ペプチドによってブロックされた。
我々の研究における最初の目的の1つは、特定の共役ペプチドに対して産生される抗体が固定脳組織におけるそのタンパク質に特異的であることを確立することであった。そのために、私たちはCRISPR-Cas9システムを利用しました。我々は、ミツバチRDLとmGlutR1のための特定のガイドを設計し、蛍光プローブATTO550で標識されたCRISPR-Cas9を作るためにそれらのそれぞれを使用しました。各受容体について、3つの異なるCRISPR-Cas9リボヌクレオタンパク質をオセリに注入し、設計されたCas9システムを取り上げた細胞内の対応する遺伝子を排除することによって、成体ミツバチ脳中の標的タンパク質の量を減らしました。我々の研究では、このステップを達成しました。
これらの実験を成功させるために重要な最初のステップの 1 つは、適切なガイド RNA を設計することです。遺伝子配列の最初、中間、および終わりに位置する最大 5 つのガイド RNA を設計することをお勧めします。私たちの予備作業では、3〜5匹のミツバチに様々な組み合わせでそれらをテストしました。我々はまた、注射の異なる濃度だけでなく、注射後の時間、および注射中のRNPの様々な混合物を試してみました。脳を解剖し、抗RDLおよび抗mGlutR1抗体を用いて処理した。これらの初期試験では、注射後の適切な組み合わせ、ポストインジェクション時間、および注射のためのCRISPR-Cas9の濃度と量を確立しました。これらの初期テストは、ここで詳しく説明した実験を設定するための基礎でした。
目的は2倍でした:1)行動研究のための最良の実験条件を通して働くためにCRISPR-Cas9と2)で治療した後、私たちの抗体染色が減少したことをジンで実証しました。したがって、注入後にCRISPR-Cas9 48時間の細胞核が多く含まれる場合、抗RDLおよび抗mGlutR1染色の減少が顕著であることを示した。さらに、テストされた抗体がミツバチの脳調製物中のmGlut1およびRDLタンパク質を特異的に認識し、ミツバチの脳の局在研究に使用できることを実証する。
行動研究のためのCRISPR-Cas9の実験設定 次に、CRISPR-Cas9を行動研究に使用できるように実験を立ち上げました。8または9ミツバチは、対照および実験的治療のために収集された。注射前後に行動試験を行い、ATTO550および/または免疫細胞化学のために脳を処理して、標的タンパク質の減少を示す脳領域を決定した。ここでは、1組の実験に対して採取したミツバチの数は、対照および実験条件に対して8〜9個以下のミツバチに制限されることに注意することが不可欠である。これにより、両方の条件を同じ日にテストできます。また、注射用のCRISPR-Cas9混合物を準備したら、それらを凍結することはありませんでした。CRISPR-Cas9混合物は、3日間連続して使用し、4〜8°Cに保った場合、効力に変化しなかった。しかし、3日後にテストしませんでした。
実験注射の両方のセットと両方の抗体の結果セクションで説明したように、試験された16匹のミツバチのうち3匹だけがキノコ体、プロトセラム、および触角葉に大きな分布ATTO550を示した。他のすべてのミツバチでは、CRISPR-Cas9の分布はキノコ体、中央複合体、および/または後部プロトセラムに限定された。この注射方法を使用すると、標的タンパク質の減少は、ミツバチのほとんどでキノコの体にのみ制限されることを任意の行動研究のために理解することが不可欠です.それは、触角葉または食道下神経節にまで及びない。したがって、我々が使用する注射技術は、キノコ体内の受容体の減少および行動実験における中央複合体の効果を研究するのに適しているが、CRISPR-Cas9を導入する別の方法は、他の脳領域を研究するのに適している。
結論として、我々の研究は、脳内の抗体染色の制御としてCRISPR-Cas9の成功した応用を実証した。抗体(抗RDLおよび抗m-mGlutR1)の両方について、mGlutR1-CRISPR-Cas9またはRDL-CRISPR-Cas9の取り込みが成功した場合、対応する抗体染色のレベルも有意に低下した。また、オセリでの注射は、同質ではなかった脳内のCRISPR-Cas9の分布につながったことに注意することが不可欠です。分布は、オセリとキノコの体を取り巻く最小限の領域から、脳全体の多くの細胞まで変化しました。細胞によるmGlutR1-またはRDL-CRISPR-Cas9取り込みの変動は、注射の変動による可能性が高い。我々のデータは、CRISPR-Cas9システムがミツバチで動作することを示しているが、個々のミツバチの脳全体のCRISPR-Cas9取り込みの変動を減らすために注射方法を改善する必要がある。これらの制限の中で、この技術を用いて成虫のミツバチの遺伝子を操作して行動実験を行うことができます。

最近発見されたCRISPR/Cas9システムは、様々なモデルシステムや生物のゲノムDNAを改変するために使用されてきた強力なツールです。ゲノム改変を以前の方法よりも効率的かつ堅牢にすることで、生物医学研究と主要な技術ブレークスルーを加速させました。S.ピョゲネス細菌に自生するこのシステムは、DNA中の二本鎖破断(DSB)につながるCas9エンドヌクレアーゼと、Cas9タンパク質を特定の配列依存性の位置2に誘導するガイドRNA(gRNA)に依存している。CRISPR/Cas9によって生成された二本鎖破断は、非相同的なエンド接合(NHEJ)、フレームシフトにつながるエラーが発生しやすいプロセス、またはドナーテンプレートが存在する場合の相同性直接修復を介して修復することができます。gRNA自体は、標的特異的CRISPRRNA(crRNA)と普遍的なトランス活性化crRNA(tracrRNA)から構成され、精製されたCas9ヌクレアーゼをリボヌクレオプロテイン複合体(RNP)2として化学的に合成して送達することができる。gRNAまたはCas9ヌクレアーゼの蛍光標識は、蛍光顕微鏡4を介して分子成分の検出および細胞内可視化を可能にすることができる。
今回の研究では、CRISPR-Cas9システムを活用して、成体ミツバチの脳内のタンパク質レベルを低下させます。我々は、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)および抗mGlutR1受容体抗体およびGABAA受容体サブユニットRDLおよび抗RDL抗体を研究した。我々は、成体ミツバチの脳内タンパク質量を減らす簡単な方法を開発し、それを使用して、対応するタンパク質に対して開発された抗体の追加試験を駆動するために使用した。CRISPR-Cas9の蛍光をモニタリングして、タンパク質の還元に関与する領域と細胞を推定することができました。
この方法を用いて、我々はまた、共役ペプチドに対してウサギで作られた抗mGlutR1抗体を特徴づけた。このミツバチゲノムは、高度に保存されたAmGluRA(NCBI命名法に従うmGlutR1と名付けられた)代謝型グルタミン酸受容体5をコードする。ミツバチmGlutR1遺伝子は、NCBIデータベースに従って4つの予測スプライス変異体を有する。それは、中枢神経系(CNS)の両方のパパルと成虫の間で発現し、長期記憶形成5に関与することが報告されている。mGlutR1に対して開発された抗体は、ミツバチの学習および記憶過程におけるグルタミン酸作動性システムの研究に不可欠なツールとなり得る。
我々の研究では、アピス・メリライフラRDL受容体サブユニットから結合ペプチドを免疫したウサギで開発された抗RDL抗体も特徴付けた。ミツバチRdl遺伝子、AmRdl(XM_006565102.3、NCBIデータベース)は、14の予測スプライス変異体を有する。 部分的にクローン化されたフラグメントが NCBI データベース AF094822.1 で報告されました。RDL受容体機能とその生理学は、昆虫6、7、8、ミツバチ9、10、11を含むよく研究されています。抗RDLに対して開発された抗体は、ミツバチの学習および記憶プロセスにおけるGABAergicシステムを研究するための不可欠なツールとなり得る。
オクトパミンおよびチラミン受容体の役割に関する以前の研究は、ウェスタンブロット12によるタンパク質量のその後の試験で脳に注入されたRNAiを使用した、13.しかし、RNAiにはいくつかの重要な制限があります。RNAi注射後の短時間のウィンドウのみがあり、その中でタンパク質の減少が起こる13。CRISPR-Cas9は、動物14、15、16の全ての遺伝子を削除または改変するためにミツバチ胚で極めて最近使用された。我々は、成体ミツバチ中のタンパク質の量を減らすためにCRISPR-Cas9の使用を報告した。我々は、制御された実験室条件下での学習と記憶の行動研究に結合する能力のためにミツバチのためのこのアプローチを開発しました17.
本研究では、2つの受容体に対する抗体を開発し、CRISPR-Cas9注射によってタンパク質を減少させた後、成体ミツバチの脳切片で試験した。同時に、行動実験に利用できる実験計画を立案しました。

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283_100 mL</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>アクリルアミド-bis アクリルア</td>ミド <td>Bio-Rad</td><td>500 mL 1610156</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-250g</td><td>蒸留水でミツバチの脳をブロックに固定</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson研究室</td><td>711-546-152</td><td>二次抗体 ウサギ</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATT</td><td>IDT</td><td>1075934</td><td>と desinged guide RNA からの一次抗体を明らかにするために、それは gRNA</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 ヌクレアーゼ V3</td><td>IDT</td><td></td><td>1081058 酵素 CRISPR システム用 リボ核タンパク質を作るために使用されます</td></tr> 過<tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>Bio-RAD</td><td>10 g 1610700</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>抗mGlutR1抗体</td><td>Covalab(フランス)/21st Century 本</td><td>論文の著者による</td>生化学的 <td>ミツバチにおけるmGlut 1の一次インキュベーションに使用</td></tr><tr><td>抗RDL抗体</td><td>本論文の著者による</td><td>21世紀の生化学的</td><td>ミツバチにおけるRDLの一次インキュベーションに使用</td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001154</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>バラカー、アイリス、はさみ、7mm、ブレード、シャープポイント</td><td>、ワールド精密機器、</td><td></td>解<td>剖に使用される、ミツバチ、脳</td></tr>、<tr><td>ベンザミジン</td><td>、シグマ-アルドリッチ</td><td>、12072</td><td>、プロテアーゼ阻害剤</td></tr>、<tr><td>ブレードホルダー用ブレード(壊れやすい)、</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10050-00</td>、<td>ウエスタンブロッティング用解剖</td></tr>、<tr><td>ブレードホルダーとブレーカー</td>、<td>ファインサイエンスツール</td><td>15309</td>、<td>解剖ウェスタンブロッティング用</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td><td>注射手順用</td></tr><tr><td>化学発光ウェスタンブロット検出基質</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL</td><td>RNA 単離</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>DNAイージーキット</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>DNA抽出</td></tr><tr><td>DNAフリーキット</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>DNA除去に使用</td></tr><tr><td>エッペンドルフ リサーチプラスピペット、3パック</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 24ウェル ポリスチレンマルチウェル</td><td>ファルコン</td><td>351147</td><td>マルチウェル</td></tr><tr><td>平底包埋カプセル、ポリエチレン</td><td>電子顕微鏡脳</td><td>セクションのための</td>科学<td>70021</td></tr><tr><td>バスケット鉗子デュモン#5(ペア)</td>頭<td>からミツバチの脳の解剖のための</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11254-20</td></tr><tr><td>鉗子デュモン #5S(ペア)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td>は、<td>解剖のために気管から脳をきれいに</td></tr>する<tr><td>遺伝子発現マスターミックス統合</td><td>DNA技術</td><td>1055770</td><td>qPCRドロップオフアッセイ</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>は、制御peabsorptionのためのペプチドコンジュゲートの調製に使用されます</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td><td>ウェスタンブロッティング、埋め込み培地</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>疎水性フィルター付きナイロンメッシュ</td><td>Spectrum Labs</td><td>145910</td><td>脳切片バスケットの底用</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-50mL</td><td>RNA単離</td></tr><tr><td>キーホールリンペット ヘモシアニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7017</td><td>制御用コンジュゲートの調製に使用</td></tr><tr><td>LSM800共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td><td>IDT</td><td></td><td>はCRISPR-Cas 9用のガイドRNAを設計しました。CRISPR-Cas 9のターゲットmGlutR1ゲノム配列</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 2</td><td>IDT</td><td></td><td>設計ガイドRNA。IDT</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>が設計したCRISPR用の3つのガイドRNA mGlu_Guide mGlutR1ゲノム配列を標的とします。ターゲット mGlutR1 ゲノム配列</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>96 ウェル PCR マイクロプレート</td><td>Applied biosystem</td><td>4346907</td><td>qPCR ドロップオフアッセイと qRT-PCR</td></tr><tr><td>384 ウェル PCR マイクロプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z374911</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>注射</td><td>手順用</td></tr><tr><td>M5904_500mL モデル p87フレーミングブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>サッターインストゥルメント株式会社</td><td></td><td>毛細管調製</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>包埋溶液</td></tr>用 <tr><td>ナノリットル 2000</td><td>ワールド精密機器 ナノリットル</td><td></td><td>注射装置</td></tr><tr><td>ノーマル ドンキー血清</td><td>ジャクソン研究所</td><td>免疫</td><td>細胞化学のためのAB_2337258ブロッキング剤</td></tr><tr><td>非免疫ヤギ血清</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 mL</td><td>イムノブロッティング用ブロッキング剤</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーバッファー</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>CRISPR-Cas9注射液の調製に使用されるヌクレアーゼフリー</td></tr><tr><td>バッファー</td><td>IDT</td><td>AM9337</td><td>CRISPR-Cas9システムの調製に使用されるヌクレアーゼフリー水</td></tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>Genemate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500 g</td><td>PBSと併用してミツバチの脳の固定剤を作る</td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250 mg</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>パラホルムアルデヒドを固定剤として使用; 抗体用緩衝液</td></tr></tbody></table>

crispr-cas9を用いたミツバチ脳部における抗rdlおよび抗mglutr1受容体抗体検査

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

クラスターは、定期的に間隔を空ける短いパリンドローミックリピート(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質9(Cas9)は、遺伝子機能の研究で広く使用されている遺伝子編集技術です。この研究では、この研究で、ジエルドリン(RDL)に対する昆虫GABA受容体サブユニット耐性および代謝型グルタミン酸受容体mGlutR1(mGluRA)に対して開発された抗体の特異性をチェックします。抗体は、果実ハエに特異的な結合ペプチド(ショウジョウバエメラノガスター)ならびにミツバチ(Apis mellifera)に対してウサギで生成された。我々は、ミツバチの脳の部分でこれらの抗体を使用して、ミツバチの脳における受容体の分布を研究した。抗体をペプチドに対してアフィニティ精製し、免疫ブロッティングおよびペプチドコンジュゲートによる古典的なプリゾルプニング法で試験し、抗体がそれらが生じた対応するペプチドコンジュゲートに特異的であることを示した。ここでは、CRISPR-Cas9注射後48時間の脳内タンパク質標的の減少をテストするCRISPR-Cas9技術を開発し、対応する受容体用に設計されたRNAをガイドしました。CRISPR-Cas9法は、1つまたは複数の遺伝子を改変する必要がある場合に、成虫ミツバチの行動分析にも使用できます。

抗RDL抗体検査 この抗体は、図1Aに示すようにRDLペプチドコンジュゲートに対して作製された。抗RDL抗体を特徴付けるための最初のステップは、抗RDL抗体とHRP標識ヤギIgG二次抗体を用いて、ブエ脳から抽出したタンパク質のホモジネートをチェックすることです(図1A、インサート)。両方の抗RDL抗体は、〜50〜60kD(矢印)に位置するバンドを認識し、RDLサブユニットアイソフォームタンパク質の推定重量に対応した。抗RDL抗体が脳スライス中のペプチドを認識していることを実証するために、我々は、プリソルプコントロールを使用した(図1B、C)。抗体を共役ペプチドでプリインキュベートした場合、セクション上の染色は存在しなかった。このことは、抗RDL抗体が、それらが生み出された共役ペプチドを認識することを示した。抗RDL抗体が固定脳組織のタンパク質を認識していることを実証するために、CRISPR-Cas9を使用して細胞内のRDLタンパク質を産生するRDL遺伝子をノックアウトしました。図1D1-3は、抗RDL抗体で標識されたコントロール前頭脳部を示す。このビーは、RDL-CRISPR-Cas9 RNPを注射しなかった。図1D1において、抗RDLは、脳の前頭部にニューロピルを標識する。図1D2の同じ前頭部は、RDL-CRISPR-Cas9複合体が注入されなかったため、ATTO550からの蛍光の欠如を示す。
図1E1-E3は、図1D1-D3にRDL-CRISPR-Cas 9を注入し、コントロール脳と同量の抗体で処理したブチから脳部を示す。抗RDL染色は注射後48時間脳全体で有意に減少し、脳内のATTO550染色の分布(図1E2)は、カインデミアンオセリにおけるRDL-CRISPR-Cas 9注射の成功を示している。脳の複数の散乱細胞はATTO550を示す。RDL-CRISPR-Cas 9の注入に成功すると、コントロールと比較してタンパク質発現が減少しました(図1E1-3)。8つの免疫染色蜂の脳から、キノコ体、原皮、触角葉の細胞におけるRDL-CRISPR-Cas9の高い分布を有する脳は1人だけだったが、他の脳はキノコ体のカリックス、中央複合体で細胞染色を有していたが、ローブは高いレベルではなかった。これらのミツバチにおいて、抗RDL免疫染色の減少は、図1 E1に示す脳ほど劇的ではなかったことに留意することが重要である。
次に、RDL-CRISPR-Cas9注入後のミツバチ48時間の改変RDL gDNAのレベルを推定するために、ドロップオフプローブがRDL gRNAの1つの領域に一致するように設計されたqPCR降下試験を行った。これらの実験では、RDL-CRISPR-Cas9を注入したブナの脳において、蛍光の相対的な減少は、サンプル中の改変されたgDNAの数に対応した。我々の試験では、RDL-CRISPR-Cas9を注入した12匹のミツバチのgDNAにおけるこのガイドに対応する領域は、非注入ミツバチのgDNAと比較して64%±(平均±30%SD)であった(図3A)。
次に、注入後48時間のミツバチにおけるRDL RNAのレベルを推定し、別の群のミツバチでqRT-PCRを行った(図3B)。RDL-CRISPR-Cas 9注入されたミツバチのRDL RNAのレベル(n = 19)と、注入されなかったミツバチのRNAのレベル(n =12)を比較した。これらの実験では、mRNA RDLの相対減少は、非注入ミツバチにおけるRNAのレベルと比較して59%±(平均±15%SE)であった。各ミツバチのRDL RNAのレベルを個別に調べた結果、19ミツバチのうち13ミツバチだけがRNAの有意な減少を示した。これらのデータは、オセリを通したRDL-CRISPR-Cas9の注入が常に多数の脳細胞に達するとは限らないことを示しており、RDL免疫染色されたRDL-CRISPR-Cas9注入ミツバチでデータを確認する。これらの製剤では、8匹中1匹のハチだけが、多くの脳細胞(キノコ体、原始細胞、触角葉)にRDL CRISP-Cas9を有し、他のハチ脳と比較して、RDL-CRISPR-Cas9の分布がプロトセラム(キノコ体カリスおよび中央複合体)の細胞に集中したが、アンテナ葉体(図4-D)はなかった。
抗mGlutR1抗体検査 我々は、ショウジョウバエメラノガスターに特異的なコンジュゲートペプチドに対してウサギで産生された抗mGlutR1抗体を使用した(図2A)。このペプチドの配列は、そのイチペプチド(CLSDKTRFDYFARTVPPD)を有する94%の同一性を示す図2A。まず、免疫ブロッティングを用いて、脳タンパク質に対する抗体をチェックした。この脳ホモジネートを10%SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜から電気泳動的に転移し、抗mGlutR1で染色した。図 2Aの挿入は、2 つのアイソフォームに対応する推定ウェイト (103 および 83 kD) の 2 つのバンドを示しています。この抗体をミツバチの脳でテストしたところ、図2B,Dに示すように、ミツバチの脳切片の神経ピラープロファイルと細胞が標識されていることがわかりました。結合mGlutR1ペプチドを用いた抗mGlutR1抗体のプリソルプ後、特異的染色は、ブネ脳スライス中で消失した(図2C)。これは、抗mGlutR1抗体がペプチドを認識することを確認する(図2C)。次に、mGlutR1-CRISPR-Cas9をメジアンオカリに注入し、コントロールnoguideRNAを用いた。コントロールミツバチ(n=7)では、ATTO550からの蛍光は細胞中に濃縮されなかった。一部の脳は、蛍光ATTO550標識を散乱していた。したがって、図2D1-3の制御製剤は、脳内の抗mGlutR1染色を示すが、ATTO550蛍光は示さない。mGlutR1-CRISPR-Cas9をオセリに注入し、多くの細胞によって取り込まれた場合、機能性mGlutR1RNPを取り込む領域で二次抗体の蛍光レベルが有意に低下した(図2E1-3)。ミツバチは48時間監視され、各実験条件から1つのミツバチが死んでいるのが見つかりました。そこで、今回の実験では、7匹のコントロールミツバチと8匹のCRISPR-Cas9ミツバチを調べた。CRISPR-Cas9を注入したすべてのミツバチは、mGlutR1-CRISPR-Cas9を取った細胞を有していた。これらの細胞のほとんどは、キノコ体のカリックス、中央複合体、および後部原皮であった。キノコ体、中央複合体、および触角葉の多くの細胞でATTO550標識を示したのは7匹中2匹だけだった。これらのミツバチの一例を図2E に示します。これらの製剤におけるmGlutR1染色のレベルの低下は有意であった。他の5匹のミツバチは、キノコ体および後部プロトセラムでmGlutR1 CRISPR-Cas9の正常な送達に対応するATTO550ラベリングを有するが、アンテナローブにはそうではない。
次に、注入後のミツバチ48時間中の修飾されたmGlutR1 gDNAのレベルを推定するために、ドロップオフプローブがmGlutR1ガイドの近くの領域にあるように設計されたqPCRベースのドロップオフ試験を行った。これらの実験では、mGlutR1-CRISPR-Cas 9を注入したミツバチの脳では、12ミツバチ中のgDNAの相対修飾は、非注入ミツバチのgDNAと比較して59%±(平均±33%SD)であった(図3A)。
これらの結果は、異なるミツバチ群におけるqRT-PCR試験でも確認され、そこで、RNPmGlutR1mixを注射した後48時間のミツバチでqRT-PCRを用いてmGlutR1 RNAレベルを推定した(図3B)。mGlutR1-CRISPR-Cas9注入ミツバチのmGlutR1 RNAのレベル(n = 6)と、注入されなかったミツバチのRNAレベル(n =6)を比較した。これらの実験では、注入されたミツバチにおけるmRNA mGlutR1の相対減少は、注射されていないミツバチと比較して53%±(平均±18%SE)であった(図3B)。
キノコ体のケニヨン細胞でRNP RDL-CRISPR-Cas9を発現した4種類のミツバチからのセクションを図4A-Dに示す。キノコ体およびアンテナローブにおけるATTO550蛍光を伴う例のビーは、図4E,Fに示されています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ガイド</td>
			<td>シーケンス</td>
			<td>gRNA</td>
			<td>RNP</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>[ガイドRNA:トラクルRNA]</td>
			<td>[gRNA:Cas9 ヌクレアーゼ]</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide1</td>
			<td>アクサーアCGCGCCCGCT</td>
			<td>GRDL1</td>
			<td>RRDL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide2</td>
			<td>アククトCGアクトガック</td>
			<td>GRDL2</td>
			<td>RRDL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide3</td>
			<td>コツガコグマアカックグック</td>
			<td>GRDL3</td>
			<td>RRDL3</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 1</td>
			<td>CGAAAGTTCTガクGTGTGT</td>
			<td>GMGL1</td>
			<td>RMGL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 2</td>
			<td>ツカガガガガガガGTTCAT</td>
			<td>GMGL2</td>
			<td>RMGL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 3</td>
			<td>GCAAACGTCGGAGTGA</td>
			<td>GMGL3</td>
			<td>RMGL3</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:RDLおよびmGlutR1用に設計されたガイドのヌクレオチド配列。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg"> 図1:抗RDL抗体の特性評価(A)RDLサブユニットの概略図は、ピンクの円が、C末筋におけるN末円およびペプチド1(細胞内CVRFKVHDPKAHSGTGTL-アミド)におけるペプチド2(細胞外CVKKSSFHIATTTNEFIR)の局在化を示す。Aにおけるインサートは、対応する抗RDL抗体(抗RDL pep1および抗RDL pep2を有する)で処理されたミツバチ脳抽出物のウェスタンブロット中のバンドを示す。各免疫ブロットは、タンパク質〜50〜60kDの見かけの大きさを示し、RDLサブユニットの様々なアイソフォームの推定重量に対応する。(B,C)結合ペプチド1を有する抗RDL抗体のプリコンプション。Cにおける画像は、抗体が共役ペプチド1でプリインキュベートされたときのセクションにおける染色の減少を示す。扇形体(Fb)と楕円体(eb)は、脳内の中心的な複雑な構造である。M =キノコ体の内側葉。(D1-3)コントロールの抗RDL染色, 48時間後に注入されたハチ脳セクション. グリーンは、脳内の抗RDL陽性プロファイルを示す.(D2)このビーは注入されておらず、ATTO550蛍光を含まない。(D3)D1とD3の画像をマージしました。(E1-3)細胞核内の48時間(E2)ATTO550蛍光の後にRDL-CRISPR-Cas9の注入は、RDL-CRISPR-Cas9の正常な送達を示した48時間後に抗RDL染色を減少させた。(E3)アンチRDL(緑)とATTO550(赤)のマージされた画像。スケールバー = 100 μm (B-E)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg"> 図2:抗mGlutR1抗体の特性評価(A)免疫化に用いるショウジョウバエメラノガスターペプチドを示すGCPR mGluRの模式図。比較のために、アピスメリライフサイクルペプチドを以下に示す。円は、mGlutR1受容体細胞外ドメインのN末期におけるペプチドの局在を示す。Aにおける挿入物は、抗mGlutR1抗体が既知のアイソフォームの推定重量に相当する、ウェルスブナ〜103kDおよび〜83kDのウェスタンブロットの2つのバンドを認識したことを示す。(B,C)抗mGlutR1抗体のプリソルプ制御は、アンテナローブ糸球体の2つの連続したセクションで。Cにおけるアンテナ糸球体部における抗mGlutR1の画像は、抗mGlutR1抗体による抗mGlutR1ペプチドのプレインキュベーションの結果としての染色の減少を示す。この手順は、抗体が溶液から沈殿し、Bと比較して染色を廃止する(コントロール、プレインキュベーションにおけるペプチドの不在)。(D1)は、コントロール注射後の蜂脳スライス中の抗mGlutR1の染色を、オセルの中央値に示す。この注射は、CRISPR-Cas9によるmGlutR1受容体のノックダウンを可能にするmGlutR1 gRNAを欠いていたため、抗mGlutR1抗体の染色は減少しなかった(緑色)。(D2)ATTO550蛍光の欠如は、脳内の機能的CRISPR-Cas9の欠如を示す。(D3)反mGlutR1とATTO550の画像をマージしました。(E1-E3) は、mGlutR1 が mGlutR1-CRISPR-Cas 9 を注入した後、48 時間永久に倒された脳セクションでの抗 m-GlutR1 の染色を示す。したがって、この脳の染色は、多くの細胞におけるmGlutR1のノックアウトに成功したために大幅に減少する。(E2)ATTO550は、蜂の脳内の多くの細胞核における染色がmGlut1-CRISPR-Cas 9の注入が成功したことを示す。(E3)ATTO550(赤)とアンチmGlutR1(緑)の画像を合成した。スケールバー = 10 μm (B,C);100 μm (D,E)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg"> 図3:修飾されたgDNAの評価および、対応するRPN CRISPR-Cas9の345nLを注射後48時間のブ脳におけるRDLおよびmGlutR1 mRNAのmRNAの発現。(A) 改質領域を有するgDNAの量を評価するqPCRベースの降下アッセイ試験を2-ΔΔCt法を用いて計算し、制御に対して正規化した、未注入の脳。このデータは、平均+SD(B)TheqRT-PCR試験で表され、CRISPR-Cas9注入および未注入ミツバチにおけるmRNAの量を評価するために使用された。アラクチンは参照遺伝子として用いた。相対遺伝子発現を2-ΔΔCt法を用いて計算し、コントロールに対して正規化し、未注入の脳を求めた。データは平均 + SE で表されます<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg"> 図4: ATTO550蛍光によるブナ脳におけるRNP CRISPR-Cas9の分布の例(A-D)キノコ体のケニヨン細胞でRNP RDL-CRISPR-Cas9を発現した4種類のミツバチの脳セクション。(E,F)RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9による注射後の2つの脳48時間の例。スケールバー = 150 μm (A-F)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、成人ミツバチの脳におけるタンパク質の産生を減らして抗体特異性をテストするためにCRISPR-Cas9システムを使用するプロトコルです。

CRISPR-Cas9を用いたミツバチ脳部における抗RDLおよび抗mGlutR1受容体抗体検査

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

初めて、成人ミツバチの脳のニューロンのサブセットに、ヨノトロピックGABAAおよび代謝性グルタミン酸受容体用にコード化された遺伝子の改変を確立しました。CRISPR-Cas9遺伝子編集は、成人の脳内の1つまたは複数の遺伝子を改変し、制御された実験室の条件下での学習と記憶における役割を探求するために使用することができる。この方法は、成虫ミツバチの特定のタンパク質の機能を研究し、また、対応するタンパク質に対する抗体の特異性を試験するために使用することができる。イリーナ・シナケヴィッチとの手順を実証するのは、私の研究室の元学部生であるレフ・カーツマンとヒョン・チョイです。CRISPR-Cas9注射後の免疫細胞化学分析によりRDLおよびmGlutR1の発現を試験するには、まず、オンラインCRISPR-Cas9ツールを使用して、apis mellifera、RDL、およびmGlutR1のガイドDNA配列を使用してガイドを設計します。各ガイドRNAに対してガイドRNA複合体形成を作成し、ガイドRNAの名前を持つ各ガイドに1つの試験管をラベル付けし、ヌクレオチドフリーバッファーの92マイクロリットル、100マイクロモルフルオロフォアの4マイクロリットル、CRISPR RNAの標識されたトランスアクティベートCRISPR RNA、および各チューブに適切なガイドRNA溶液の4マイクロリットルを加えます。すべての材料が追加されたら、溶液を穏やかに混合し、ベンチトップ遠心分離機でチューブの内容物を5秒間回転させ、溶液を沈下させます。その後、溶液を摂氏95度に5分間保ち、ガイドRNA複合体を作成し、続いて室温で10分間冷却します。リボヌクレオタンパク質複合体形成を調製するために、各ガイドRNA溶液の6マイクロリットルおよび6マイクロリットルをマイクロリットルSP-Cas9ヌクレアーゼV3に適切に標識されたチューブに加える。穏やかな混合の後、溶液を摂氏37度で10分間インキュベートし、RNPリボヌクレオタンパク質混合物を注射用に作り、インキュベーションの最後に各リボヌクレオタンパク質の4マイクロリットルを適切なRDLに加える。対照を作るために、ノーガイドRNA溶液は、トレーサーRNAの4マイクロリットルと92マイクロリットルのバッファと4マイクロリットルの水を混合します。水を加えた後、溶液を摂氏95度で5分間保ち、室温に達するまで冷まします。次に、6マイクロリットルの無誘導RNA溶液を、マイクロリットルCas9ヌクレアーゼV3あたり0.5マイクログラムの6マイクロリットルと混合します。リボヌクレオプロテイン混合物注射の場合、キャップに小さな穴を開けてバイアルに個々のミツバチを捕獲した後、氷の上で3分以上ミツバチを固定し、各ミツバチをダクトテープで以前に準備した金属ホルダーに固定します。後胸郭、翼と頭が露出しています。5ミリリットルの注射器を使用して、空腹でなくなるまで1つの臼歯スクロース溶液でミツバチに餌を与え、湿ったペーパータオルを入れた箱に入れて湿度を確保します。次に、2つの35ミリリットルのシャーレの蓋の内側にワックスを置き、皿の底をワックスの上に置きます。各皿のカバーと底の間に1つの大臼歯のスクロースを注入し、1つの供給シャーレを1つのガラススライドで白い箱に入れ、もう一方を1つのガラススライドで黒い箱に入れます。次に、小さな櫛を各ボックスに入れ、RDL CRISPR-Cas9混合物でマイクロインジェクションシステムをロードします。RDL CRISPR-Cas9注射の場合、リボヌクレオプロテインRDLミックスの345ナノリットルを持つ8匹のミツバチの中央値オセリを注入し、続いて1つの臼歯スクロースを供給してから、ミツバチを黒い実験箱に放出します。注射を行わずに 8 個のミツバチの 2 番目のセットをコントロールとしてフィードし、白いコントロール ボックスに放します。その後、両方の箱を湿った紙でポリスチレン容器に入れ、ミツバチを1日2回観察して、十分な食料と良好な湿度を確保します。注射の48時間後、氷の上でミツバチを30秒間固定し、ハサミを使って各昆虫を切断する。ヘッドを発煙フードの解剖顕微鏡下でPBSの4%パラホルムアルデヒドに入れ、バラカーアイリスはさみを使用して、触角、複合眼、および上部外骨格を慎重に迅速に取り除きます。頭部を固定溶液に10分間座ってから、残りのexo骨格を頭部と残りの気管から取り除きます。次に、4%パラホルムアルデヒドの少なくとも1ミリリットルを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に各脳を摂氏4〜8度で一晩置く。翌朝、3.8グラムのアルクロースをエルレンマイヤーフラスコの蒸留水50ミリリットルに加え、アルクロースが液化するまで溶液をマイクロ波に入れます。3〜4個の固定ミツバチの脳を新しい35ミリメートルのシャーレに移し、ティッシュペーパーを使って過剰な固定剤を取り除きます。慎重に脳の上に液体のアルクロースを注ぎ、アンテナローブが上向きになるようにargrose内のサンプルを向けます。アルクロースが固まった後、メスを使用して単一の脳を含むアルクロースの個々のブロックを切り取り、1つのバスケットに疎水性メッシュボトムと600マイクロリットルのPBSを積んだ24ウェルプレートの各ウェルを充填します。次いで、ビブラートオームを用いて、各アルゴローズブロックから脳組織の70マイクロメートルの断面を取得する。単一の脳から取得された同じバスケットのメッシュ上にセクションを配置します。標準的なプロトコルに従って、フルオロフォア共役抗体でセクションを標識した後、取り付け媒体の滴を使用して単一の脳からのセクションで各スライドを埋め込み、蛍光顕微鏡でサンプルを視覚化する。抗RDLは野生型の前頭セクションに神経ピルを標識しますが、CRISPR-Cas9 RDLノックアウトビー脳ではありません。抗mGlutR1抗体に対して同様の特異性が認められた。これらの代表的な、定量PCRは、RDL CRIPSR-Cas9を注入したミツバチの脳における試験を滴下し、蛍光の相対的な減少は、サンプル中の修飾されたガイドDNAの数に対応した。mGlutR1 CRISPR-Cas9注射後、非注射ミツバチの脳で観察されたガイドDNAと比較して、ガイドDNAの相対修飾は、注射されたミツバチの脳で約59%であった。この定量的RT-PCRは、メッセンジャーRNA RDLの相対的な減少は、非注入ミツバチ中のRNAのレベルと比較して約59%であり、注入されたミツバチにおけるメッセンジャーmGlutR1 RNAの相対的な減少は約53%顕著であったが、オセリを介したRDL CRISPR-Cas9の注入は必ずしも多数の脳細胞に達するとは限らない。例えば、これらの製剤では、他のハチの脳と比較して多数の脳細胞においてRDL CRISPR-Cas9を持っていたのは8人中1人だけだった。RDL CRISPR-Cas9は原始セレブラムの細胞内に集中していますが、アンテナローブは濃縮されていません。RNAの凍結や再凍結は避けてください。ミツバチを過度に冷やさないでバイアル内の移動を停止したら、すぐにそれらを利用してください。この技術は、ミツバチの行動に対するキノコおよび中央複合体における阻害性外向性および代謝性受容体の減少の影響を研究するために使用することができる。

anti-rdl-anti-mglutr1-receptors-antibody-testing-honeybee-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（<em&gt;ミツバチ</em&gt;）

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高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

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