Name: 成体ゼブラフィッシュの生体内心電図検査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶ成体ゼブラフィッシュの生体内心電図検査法。最小侵襲で哺乳類用データ収集システムを応用し、リアルタイムECG解析により心臓生理や薬物毒性スクリーニングの研究に活用できます。

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この研究は、TPNに国立衛生研究所R01 HL111452によってサポートされました.ADInstrumentsは、オープンアクセス公開のコストを削減するために寛大な資金を提供しましたが、実験的な設計、データ取得、本研究のデータ分析、または出版前の原稿へのアクセスに関しては何の役割もありませんでした。

この研究のすべての実験は、実験動物のケアと使用のための米国国立衛生ガイドに従って行われました。この研究のすべての動物プロトコルは、UCLA機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 実験セットアップの準備
<ol><li>28 °C ± 0.5 °C で 14 時間の光、10 h 暗い光周期で流れ間水槽システムでゼブラフィッシュを維持します。毎日フレーク食品を食べ、塩水エビ(アルテミアナウプリ)を毎日2回食べます。本研究におけるゼブラフィッシュは、UCLAゼブラフィッシュコアによって維持され、供給された。</li>
	<li>実験当日は、水族館から実験室にゼブラフィッシュを輸送します。</li>
	<li>本質的な機器を接続し、3色コード化されたステンレス鋼の電極をアンプの3色マッチングアクセスポータルに挿入することにより、インビボECG記録システムをセットアップします(図3)。ECG 記録および/または分析セッションの開始時にシステムを起動します。</li>
	<li>タイマー/ストップウォッチ、魚、鉗子、はさみ、パスツールピペット、文化料理(100mm x 20mm)を保持するためのスリット付きのウェットスポンジなど、必要なツールを調達します。</li>
</ol>2. 麻酔誘導
<ol><li>ECGデータ取得中のモーションアーティファクトを避けるために、痛みのコントロールと魚の固定化のための浸漬麻酔を準備します。ほとんどの実験室は浸漬トリカイン(エチル3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸塩、MS-222)を使用しています。<ol>
<li>トリカイン0.4%のストック溶液を作るために、ネジで覆われたダークガラスボトルに次の項目を組み合わせます:トリカインパウダー400mg、二重蒸留水の98 mL、および1 Mトリスの2 mL(pH 9)。必要に応じて 1 N NaOH または 1 N HCl を使用して pH 7.0 に調整します。</li>
		<li>トリカインの最終的な浸漬液を作るために、ゼブラフィッシュの年齢9、サイズ、代謝状態、ひずみ、疾患モデル、科学的目的、および手続き期間に適した最小濃度を決定する。</li>
		<li>トリカイン濃度応答試験を行い、必要に応じて推奨濃度168mg/L(または0.0168%)9から上下に刺激し、可能な限り少ない心呼吸毒性で3分以内に麻酔のレベル4を達成する。例えば、本研究では、生後12~18ヶ月の野生型ABゼブラフィッシュを0.02-0.04%トリカイン溶液に浸漬すると、3分以内にレベル4の麻酔が誘発される。 注:麻酔のレベル4では、平衡と筋肉の緊張が完全に失われ、眼利運動速度は8に減少します。</li>
		<li>必要に応じて、麻酔薬の選択と投与経路の適切性に関する追加のガイダンスについては、施設動物管理・使用委員会(IACUC)の獣医師に相談してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>成虫ゼブラフィッシュを、最も低い所定およびIACUC承認濃度のトリカイン溶液を含む皿に浸漬し(例えば、本研究では0.02-0.04%)、3分以内に麻酔のレベル4を誘導する(図2)。<ol>
<li>生存ECGプロトコルの場合は、ECG記録セッションを可能な限り簡潔に保ちます(10分以下)。15分未満続く短い心電図記録セッションのために、麻酔の維持は必要ではない。</li>
		<li>長時間のECG記録セッションの場合は、長時間作用型の筋肉内麻痺と経口灌流システムを使用して、十分な水分補給と酸素化6を提供します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 心電図リードの配置
<ol><li>ゼブラフィッシュが麻酔のレベル4を3sに維持したら、一対の鈍い鉗子を使用して、ECGリード電極の配置のために、その腹部表面を最上部にした湿ったスポンジスリットに魚を直ちに移します(図4)。</li>
	<li>3つのECGリード電極を魚の筋肉に約1mmの深さにそっと挿入し、心臓主軸の左の左右の頭蓋方向に平行する正面面に双極性リードを確立します。</li>
	<li>心室中線の正(赤)電極を球根動脈のレベル、すなわち、オペルキュラムの2つの下端を接続する架空の線の上に1〜2mmに配置する(図4A)。</li>
	<li>負の(黒)電極を横方向に正極に向け、成色ゼブラフィッシュ心室の最大アプコバサル長さより大きい距離で0.5〜1.0mmを横に位置させる(図4A)。</li>
	<li>参照(緑色)電極を肛くおきに肛と肛と肛と配置します。 注:心臓の主軸は魚によって多少異なるため、R波振幅とT波振幅を最大化するために、試行錯誤を繰り返して小さな体系的な変更を行うことでリード位置を調整します。たとえば、両方の電極の代わりに 1 つの電極 (正または負) を一度に変更し、ランダムな方向に不規則な変更を行う代わりに、別の方向に変更する前に、1 つの指定された方向に段階的に変更します。</li>
</ol>4. 心電図記録
<ol><li>ECG データ取得プログラムを開きます。範囲、ローパス、およびハイパスのドロップダウンメニューから目的の設定を選択します。例えば、この実験で使用されるインビボECG記録システムの次の設定は、通常の成体ゼブラフィッシュに対して一貫性のある、満足のいく信号対雑音比をもたらす:範囲「2 mV」、ローパス「120 Hz」、およびハイパス「0.03 s」。</li>
	<li>[スタート]を押すと、1 kHz のサンプリング レートで連続的なギャップのない ECG 記録が開始されます。</li>
	<li>最大信号対雑音比のリード位置を最適化するには、ストップを押してECG記録を停止し、各心臓の最初の記録試行直後にECGトレースを確認します。 成虫ゼブラフィッシュECGが正常であることを診断するには、以下の4つの検証基準がすべて満たされていることを確認してください(図1)。<ol>
<li>基準 1: すべての ECG 波形(P、QRS、および T)が明確で容易に表示されていることを確認します。</li>
		<li>基準 2: P 波が正であることを確認します。</li>
		<li>基準 3: 正の QRS 複合体が正であることを確認します(つまり、R 波振幅が Q 波振幅と S 波振幅の合計よりも大きくなります)。</li>
		<li>基準 4: T 波が正であることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>正常なECGが予想される場合は、4つの検証基準がすべて満たされるまで、必要に応じて電極を再配置します(最初に負極を試してください)。</li>
	<li>通常のT波が予想されるが、T波が小さすぎる場合は、電極を再配置してT波振幅を最大化する。</li>
	<li>リード位置を最適化した後、ECG記録を再開します。後続の分析のために ECG スイープを保存します。</li>
</ol>5. 麻酔からの回復
<ol><li>ECG記録セッションの終わりに、魚を傷つけずに慎重に電極を取り外します。新鮮な酸素化された魚の水にトリカインを含まない魚に魚を転送します。</li>
	<li>麻酔からの回復を容易にするために、魚が定期的なエラの動きや水泳を再開するまで、パストゥールピペットでエラの上に水を激しく噴出します。</li>
	<li>少なくとも5sのために直立して泳ぐ魚の能力によって示されているように、麻酔(通常は1-2分)からの完全な回復のために魚を監視します。</li>
</ol>6. 心電図の解釈
<ol><li>解析設定を定義します。<ol>
<li>ECGデータ分析ソフトウェアの取扱説明書を読んで、ソフトウェアインターフェース(材料の表)を知る。 注:以下の指示は、当社の研究室で使用される商用ソフトウェアに固有のものですが、達成すべき基本的なタスクは、ECG分析のための任意のソフトウェアパッケージで本質的に同じです。</li>
		<li>ECG データ分析プログラムを開きます。[ファイル]メニューから、[開く]を選択して、対象の ECG ファイルを開き、ECG トレース全体を表示します。マウスを使用して、ECG トレースの対象セクションをドラッグして分析します。</li>
		<li>ECG分析メニューから、ECG設定を選択してダイアログボックスを開き、ソフトウェア自動解析のさまざまなパラメータ設定を事前に定義します(図5A)。</li>
	</ol></li>
	<li>心臓のリズムと速度を分析します。 注:心拍数は、ゼブラフィッシュの年齢とひずみ、麻酔剤(例えば、トリカイン、イソフランなど)および濃度、麻酔使用(単剤5、7対結合剤5)を含むいくつかの要因に依存し、および露出時間5.例えば、本研究では、0.02-0.04%トリカイン溶液中の浸漬の3-5分後の12-18ヶ月齢の野生型ABゼブラフィッシュの心拍数は1分間に116±17拍(n=9)であったが、この年齢層の心拍数の文献報告と一致し、麻酔5、7.<ol>
<li>心臓のリズムが正間の有無を判断し、規則的か不規則かを判断する。 注:正間リズムの有無(または不在)は、通常のPR間隔によって各QRSの前にある直立P波の存在(または不在)に基づいている(例えば、Liu et al.の10-12ヶ月齢7および12-18ヶ月の野生型ABシマウマ類)。心房および心室のリズム規則性(または不規則性)は、それぞれ連続するPPまたはRR間隔の規則性(または不規則性)に基づいている。</li>
		<li>心拍数を決定するには、ソフトウェアがすべての P 波と R 波を正しく識別していることを確認します。PおよびR波のこれらの自動識別(または手動修正)に基づいて、ソフトウェアは自動的に心電図選択のすべてのPPおよびRR間隔を測定し、心房および心室率を生成するために間隔平均を計算する。 注:心房速度は平均PP間隔であり、心室率は平均RR間隔である。心拍数を決定するには、P波とR波の正しい同定が重要です。</li>
		<li>置き忘れたカーソルを適切な P 波と R 波に移動して、自動識別の間違いを修正します (図 5B)。 注:心臓が胸部リズムにある場合、心房速度と心室率は、胸部P波とQRS複合体との間の1対1の対応により同じである。しかし、房室解離の場合(例えば、心室頻脈または第3度房室ブロック)の場合、P波とQRS複合体との間のこの1対1の対応は失われる。したがって、心房数は心室速度と異なるため、2つの心拍数があります。</li>
		<li>心臓リズムが規則的な場合は、少なくとも5つの連続した完全な心周期に基づいて心拍数を決定し、心臓リズムが不規則な場合は少なくとも6秒のストリップを決定する。</li>
	</ol></li>
	<li>間隔と波の持続時間を計算します。<ol>
<li>ECG分析>平均化ビューに移動して、n (例えば、5) 連続する心臓サイクルを単一の平均信号に連結します (図 5C)。 注:個々の心周期の心電図波形が平均信号から実質的に発散する場合は、連結せずに心臓周期を別々に研究する。</li>
		<li>平均化ビュー ウィンドウ (図 5C)に表示される P 波、QRS 複合波、および T 波の開始と終了をソフトウェアが正しく識別していることを確認します。これらの波および間隔のこれらの自動識別(または手動修正)に基づいて、ソフトウェアは自動的に従来定義されているように持続時間を測定する。 注: PR 間隔は、P 波の始点から QRS 複合体の始点まで延びています(または Q 波が表示されない場合は RS 複合体)。QRS デュレーションは、Q 波の始まり (または Q 波が見えない場合は R 波) から S 波の終わり (つまり、J ポイント) まで延長されます。図1)QT間隔は、Q波の始まり(またはQ波が見えない場合はR波)からT波の終わりまで延びます。したがって、間隔と持続時間を計算するには、P波、QRS複合体、およびR波の開始と終了を正しく識別することが重要です。</li>
		<li>置き忘れたカーソルを適切な位置に移動して、自動識別の間違いを修正します。</li>
		<li>S波の終端を知らせるゼブラフィッシュJ点は特に正確に識別することが困難な場合があるため、QRS複合体7の終端としてS波の負のピークを選択する。これにより、真の QRS 期間がわずかに過小評価されます。 注: ECG 解析ソフトウェアは、QT 間隔を心室レート (または RR 間隔) に自動的に修正し、手順 6.1.3 でユーザーが事前に選択した方法を使用して修正された QT 間隔 QTc を生成します(図5A)。Bazettの式(1920)QTc = QT / √RRは最も一般的であり、心拍数の人間のQT間隔を修正するために提案されたいくつかの方法の最初です。Bazettの式の精度が疑問視されているので、ヒト10、11およびゼブラフィッシュ6(図5D)のために提案された他の方法を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>手順 4.3 の 4 つの検証基準の例外を認識して、ECG 異常を解釈します。<ol>
<li>基準 1 の例外を認識します。P波がない場合(これは、胸部リズムの不在を示す)、RR間隔とQRS持続時間に依存して心臓のリズムを診断する。例えば、RR間隔が不規則に不規則である場合、心房細動を診断する。RR 間隔が規則的で、QRS が通常狭い場合は、接合エスケープリズムを診断します。一方、RR間隔が規則的でQRSが異常に長引く場合は、心室脱出リズムを診断する。</li>
		<li>基準 2 の例外を認識します。P波が負(または反転)した場合、異所性ペースメーカー(例えば、前房節の下流の心房部位、房室節、または心室)からの逆行心房活性化を診断する。</li>
		<li>基準 3 の例外を認識します。負のP波と負のT波を持つ高くて狭いQ波が存在する場合、それらの背の高い狭いQ波が誤って反転したため、正と負の電極位置の誤ったスイッチによる鉛反転を診断する(図6D)).対照的に、有意な心傷に続いて正のP波を伴う広いQ波が存在する場合、それらの広いQ波は真の病理学的Q波であるため、心筋梗塞を診断する。</li>
		<li>基準 4 の例外を認識します。T波が反転した場合は、心室活性化を検査して、心室再分極異常が一次または二次であるかどうかを特定する。一次心室再分極異常の差分リストから正しい診断を絞り込むために臨床シナリオに頼る(薬物効果または心筋虚血から;図 6C)対二次心室再分極異常(前励起、心室外来、または心室ペーシングからの異常な心室活性化による)。</li>
	</ol></li>
	<li>ECGの所見をエクスポートします。<ol>
<li>すべてのECG測定値を確認するには、[テーブルビュー]を選択します。目的のドキュメント (Excel スプレッドシートなど) にコピーして貼り付ける対象の測定値を選択します。</li>
		<li>ECG トレースを書き出すには、拡大鏡アイコンを使用して ECG スイープの対象セクションを強調表示します。目的の文書(WordやPowerPointなど)にコピーして貼り付けます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

本研究で実証したように、単一の鉛を用いて成体ゼブラフィッシュの生体内ECGで記録する場合、ECG記録結果の品質および妥当性に関する多くの注意事項がある。まず、適切な麻酔薬を選択し、必要最小限の麻酔濃度、深さ、持続時間を決定する際に、麻酔薬の心毒性と運動アーティファクトを抑制する重要な必要性とのバランスをとり、事前の決定を行います。生存と末端の実験計画。異なる薬物クラス5、14および麻痺剤1、6からの複数の麻酔薬の組み合わせの相乗的効力を利用して、個々の薬剤5または投与の用量を下げるより高い誘導用量に続く低い維持線量は典型的な戦略である。しかし、死亡8を含むそのよく知られた潜在的な心呼吸毒性にもかかわらず、トリカインはまだ最も広く使用され、利用可能な最良であり、ゼブラフィッシュのための米国食品医薬品局(FDA)によって承認された唯一の麻酔薬です。麻酔。トリカインは、単一の薬剤として、または他の麻酔薬や麻痺剤と組み合わせて、成人ゼブラフィッシュのECG記録で一般的に使用されています。
第二に、鉛配置精度は、正常な成虫ゼブラフィッシュECGの4つの検証基準を使用して、少なくとも健康な正常ゼブラフィッシュのために確保することができます。ここで提案する4つの検証基準のうち、最後の2つの基準は、通常のECG 5、7、15におけるR波の極性とT波の極性との間の基本的な一致を確認する。このRとT波の一致は、ヒト心臓の代理としてのゼブラフィッシュ心臓モデルの臨床的関連性に寄与するゼブラフィッシュとヒト16、17正常な心電図との間の、不運な、まだ重要な類似性である電気 生理 学。ただし、いくつかの良性または悪性の条件は、4 つの検証基準のいずれかを無効にする可能性があります。例えば、心筋虚血7、15ではR波とT波の一致が失われる。心筋虚血におけるR波とT波の一致のこの損失は、ゼブラフィッシュとヒト心電図の間のもう一つの顕著な類似性であり、ゼブラフィッシュ心筋梗塞モデルの臨床的関連性に寄与する。
最後に、ECG分析の標準的な実践をお勧めします。技術の出現によって、ECGの分析ソフトウェアは自動ECGの解釈を発生させることができる。しかし、我々は、訓練を受けた人間が常にECG記録につながるそれぞれの臨床シナリオに基づいて、すべての心電図を再解釈し、検証することを強くお勧めします。ECG分析ソフトウェアによる自動解釈のみに対する日常的な過度の依存は、特に一般的な正常なECG変異体、心臓病理、または最適でない鉛の配置の存在下では、お勧めできません。
この研究は、短い心電図記録セッションのための最小限に侵襲的な方法に焦点を当てています。しかし、長時間のECG記録セッションの持続時間に必要が生じた場合、連続灌流6による適切な酸素化、水和、麻酔を提供するために修正が必要である。
さらに、信号対雑音比を少なくとも 3 つの方法のいずれかで強化します。より強力なアンプを選択することは、多くの場合、実用的でない場合は、コストがかかります。体積導体を減らすために心膜嚢を開くことは合理的であるが、侵襲的であるが、7を採用したアプローチである。主心軸に平行な方向にリード軸を位置合わせする戦略的なリード配置(図4B)は、心電図電圧信号を最大化しますが、特に心膜検査がない場合は試行錯誤が必要になる場合があります。
ここで紹介した大人のゼブラフィッシュのための生体内ECGの尋問方法は、4つの主な利点を提供しています。まず、私たちの最小限に侵襲的なアプローチは、電極挿入のみを必要としますが、魚のスケール除去や胸部切除術はありません。したがって、魚の痛みを最小限に抑えることで、縦方向の生存研究で繰り返し心電図の尋問を可能にします。第二に、麻酔薬が魚の動きを十分に抑制すると、本研究の生体内ECG記録システムは、ノイズのない生信号で一貫して満足のいく信号対雑音比を生み出します。第3に、ここで提案する4つの基準品質検証は、ECGデータ取得の早い段階でデータの正確性と堅牢性を確保し、オペレータに依存する変動を最小限に抑えます。特に、最後の検証基準(通常のT波は直立している)は、ゼブラフィッシュ正常ECGの重要なヒト様特徴であるR波とT波の一致をカプセル化する(図1)。
しかし、我々のグループや他の人による成体ゼブラフィッシュのための生体内ECG方法論の現在に4つの主要な制限がまだ存在する。
第一に、被験者の協力の欠如は、その限定的な心呼吸毒性の結果と麻酔の必要性を必要とする。生体内ECGの尋問では、人間の患者が決して座り込み必要としないのに対し、ゼブラフィッシュは常に麻酔薬または麻痺を必要とし、そのすべてが可変的な心呼吸毒性を引き起こす。
第二に、取り付けられたECGリードを確保する必要性は、それ以外の場合は非侵襲的な手順の侵襲性をわずかに高める。ヒトの体表面ECG記録における鉛配置は、電極がヒト表皮に付着するため完全に非侵襲的であるのに対し、ゼブラフィッシュの生体内ECG記録における鉛配置は、最低限、鋼電極が必要であるため、より侵襲的である。魚の筋肉に安全に挿入するために魚の皮を穿刺する。
最後の2つの制限は、ゼブラフィッシュの胸と心臓の解剖学的制約に起因する。第三に、成虫ゼブラフィッシュ心臓の微小な大きさは、心電図リード数の劇的な減少を必要とする。人間は標準的なECG記録で12の鉛を容易に収容するが、成虫ゼブラフィッシュは通常、単一極または双極性鉛のみを収容することができる。単一のECGリードの影響は、3つのP波、R波、およびT波の振幅を同時に最適化する課題です。したがって、ゼブラフィッシュECGの尋問における最適で正確な鉛配置の重要性は誇張することはできません。ゼブラフィッシュでは、T波は、多くの場合、これらの3つの波の中で最も小さいため、ユニークな検出の課題を提示します。したがって、ゼブラフィッシュT波振幅は、典型的に大きなP波およびR波よりも最適化優先順位を受け取るべきである。
第4に、ゼブラフィッシュの主な心臓軸を決定してR波振幅を最大化することは困難でありうたえる。その理由は、ゼブラフィッシュの心臓は、その形態フィッティング手袋のような心膜内の人間の心臓と比較して、その緩い心膜嚢内の運動の自由度が高いからである。
全体として、これらの制限は、将来の方法の革新を刺激します。3Dプリンティングと変形可能なエレクトロニクス18の出現により、ワイヤレス電極センサの「心臓ソックス」を使用して、目覚め、警報、水泳ゼブラフィッシュで1日直接鉛注入の希望があります。

ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)心臓は、オペルキュラムと胸郭の間の胸腔に対して前代々に位置する。心臓は銀色の心膜嚢の中でむしろゆるく囲まれています。解剖学的に、ゼブラフィッシュの心臓は、その小さなスケール(人間の心臓よりも100倍小さい)と1つの心室と1つの心室からなる2つのチャンバー構造のために、4チャンバの人間および他の哺乳類の心臓とは異なる。それにもかかわらず、心電図(ECG)波形と両種のQT間隔の持続時間は著しく類似している(図1)。したがって、ゼブラフィッシュは、ヒト遺伝性不整脈1、2、3および潜在的なヒト心毒性のハイスループット薬物スクリーニングのための人気モデルとして浮上している4、5QT 延長などです。
ヒトの心臓疾患のルーチン評価において、身体表面ECGは1903年にアイントホーフェンによって発明されて以来、最も広く使用されている第一線非侵襲的診断ツールとなっている。対照的に、2006年6月に成体ゼブラフィッシュの体表面ECG記録法を初めて適応し、その後7回の改変を行った結果、この技術は現場の多くの研究者にはほとんどアクセスできないままであった。この動物モデルの人気。成体ゼブラフィッシュの生体内ECG尋問を行った他の研究者のために、オペレータ間の広いバリエーションは、異なる研究からの心電図所見の矛盾につながった。一般的な理由は、面倒で高価な特殊なデバイスとソフトウェア、低信号対雑音比、電極配置に関する混乱を含み、成人ゼブラフィッシュECGの機能の不完全な理解によってさらに悪化し、基礎となる組織機構。生体内ECGが電気的に表現型ライブゼブラフィッシュの唯一の診断ツールであることを考えると、感度と特異性、再現性、アクセシビリティを向上させる標準化された方法が明らかに必要です。
ここでは、生体内心電図でゼブラフィッシュを記録し、解釈するための実用的で信頼性が高く、検証されたアプローチを提示します(図2)。前頭面の単一の双極性鉛を用いて、心電図波形の変化と生きた麻酔薬の健康な野生型AB成人ゼブラフィッシュの間隔持続時間を調べた。

<table><tbody><tr><td>培養皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB087571</td><td>100 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>デュモン鉗子</td><td>ファインサイエンス ツール</td><td>11253-20</td><td>0.1 x 0.06 mm</td></tr><tr><td>FE136 アニマルバイオアンプ&nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>FE231</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>Fine Sciense Tools</td><td>11064-07</td><td>0.6 x 0.5 mm</td></tr><tr><td>LabChart 8 Pro</td><td>AD Instruments</td><td></td><td>Software with ECG Module</td></tr><tr><td>Needle electrodes for Animal Bio Amp&nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1213</td><td>29 ゲージ</td></tr><tr><td>プラスチック 使い捨てトランスファー ピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-669-12</td><td>6 in., 1.2 mL</td></tr><tr><td>PowerLab 4/35</td><td>AD Instruments</td><td>4//35</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Sciense Tools</td><td>15000-08</td><td>2.5 mm, 0.075 mm</td></tr><tr><td>トリカイン (3-アミノ安息香酸エチル メタンスルホン酸)</td> <td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>MS-222</td></tr></tbody></table>

成体ゼブラフィッシュの生体内心電図検査

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

成体ゼブラフィッシュとヒトの心電図波形は著しく類似している。これらの心電図の類似性は、ヒト心臓電気生理学およびミオパシーの研究モデルとしてだけでなく、潜在的な心毒性に対する高スループット医薬品スクリーニングの代理モデルとしてもゼブラフィッシュの価値を高めるQT延長などの人間。このように、成体ゼブラフィッシュのための生体内心電図では、生体内電気生理学的特徴付けにおける断面または縦方向に必要な電気表現型ツールである。しかし、あまりにも多くの場合、信頼性が高く、実用的で費用対効果の高い記録方法の欠如は、生体内診断ツールがより容易にアクセスできるようになるのを防ぐ大きな課題のままです。ここでは、一貫性のある信頼性の高い記録を生み出す低メンテナンス、費用対効果、および包括的なシステムを使用して、成体ゼブラフィッシュの生体内心電図に対する実用的でわかりやすいアプローチについて説明します。生後12~18ヶ月の健康な成人男性ゼブラフィッシュを用いてプロトコルを例示する。また、心電図記録プロセスの早い段階でデータの正確性と堅牢性を確保するために、品質検証のための迅速なリアルタイム解釈戦略を導入しています。

図1は、ここに提示される方法の臨床的関連性を示す。成体ゼブラフィッシュのための生体内心電図では、その広大な解剖学的な違いにもかかわらず、ゼブラフィッシュと人間の心電図の間の顕著な類似性のために不可欠な電気表現型ツールです。ゼブラフィッシュの心臓は、2つの心房と2つの心室(上列、左右)を持つ人間の心臓とは対照的に、1つの心房と1つの心室しか持っていません。しかし、その明らかな解剖学的単純さにもかかわらず、ゼブラフィッシュの心臓は、人間の心臓といくつかの心電図の特徴を共有しています(下の行、左右それぞれ)ので、ゼブラフィッシュの心臓は人間の心臓の代理モデルとして出現しました。電気生理学 5,12,13.図1は、生きている健康な14ヶ月のゼブラフィッシュとは小さいが、異なるQ波を示しています。しかし、ゼブラフィッシュECGでは、鉛位置決めは一般的にQ波を実証するために最適化されていません。したがって、Q波は一般的に目に見えず、RS複合体はゼブラフィッシュECGの完全なQRS複合体よりも一般的に見られます。
図2は、成体ゼブラフィッシュの生体内心電図において最小限に侵襲的に行うための4つの重要な作用ステップをまとめたものである。麻酔誘導(ステップ1)および電極配置(ステップ2)に続いて、生後12~18ヶ月の健康な野生型ABゼブラフィッシュからのベースラインECG信号(ステップ3)を記録した(n=9)。私たちの電極挿入技術は、魚のスケールを剥がしたり、心膜切り取りを行う必要がなかったので、最小限の侵襲性しかありませんでした。データ取得後、ソフトウェア自動解析による誤解の可能性を回避するために、各ECG記録(ステップ4)を手動で確認・検証しました。
図3は、一般的なECGデータ集録および処理システムの3つの不可欠なコンポーネントを示しています:高性能データ集録ハードウェア、高利得差動増幅器、およびECGデータ用ソフトウェアでアップロードされたコンピュータ取得と分析。本研究室では、もともと小型哺乳類モデル(マウス、ラット、ウサギなど)向けに設計された生体内ECG記録システムの既存のコマーシャルを適応させ、成体ゼブラフィッシュモデルに対応しました。
図4は、適切なリードの配置が推定心臓の主軸にリード線を合わせる必要があることを示しています。生体内ECG記録におけるゼブラフィッシュでは、1つのリードのみが使用されるため、R波振幅とT波振幅の両方を同時に最大化するための適切なリード位置が重要である。R波振幅とT波振幅を最大化するために、正と負のリード電極を心臓の主軸に位置合わせし、おそらく左の方頭蓋の向きを左右に合わせました。胸部切開術および心膜切開に続いて心膜嚢を開き、心臓を露出させ、心臓の主軸が明らかになる(図4B白い破線)。実際、心臓を露出させる心膜切除術は、ECG記録を最小限に侵襲的な手順に変換するコストで信号対雑音比7を増加させる一般的に使用される戦略である。
図5は、ECG分析における重要なステップを示す。まず、ECG設定ダイアログボックス(図5A)を使用して、ソフトウェア自動解析の各種パラメータ設定を事前に定義しました。哺乳類モデル用に設計された既存のECG記録装置を再利用し、成虫ゼブラフィッシュに対応するため、ゼブラフィッシュの検出と分析設定は利用できません。代わりに、ゼブラフィッシュECGとヒト心電図の顕著な類似性を考えると、ヒトプリセットを選択した(図5A)。第二に、R波ピークのソフトウェア自動ECG識別(黒色)を手動で検証し、平均心室レートを再計算するソフトウェアを指揮する前に、R波自動識別ミスを修正(赤色)修正しました。例えば、図5Bでは、R波に関連する大きなP波がソフトウェアをだましてR波を誤認させ、その後RR間隔または心室速度の自動誤算を引き起こす。したがって、ECG分析では、必要に応じて人間の検証と適切な修正が重要です。第3に、リズムの規則性を迅速に評価し、平均ビュー(図5C)を使用して波と間隔の平均持続時間を計算し、複数の連続した心周期(緑)を1つの平均信号(黒)に連結しました。図5Cでは、9つの心周期と平均信号の間のわずかな偏差は、このゼブラフィッシュ心臓の優れたリズム規則性について論じている。最後に、利用可能な7つの異なる方法の1つであるBazettを使用して、心拍数のQT間隔を自動的に修正できるようにしました(図5D)。
図 6A-Cは、電極配置の深さが心電図信号の振幅にどのように影響するかを示しています。真皮に電極を表面的に挿入し過ぎると、鉛は「間接」のようなものでした(心臓からの2つ以上の心径、間接標準的なヒト心電図の四肢リードI、II、およびIIIと同様)と電圧信号は小さかった。電極を胸部筋に1mm深く適切に挿入すると(図6B)、鉛は「セミダイレクト」(近くでは心臓に直接接触しない)となり、電圧信号が増加した。心電図波形は容易に見えるようになった。しかし、電極を誤って心室(図6C)に挿入すると、鉛は「直接」(心臓に直接接触)となり、電圧信号はさらに増加しました。図6CのR波振幅は図6Aと比較して8倍、図6Bと比較して4倍増加した。しかし、図6Cの心電図トレースは、新しいSTうつ病や新しいT波反転などの心室心筋への損傷の新しい兆候を明らかにした。
図6Dは、すべてのECG波形(P、Q、R、S、およびT)の異常な反転が、正極と負極が入れ替わったリード反転ミスを示す方法を示す。定義上、Q と S は常に負ですが、R は常に正の値です。
図 6E-Fは、不適切な麻酔深さが生体内ECG記録の品質を損なう方法を示す。図6Eでは、不十分な麻酔(0.017%トリカイン)がゼブラフィッシュを完全に固定化できなかったことにつながった。結果として得られたモーションアーティファクトは、信号を汚染し(アスタリスク)、ノイズ(矢印)を増加させることによって、信号対雑音比を低下させた。対照的に、図6Fでは、過剰摂取麻酔(0.08%トリカイン)が重度の洞性徐脈不整脈およびSTセグメントおよびT波の変化を誘発した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig1.jpg"> 図1:ヒトとゼブラフィッシュの心臓の解剖学と心電図の対比。2つの心房と2つの心室を持つ人間の心臓とは対照的に、ゼブラフィッシュの心臓は1つの心房と1つの心室(上の列)しか持ち合わせていな。略語: RA, 右アトリウム;LA、左アトリウム;RV, 右心室;LV:左心室。ゼブラフィッシュの心臓は、人間の心臓(下の行)といくつかの一般的な心電図の特徴を共有しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig2.jpg"> 図2:生体内ECG記録プロトコルにおいて最小限に侵襲的である。概略フローチャートは、生体内ECGの尋問を行う上での4つの重要な作用ステップを示しています:麻酔を誘発し、ECGリード電極を配置し、ECGを記録し、ECG記録を分析します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig3.jpg"> 図 3:ECGデータ取得および処理システム。インビボECG記録システムの3つの主要コンポーネントには、データを取得するためのハードウェア、アンプ、データ取得と分析のためのコンピュータソフトウェアが含まれます。アンプには、3つのすぐに使用可能な29ゲージのステンレス鋼マイクロ電極が付属しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig4.jpg"> 図 4:心電図リード配置。3つの29ゲージの色分けされたステンレス鋼の電極は深さ約1mmの魚の筋肉にしっかりと挿入される。負(黒)電極と正(赤)電極の配置は、左の頭蓋骨に沿って、正面面に双極性リードを確立します。省略形: 参照電極<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig5.jpg"> 図 5: C心電図分析におけるリティカルステップ。(A) ソフトウェア自動解析のさまざまなパラメータ設定を事前に定義します。(B) 心房および心室速度のソフトウェア誤算を修正するために、P波とR波のソフトウェア(黒)による2つの自動誤認(赤)を手動で修正する。(C) 9つの連続した心周期(緑)を単一の平均信号(黒)に連結し、リズムの規則性/不規則性を迅速に評価し、波と間隔の平均持続時間を計算する。(D) Bazett などのさまざまな方法のいずれかを使用して、心拍数の QT 間隔を修正します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig6.jpg"> 図6:ECG信号に対する鉛配置および麻酔深度の影響生体内ECG記録の成功を決定する2つの最も重要なステップは、鉛配置(A-D)および麻酔深さ(E-F)である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig6large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、生きた麻酔を受けた成人ゼブラフィッシュの心電図を記録し、解釈するための、信頼性の高い、最小限に侵襲的で費用対効果の高い方法を提示する。

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

生体内電気カルディグラフィーは、断面および縦断研究における生きたゼブラフィッシュにおける電気的フェノタイピングのための唯一の診断ツールです。私たちのアプローチは、哺乳類のためのデータ取得システムを転用するため、実用的で侵襲性が低く、費用対効果が高いです。我々は、データ品質の早期検証のためのリアルタイム心電図解釈の戦略を強調する。ヒトとゼブラフィッシュのECGは類似しているため、生体内心電図は、ヒト心臓生理学のモデリングにおけるゼブラフィッシュの使用と、QT延長などの心毒性に対する高スループット薬物スクリーニングを容易にする。正しいリード位置決めが成功の鍵です。通常のゼブラフィッシュT波は最小であるため、より大きなP波とR波の振幅よりも振幅を最適化することを優先します。あなたのECGの所見を自分で解釈するために、正常および病理学的なECGパターンを研究してください。心電図解析ソフトウェアの自動解釈のみに依存しないでください。実験当日、ゼブラフィッシュを水族館から実験室に運ぶ。in vivo ECG記録システムを設定するには、必要な機器を接続し、ECGリードの3つの色分けされたステンレススチール電極をアンプの3つの色に一致したアクセスポータルに挿入します。レベル4麻酔の誘導については、機関の動物のケアと使用委員会によって承認された最も低い事前決定濃度で麻酔薬の溶液を含む皿に成体ゼブラフィッシュを浸します。ゼブラフィッシュが3秒間レベル4の麻酔を維持したら、鈍い鉗子のペアを使用して、3つの心電図電極の配置のために、スリット、腹側表面を上にして湿ったスポンジに魚をすぐに移します。オペルキュラムの2つの下端を結ぶ架空の線の上の球根動脈のレベルで腹側正極を腹側正中線にそっと挿入します。負極を片方に置き、正極に0.5~1ミリメートル離して、成体ゼブラフィッシュ心室の最大アピコ基底長より大きな距離に置き、肛門領域の近くに参照電極を重ね合わせ位置に置きます。ECG記録の場合は、システムを起動し、ECGデータ収集プログラムを開きます。範囲、ローパス、ハイパスのドロップダウンメニューから希望の設定を選択します。最大信号対雑音比のリード位置を最適化するには、[Stop]を押して記録を停止し、各心臓の最初の記録試行の直後にトレースを確認します。ECGが正常であると予想される場合、すべてのECG波形が明確かつ容易に見え、P波、ネットQRS複合体、およびT波がすべて正であることを確認してください。最も重要なステップは、信号対雑音比を最大化するためのリード位置決めです。各魚の最初のECG記録の試みの後に私たちの4つの検証基準を適用して、修正フィードバックを得てください。正常なECGが予想される場合は、これら4つの検証基準がすべて満たされるまで、必要に応じて電極を再配置します。通常のT波が予想されるが、T波が小さすぎる場合は、T波振幅を最大化するように電極を再配置する。リード位置を最適化した後、ECG記録を再開し、その後の解析のためにECGスイープを保存します。ECG記録セッションの終わりに、魚を傷つけずに電極を慎重に取り外します。生存研究では、トリケーヌを含まない新鮮な酸素化された魚に魚を移す。このビデオでは、麻酔からの魚の回復の読者の閲覧を容易にするために、酸素化は中止されることに注意してください。サバイバル研究で麻酔から回復を容易にするために、パスツールピペットを使用して、魚が定期的なギルの動きや水泳を再開するまでエラの上に水を激しく噴出し、魚を水族館に戻す前に麻酔から完全に回復するために魚を監視します。魚は、少なくとも5秒間直立して泳ぐことができると、麻酔から完全に回復したとみなされます。分析設定を定義するには、ECG データ分析プログラムを開き、対象の ECG ファイルを開いて、完全な ECG トレースを表示します。マウスを使用して、ECG トレース内の関心のあるセクションをドラッグして分析します。ECG 分析メニューから、ECG 設定を選択してダイアログボックスを開き、ソフトウェア自動分析のさまざまなパラメータ設定を事前定義します。心臓のリズムと速度を分析し、心臓のリズムが正則か不規則か、正しいかどうかを判断します。心房と心室の速度はPPとRRの間隔に基づいているので、心拍数を決定するために、ソフトウェアがすべてのP波とR波を正しく識別することを確認してください。誤ったカーソルを適切な P および R 波に移動して、自動識別の間違いを修正します。間隔と波の持続時間を計算するには、ECG分析と平均化ビューを開き、複数の連続した心臓周期を単一の平均信号に連結します。ソフトウェアが P 波、QRS コンプレックス、T 波の開始と終了を正しく識別し、誤ったカーソルを適切な位置に移動して、自動識別ミスを修正します。ECG 測定値をエクスポートするには、[テーブル ビュー]を選択してすべての ECG 測定値を確認し、その後の分析のために目的の測定値をスプレッドシートにコピーして貼り付けます。ECG トレースをエクスポートするには、拡大鏡を使用して、ECG スイープの対象のセクションを強調表示し、目的のドキュメントにスイープをコピーして貼り付けます。2つの心房と2つの心室を持つ人間の心臓に収縮すると、ゼブラフィッシュの心臓には1つの心房と1つの心室しかありません。その明らかな解剖学的なシンプルさにもかかわらず、ゼブラフィッシュの心臓は人間の心臓といくつかの心電図の特徴を共有する。適切な鉛配置は、推定心臓主軸にリードを合わせる必要があります。電極が真皮にあまりにも表面的に挿入されると、鉛は間接的に似ており、電圧信号は小さいと考えられます。電極を適切な1ミリの深さに挿入すると、リードは半ダイレクトになり、電圧信号は増加します。しかし、電極を心室に1ミリメートルより深く挿入すると、リードが直接になり、電圧信号がさらに増加し、電極が適切な深さで挿入されたときと比較してR波の振幅がさらに4倍に増加します。あまりにも深く挿入された電極からの心電図の痕跡はまた、新しいSTうつ病および新しいT波反転のような心室心筋への傷害の新しい徴候を明らかにする。正極と負極が配置に切り替えられると、全てのECG波形の異常な反転が観察される。不適切なレベルの沈下深は、in vivo ECG記録の品質を損なうこともできる。魚を殺さずに固定するのに十分深く麻酔することを忘れないでください。信号対雑音比を最大化し、自動ソフトウェア解析への過度の依存を避けるために、電極を配置します。この低侵襲生存手順に従って、薬物応答または縦断研究における部分的な切除、心臓の切除、または連続心電図調査などの他の手順を行うことが可能である。全身毒性は、トリカインを含む麻酔薬の潜在的な合併症である。これらの毒性は、個々の薬剤の用量を下げるために複数の麻酔薬の相乗効果を利用することによって減少させることができる。

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Research

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