Name: 免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学ぶ免疫標識と光学クリアリングを用いた腎組織の三次元イメージング法。シンナム酸エチルによる透明化と共焦点顕微鏡で、多細胞構造の可視化・定量化が可能になり、疾患診断と組織構造解析に応用されます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

T.S.は、DFGドイツ研究財団(332853055)、エルス・クローナー・フレセニウス・スティフトゥン(2015_A197)、RWTHアーヘン(RWTHリターナープログラム)の医学部からの助成金によって支援されています。V.G.P.は、ドイツのゲッセルシャフトファーネフロロジー、アレクサンダー・フォン・フンボルト財団、オーストラリア国立保健医療研究評議会の研究フェローシップによって支援されています。D. H. E はフォンダシオン・レダックによってサポートされています。R. K. は、DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1,SFB/TRR57,SFB/TRR219)、ノースラインウェストファミリア州(MIWF-NRW)、RWTHアーヘン大学臨床研究学際センター(O3-1)からの助成金によって支えられています。

注:ここに記載されているすべての実験手順は、オレゴン州立保健科学大学、ポートランド、オレゴン州、およびドイツのアヘンの関連地方自治体の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 逆行性腹部大動脈灌流とマウス腎臓の固定
<ol><li>同じ日または夕方にソリューションを準備し、一晩冷蔵庫に保管してください。使用前に室温(RT)に対する温かい溶液。</li>
	<li>
1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で3%パラホルムアルデヒド(PFA)の新鮮なバッチを作ります。マウス1匹につき約50~100mLのPFAが必要です。
	<ol>
<li>PFAの1Lを作るために:PFAの30グラムの重量を量り、ヒュームフードに蒸留水の800 mLを追加します。50-60 °Cに攪拌し、熱します。70°C以上の加熱を行わな。 注意: PFA は有毒です。ヒュームフードにPFAを準備します。</li>
		<li>ゆっくりと2N NaOHの数滴を追加します。PFA がソリューションに入るか、さらに数滴を追加するまで、数分待ちます。一部の小さなチャンクは溶解しません。</li>
		<li>溶液を熱から取り除きます。20x PBSの50 mLを追加します。RTに氷の上で冷やす。</li>
		<li>pHをHClで7.3-7.4に調整し、蒸留水を1Lに加えます。</li>
		<li>0.22 μm フィルターで 1x PBS および 3% PFA を濾過して、未溶解粒子を除去します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1x PBSの1Lにヘパリンの1,000単位を追加します。ヘパリンを含む1x PBSと3%のPFAを1x PBSで別々の50 mLプラスチックシリンジに移します。 注:利用可能な場合は、80-100 mmHgまたは静水圧(ドリップ法、灌流溶液の高さ:動物の上160〜200センチメートル)に設定された圧力制御ポンプは、腎臓灌流に使用することができます。</li>
	<li>PBS、PFA、鈍い21Gバタフライ針を3ウェイストップコックに接続します。システム全体に気泡がないことを確認します。</li>
	<li>15 mLの円錐形チューブにラベルを付け、それにPFAの10 mLを分配します。</li>
	<li>120 mg/kg 体重ケタミンと 16 mg/kg 体重キシラジンを使用して年齢の男性または女性 C57BL/6 マウス 12-24 週を深く麻酔.動物は、手術に進む前に反射神経をつまむ(例えば、つま先のピンチ反射)応答性の完全な欠如をチェックする必要があります。</li>
	<li>動物が麻酔の外科面に達したら、解剖顕微鏡の下で背中に置きます。手術はさみを使用して中線腹部切開で腹部を外科的に開き、腹部大動脈を露出させる。</li>
	<li>腹部大動脈を直上に固定し、血栓を曲がった止血で結節する。その後、マイクロセレファインで腎動脈のすぐ下の腹部大動脈をクランプします。バンナスはさみで2つのクランプの間に腹部大動脈に小さな切開(1ミリメートル)を作ります。蝶の針をゆっくりと切開部に挿入し、腹部大動脈を開けないように注意してください。</li>
	<li>5-0シルク縫合糸で右腎動脈をリゲートし、灌流と固定のために1つの腎臓だけが必要な場合は、他の分析のために右の腎臓を取り除きます。</li>
	<li>マイクロセレファインを取り外し、ヴァンナスはさみでポータル静脈をトランスエクトし、ヘパリンを含むPBSの50 mLを直ちに浸透させ、その後、3%PFAの50 mLで切り替え、浸透する。 注:腹部大動脈を通る高い灌流圧は、組織を通じてより良い抗体拡散のために腎管を開くために必要とされる。心臓を通る灌流は腎管を開けないかもしれない。</li>
	<li>注入された腎臓を慎重に収集し、組織を穿刺または圧迫を避ける。</li>
	<li>カプセルを取り出し、腎臓を厚さ1mmの冠状動脈スライスに切ります。スライスの厚さを標準化するには、スライサーマトリックス (材料の表)を使用します。 注:または、ビブラートムの使用を検討してください。</li>
	<li>腎臓のスライスを標識された15 mL円錐形チューブに準備されたPFAで浸します。</li>
	<li>PFAの10 mLを別の標識された15 mL円錐形チューブに分配します。次のマウスに移動する前に、PBSで3ウェイストップコックと蝶の針をフラッシュします。</li>
	<li>光から保護されたRTで一晩ポスト固定を行います。</li>
</ol>2. 組織調製と免疫染色
<ol><li>固定後、腎臓スライスをRTの水平ロッカーで1時間1x洗浄バッファー(材料の表)で2回洗います。</li>
	<li>抗原検索を実行します。500mLビーカーで1x抗原アンマスキング溶液(材料のT可能)の300 mLを92-98°Cに加熱します。92-98 °Cで1時間撹拌しながら加熱されたバッファーに透過性のカセットを埋め込んでスライスを囲みます。ビーカーを熱から取り出し、RTに冷ましておきます。 注:一部のベンダーは、免疫組織化学の適用のために抗体をテストし、データシートに推奨抗原検索方法を含めます。したがって、一部のエピトープは、より基本的なバッファ(例えば、pH9)を必要としてもよい。</li>
	<li>スライスを0.1%のトリトンX-100で1x洗浄バッファーの10 mLに移し、RTで一晩ロックします。</li>
	<li>通常の抗体希釈剤の500μLで一次抗体を希釈する(材料の表)。濃度が 1:50-1:100 から始まります。希釈した一次抗体で腎臓スライスを37°Cで4dで静かに揺らします。 注:各抗体は固有の特性を有するため、抗体のインキュベーションおよび希釈時の温度は、個々のプローブに最適化する必要があります。二次抗体のみのコントロールの場合、一次抗体なしで希釈剤で腎臓組織をインキュベートする。市販の抗体希釈剤の代わりに、0.1%トリトンX-100および0.01%のアジドナトリウムを用いた1x PBSを使用することができる。</li>
	<li>腎臓スライスを10mLの1x洗浄バッファーで一晩RTで洗浄し、8時間後に洗浄バッファーを1回交換します。</li>
	<li>正常抗体希釈剤の500 μLで二次抗体(例えば、Alexa Fluor結合二次抗体の場合は1:100)を希釈する。希釈二次抗体で腎臓スライスを37°Cで4日間インキュベートします。このステップ以降は、腎臓のスライスを光から保護します。</li>
	<li>腎臓のスライスを10mLの1x洗浄バッファーで一晩RTで洗浄し、8時間後に洗浄バッファーを1回交換します。</li>
</ol>3. 組織クリアリング
<ol><li>腎臓スライスを5mLの高品位100%エタノール(材料表)を穏やかな揺れ(1時間後に新鮮なエタノールに1回変更)でRTで2時間転送します。このステップは、組織脱水のためです。 注:高品位のエタノールは、次のステップで高い組織半透明を達成するために必要とされる。メタノールまたはテトラヒドロフランは、高い線引電性を持つ代替脱水試薬である。</li>
	<li>一晩RTで穏やかな揺れ(2時間後に新鮮なECiに1回の変更で)とECi(材料のテーブル)の2 mLに腎臓スライスを浸します。 注:ECiの凍結/融点は6-8 °Cです。そのため、サンプルは冷蔵庫に保管しないでください。適切に換気されたヒュームフードに浸漬を行い、衣服や皮膚との直接接触を避けます(ECiは非毒性食品医薬品局承認化合物ですが、臭いが強い)。通常のエッペンドルフチューブまたはガラス容器(ポリスチレン容器なし)を使用してください。</li>
	<li>組織の半透明度はECi浸漬後および腎臓のスライスがイメージ投射の準備ができているとき達成することができる。</li>
</ol>4. 共焦点イメージングと画像解析
注:イメージングのために、屈折率一致溶液が対物レンズと互換性がある限り、他の顕微鏡検査技術を使用することができる。このプロトコルは、反転共焦点顕微鏡を使用します。
<ol><li>ガラス底皿(材料の表)にECiの600-1,000 μLを追加します。 注:ECiはプラスチック製の皿を溶かす有機溶剤であるため、通常の細胞培養皿の使用は避けてください。同様に、ECi は対物レンズのプラスチック部品/絶縁リングを攻撃する可能性があります。互換性のあるイメージング皿30および自作の3Dプリントチャンバ28の概要については、適切なレポートを参照してください。</li>
	<li>半透明の腎臓スライスを皿に移します。腎臓のスライスに丸いカバースリップを置き、ガラス底に光圧をかけます。ECiの漏れを避けるために、パラフィンフィルム(材料のテーブル)で皿を密封します。 注:全体の器官または数ミリメートルの厚さの組織スライスは、サンプルのためのECiプールを作るために組織の周りの境界(歯科セメントまたはシリコーンエラストマー;材料の表を参照)を必要とするかもしれません。</li>
	<li>皿を顕微鏡イメージングプラットフォームに置きます。</li>
	<li>いくつかのZスタックを取り、ステッチを実行します。5 μm の Z ステップ サイズから開始します。 注:非常に厚いティッシュスライスまたは器官のイメージ投射のための長い作業距離(>5 mm)および高い数値絞り(>0.9)の目的を使用することを検討してください。イメージング後、組織をエタノールに戻し、0.02%のアジドナトリウムで洗浄バッファーまたはPBSに保存します。</li>
	<li>ソフトウェア (材料の表)を使用して 3-D レンダリングを使用してイメージを分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li>
<li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li>
<li>Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+podocyte+depletion%3A+theoretical+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations.</a> Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).</li>
<li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+can+see+clearly+now%3A+optical+clearing+and+kidney+morphometrics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916(2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C2%27-thiodiethanol%3A+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li>
<li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).</li>
<li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li>
<li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+%28in+press%29%22%5BJournal%5D)">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li>
<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li>
<li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li>
<li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355(2019).</li>
<li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li>
<li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li>
<li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039(2013).</li>
<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Holliger, P., Hudson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+and+the+rise+of+single+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments and the rise of single domains.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).</li>
<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

光学クリアリング技術は、様々な臓器における微小解剖学の3D可視化と定量化に広く注目されています。ここで、溶媒系クリアリング法(ECi)を、腎臓スライス中の管状全体の3Dイメージング用免疫標識と組み合わせた。この方法は、シンプルで安価で迅速です。しかし、他の研究の質問は、他のクリアリングプロトコル5で最もよく答えられるかもしれません.また、溶媒ベースの方法は、主に脱水ステップ14、18に起因して、可変度で組織収縮を引き起こすことに留意することが重要である。ほとんどの溶媒ベースの方法(例えば、ECi14)も、GFPやtdTomatoなどのレポーターの内因性蛍光を少なくとも部分的に消光する。したがって、FDISCO32、CLARITY12、またはCUBIC11は、代替プロト...

臓器全体や大きな多細胞構造の研究に対する関心の高まりは、透明な組織を3次元でイメージングする光学クリアリング法の開発につながっています。最近まで、全体の構造の細胞数、長さ、または体積を推定する最良の方法は、2次元1の後続の分析のための組織の全身サンプリングに基づく立体または網羅的な連続断面であり、2,3.しかし、これらの方法は時間がかかり、高いレベルのトレーニングと専門知識を必要とします4.光学クリア法は、サンプル全体で屈折率を平衡化して、3-Dイメージング5、6、7の組織を半透明にすることによって、これらの問題を克服する。
いくつかの光学クリア法が開発されており、溶媒ベースと水性ベースの2つのカテゴリーに分類されます。水性ベースの方法は、さらに単純な浸漬8、9、高水和10、11、およびヒドロゲル埋め込み12、13に分けることができる。溶媒ベースの方法は、組織を脱水し、脂質を除去し、屈折率を約1.55の値に正規化する。ほとんどの溶媒ベースの方法の限界は、GFPなどの一般的に使用されるレポータータンパク質の内因性蛍光の消光、溶媒毒性、一部のイメージングチャンバーまたは対物レンズで使用される接着剤を溶解する能力、および組織の収縮脱水14,15,16,17,18,19,20,21.しかし、溶媒ベースの方法は、簡単で時間効率が良く、多くの異なる組織タイプで働くことができます。
水性ベースの方法は、1.38-1.528、11、12、22、23、24の範囲で屈折指数を有する水溶液中の組織の浸漬に依存する.これらの方法は、内因性蛍光レポータータンパク質の放出を維持し、脱水誘発収縮を防ぐために開発されたが、ほとんどの水性ベースのクリアリング方法の限界は、プロトコルのより長い持続時間、組織の拡張、およびタンパク質修飾(すなわち、ScaleA2のような過水化プロトコルにおける尿素によるタンパク質の部分変性)7、11、23、25。ScaleSは、尿素とソルビトールを組み合わせることにより組織膨張に対処し、尿素誘発組織膨張を脱水してバランスをとり、電子顕微鏡10で評価した組織超構造を保存した。組織の収縮または膨張は、構造の絶対サイズ、オブジェクト間の距離、または体積あたりの細胞密度に影響を与えます。したがって、組織の除去時のサイズ変化の測定は、得られた結果7、26を解釈するのに役立ち得る。
一般に、光学クリアリングのためのプロトコルは、前処理、透過性化、免疫標識(必要な場合)、屈折率照合、高度な光顕微鏡によるイメージング(例えば、2光子、共焦点、またはまたは)光シート蛍光顕微鏡)。クリアリングアプローチのほとんどは、神経組織を視覚化するために開発されており、新しい研究は、他の臓器5での応用を検証しています。この包括的なツールは、糸球体27、28、免疫浸潤28、血管系28、および管状セグメントを含む腎臓構造の信頼性と効率的な分析を可能にするために以前に実証されています29、および健康および疾患における糸球体機能および管状リモデリングの理解を深める理想的なアプローチである。
ここで要約すると、腎臓の管状の免疫染色を組み合わせた溶媒ベースの方法です。安価で非毒性で、すぐに使用する化学エチルシナメート(ECi)による光学クリアリング。完全な管の視覚化および定量を可能にする共焦点顕微鏡イメージ投射。この方法は簡単で、市販の抗体の染色と腎臓スライスの抗原検索を組み合わせ、特殊な装置を必要としないため、ほとんどのラボがアクセスできます。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上m フィルター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-761-112</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>21 G バタフライニードル</td><td>ブラウン</td><td>ベノフィックス</td><td></td></tr><tr><td>3ウェイストップコック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>K420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>3D分析ソフトウェア</td><td>Bitplane AG</td><td>IMARIS</td><td></td></tr><tr><td>3D分析ソフトウェア</td><td>Cellprofiler</td><td></td><td>無料のオープンソースソフトウェア</td></tr><tr><td>5-0 silk suture</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>50 mL プラスチックシリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-57</td><td></td></tr><tr><td>抗BrdUモノクローナル抗体</td><td>Roche</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>抗体希釈剤</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>CD31-647</td><td>BioLegend</td><td>102516</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸抗原賦活化液</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>湾曲止血剤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>ダコウォッシュバッファー</td><td>アジレント</td><td>S3006</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Motic</td><td>DSK-500</td><td></td></tr><tr><td>カセット埋め込み</td><td>カールロス</td><td>E478.1</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td></td><td></td>100983</tr><tr><td>桂皮酸エチル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>フレキシブルフィルム/パラフィルム M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗AQP2</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジー sc-9882</td><td></td></tr><tr><td>モルモット 抗NKCC2</td><td>該当</td><td>なし 該当なし DOI</td><td>: 10.1681/ASN.2012040404</td></tr><tr><td>HCl</td><td>カールロス</td><td>P074.1</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>401-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Agnthos</td><td>312-471-140</td><td></td></tr><tr><td>水平ロッカー</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>イメージングディッシュ</td><td>Ibidi</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>MWI Animal Health</td><td>501090</td><td></td></tr><tr><td>Micro serrefine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>手術用はさみ</td><td>メリット</td><td>97-272</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗リンショThr53-NCC</td><td>PhosphoSolutions</td><td>p1311-53</td><td></td></tr>シリコーン<tr><td>エラストマー</td><td>ワールド精密機器Kwik-SIL</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>アジ</td><td>化ナトリウムSigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>組織スライサー</td><td>Zivic Instruments</td><td>HSRA001-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>AC215682500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Lancer</td><td>Series 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MWI Animal Health</td><td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

光学クリアリング技術は、その後の3次元(3-D)イメージングのためにサンプル全体で屈折率を平衡化することにより、組織を透明にします。彼らは、顕微鏡的な距離にわたって広がる顕微鏡多細胞構造を分析する可能性について、すべての研究分野で大きな注目を集めています。腎臓の管、血管、神経、糸球体が多くの方向に広がっていることを考えると、これまで伝統的な2次元技術によって部分的にしか捕捉されていなかったため、組織のクリアリングは腎臓研究の多くの新しい領域を開きました。光学クリアリング方法のリストは急速に成長していますが、この分野の初心者が特定の研究問題に最適な方法を選択することは困難なままです。ここでは、厚いマウス腎臓スライスの抗体標識を組み合わせた簡単な方法です。安価で非毒性ですぐに使用でき、化学エチルシナメートを用いて光学クリアリング。と共焦点イメージング。このプロトコルは、腎臓を浸透させ、特殊な装置を必要とせずに抗体結合を増加させるために抗原検索ステップを使用する方法について説明します。その応用は、腎臓内の異なる多細胞構造をイメージングする際に提示され、組織への不十分な抗体の浸透をトラブルシューティングする方法に対処される。また、内因性蛍風素をイメージングし、非常に大きなサンプルを取得することの潜在的な困難と、それらを克服する方法についても議論する。この簡単な議定書は3次元のティッシュを研究するための容易なセットアップおよび包括的な用具を提供する。

腎臓は、43種類の細胞型31からなる複雑な器官である。これらの細胞のほとんどは、糸球体や細管などの大きな多細胞構造を形成し、その機能は互いの相互作用に大きく依存しています。古典的な2-D組織学的手法は、部分的にこれらの大きな構造をキャプチャし、無傷の構造内の焦点変化を見逃す可能性があります 31.したがって、光学クリアリング技術を用いて3D解析を行い、それらが健康や疾患においてどのように機能するかを理解するのに役立ちます。
ほとんどの溶媒ベースの光学クリアリング技術は、少なくとも部分的に内因性蛍光レポータータンパク質信号を消光する。YFPタグ付きパルブアルブミンのクエンチンは、ECiを用いた脱水および光学クリアリング時に観察された(図1)。しかしながら、他の強い蛍光タンパク質はシグナルクエンチングに抵抗し、およびpHを基本レベル(pH8-11)に調整し、内因性蛍光タンパク質14、20、28、30を安定化してもよい。<sup cl...

抗体標識、光学クリアリング、および高度光顕微鏡検査の組み合わせにより、完全な構造または器官の3次元解析が可能になります。ここでは、厚い腎臓スライスの免疫標識、エチルシナメートによる光学クリアリング、および3次元腎臓構造の可視化と定量を可能にする共焦点イメージングを組み合わせる簡単な方法です。

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

大規模な多細胞構造の研究に対する関心の高まりは、透明臓器内の大きな構造の3次元可視化と定量化を可能にするこの光学クリアリング技術の開発につながった。このプロトコルは、簡単で安価で簡単に設定でき、3次元で組織を調査するための包括的なツールを提供します。疾患の多層的性質は、常に伝統的な2次元技術によってシミュレートされるとは限りません。組織の三次元分析は、より良い診断と病気を監視するのに役立ちます。この方法は腎臓組織に限定されず、任意の正常な、病気の組織に適用することができます。この単純なプロトコルは、動物の取り扱いのいくつかの経験を持つ任意の科学者のために従うのは簡単です。抗体標識が悪い場合に異なる抗体を試験し、二次抗体のみを制御することが重要です。まず、原稿の指示に従って1X PBSでPBSと3.0%パラホルムアルデヒドを含むヘパリンを調製し、溶液を別々の50 mLプラスチック注射器に移します。パラホルムアルデヒドは有毒であり、ヒュームフードに用意する必要があります。原稿の指示に従って腎臓を収集し、多用する。その後、カプセルを取り出し、腎臓を1mmの厚さのコロナスライスに切ります。準備したパラホルムアルデヒド溶液を15 mL円錐形チューブに浸します。固定後、腎臓スライスを1X洗浄バッファで1時間洗い、次に抗原検索を進めます。500 mL ビーカーで1X抗原マスク解除液の300 mLを加熱します。次に、腎臓スライスを加熱されたバッファーに透過性の埋め込みカセットに入れ、92~98°Cで1時間かき混ぜます。この抗原検索工程では、温度を92~98°Cの間で安定に保つことが重要です。その後、スライスを0.1%Triton X-100で1X洗浄バッファの10 mLに移し、一晩揺らします。翌日、10mLの新鮮な1X洗浄バッファーでスライスを1時間洗います。一次抗体を500マイクロリットルの正常な抗体希釈液で希釈します。37°Cで4日間希釈された一次抗体で腎臓スライスを穏やかに揺らす。インキュベーション後、腎臓スライスを1X洗浄バッファーの10mLで一晩室温で洗浄し、8時間後にバッファーを1回交換します。二次抗体を500マイクロリットルの正常な抗体希釈希釈し、37°Cで4日間腎臓スライスでインキュベートする。このステップから、腎臓のスライスは光から保護されるべきであることに注意してください。二次抗体でインキュベーションした後、腎臓スライスを10 mLの1X洗浄緩衝液で一晩室温で洗浄する。腎臓スライスを脱水するには、高品位100%エタノールの5mLに移し、室温で2時間揺らし、1時間後にエタノールをリフレッシュする。腎臓スライスをエチルシナメートの2mLに浸し、一晩穏やかに揺れます。組織を画像化する準備ができたら、600〜1000マイクロリットルのエチルシナメートをガラス底皿に加え、腎臓スライスを皿に移します。腎臓スライスに丸いカバースリップを置き、パラフィンフィルムで皿を密封します。皿を顕微鏡の撮像プラットフォームに置き、原稿の指示に従ってティッシュをイメージする。このプロトコルは、腎臓組織の3D解析を成功させ、細胞の機能と相互作用を評価するために使用されています。この方法は、蛍光レポーターの急行を引き起こす可能性がありますが、他の強力な蛍光タンパク質は、シグナルクエンチングに抵抗する可能性があります。腹部大動脈拡散は、抗体拡散を改善することができる。場合によっては、抗体の侵入が悪いと表面的なシグナルが生じます。これは、より高濃度または抗体の補充で補正することができます。対象となる抗原が腎臓血管系で発現する場合は、血管内送達を考慮すべきである。しかしながら、尿細管上皮細胞の有端膜内のタンパク質を標的とする抗体は、糸球体濾過障壁を越えて非特異的なシグナルを引き起こさない。この組織は、特定の細胞集団を検出するか、細管セグメント全体を可視化するために抗体で標識することができる。さらに、3Dにおけるタンパク質の共局在化は、複数の抗体を組み合わせることによって達成することができる。抗体標識は、良好な腎臓拡散、抗原検索ステップの使用、および高い抗体濃度で改善できることを覚えておくことが重要です。いくつかの強力なレポータータンパク質は、このプロトコルに従って蛍光シグナルの消光に抵抗する可能性があります。これをテストするために、抗原検索および抗体標識のステップをスキップする。この技術は、構造の立体的性質を尊重し、研究のための多くの新しい分野を開きます。従来の 2 次元解析に関連する必要な仮定と干渉を排除します。

optical-clearing-and-imaging-of-immunolabeled-kidney-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

出典: ベヘラ、R. K.、 他 感染組織における細菌の遺伝子調節を研究するための蛍光ベースの手法。 J. Vis. Exp.

マウス腎組織における細菌定着の蛍光イメージング

このビデオでは、CUBIC(Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational...

腎臓の3次元イメージングのためのホールマウント臓器染色技術

ACT-PRESTO（器官への巨大分子のアクティブな明快技術-圧力関連の効率的かつ安定した転送）は、受動拡散または圧力補助送達によるクリア組織への、迅速、効率的な、しかし、安価な組織清算および迅速な抗体の浸透を可能にします。この方法を使用して、組織の広い範囲は、クリア複数の抗体によって免疫標識、および体積画像化することができます。...

ACT-PRESTO：生体組織のクリアとボリュームイメージングのための免疫標識方法

ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 +白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。...

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

糸球体、近頭尿細管、太い上昇肢、集結管およびインタースティジウムを含むヒト腎臓のサブセグメントのレーザーマイクロディシセクションのプロトコルについて述べている。次いで、RNAを得られたコンパートメントから単離し、RNAシーケンシングを行い、各サブセグメント内のトランスクリプトームシグネチャの変化を決定する。...

ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用

このプロトコルの目的は、ビブラートメの切断を使用してマウス腎盂の無傷のペースメーカー領域を分離することです。これらのセクションは、その後、ビブラート細胞内のペースメーカー細胞および他の間質細胞のCa2+一過性特性を解明するために、Situ...

ビブラートーム切除によるマウス腎盂の分離とイメージングライブ、無傷のペースメーカー領域

ここでは、脳組織のCLARITY法を全マウントレチナに適応させ、標準的な免疫組織化学染色およびレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングの品質を向上させるプロトコルを提示する。...

CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色

腎臓病の病態生物学を理解するためには、サイトカインの分泌に関与する細胞種を特定する必要があります。ここでは、分泌阻害剤であるブレフェルジンAと細胞種特異的マーカーを用いて、腎臓上皮細胞や間質細胞が産生するサイトカインを腎臓組織に定量的に染色する方法について述べます。...

ブレフェルジンA注射による腎臓内の分泌タンパク質源の同定

ここでは、表面糸球体を有するミュンヘンWistar...

2光子顕微鏡を使用して、糸球体プロセスに対する慢性片側尿管閉塞の影響を定量化

本プロトコルは、3次元(3D)腎臓イメージングのための組織透明化法およびホールマウント免疫蛍光染色を記載する。この技術は、腎臓病理学における巨視的な視点を提供し、新しい生物学的発見につながる可能性があります。...

CUBICによる全腎三次元染色

この研究は、CUBIC透明マウス腎臓からの糸球体を標識および分析するための、使いやすく完全でシンプルな一連の方法を提示します。糸球体数や体積などのデータは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)、または一般的な共焦点顕微鏡とImarisなどのソフトウェアを使用して簡単かつ確実に取得できます。...

マウス糸球体の標識と分析のための効率的で迅速な方法

学ぶ免疫標識と光学クリアリングを用いた腎組織の三次元イメージング法。シンナム酸エチルによる透明化と共焦点顕微鏡で、多細胞構造の可視化・定量化が可能になり、疾患診断と組織構造解析に応用されます。

免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

さらに動画を探す