Name: 電子顕微鏡検査用胚、卵殻、真菌培養の処理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶ走査型電子顕微鏡による亀胚、卵殻、真菌培養の標準化された試料調製プロトコル。HMDS化学乾燥、空気乾燥、臨界点乾燥を用いて繊細な組織構造を保存し、構造と人工産物を区別する方法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者たちは、原稿に関する有益な議論とコメントのために、ダニエル・バルダッサール博士、SUNY Oswego博士に感謝したいと思います。この研究はライスクリークアソシエイトグラント、オスウィーゴによってサポートされました。チャレンジは、SunYオスウィーゴと国立科学財団(NSF)PGLとJGに小額助成金を付与します。

注:この研究で使用されるペイントカメ(クリーセミースピクタ)卵は、ニューヨーク州環境省の許可を得て、ライスクリークフィールドステーション、オズウィーゴニューヨークから2015-6月のネスティングシーズン中に収集されました保全(DEC)。
1. SEM用胚を処理する化学乾燥法
<ol><li>ネストシーズン中にフィールドサイトからカメの卵を収集します。蓋付きプラスチック製の箱(L x W x H)6.7cm x 25.4 cm x 10.2 cmで作られたインキュベーション室を事前に準備し、バーミキュライトと泥炭苔(1:1比)の湿った混合物で調製した寝具媒体で満たされています。箱の側面に沿って約0.25センチメートルの4-6穴を作り、通気を可能にするために蓋に。</li>
	<li>卵を明らかにするために巣から穏やかに土壌を削除します。希釈ヨウ素チンキ(1:25,000)でカメの卵の表面を拭き取り、インキュベーション中の微生物汚染を制御します。お互いに別々にクラッチを配置し、塗装されたカメのクラッチサイズは5〜9卵から異なる場合があり、箱ごとに最大8〜9個の卵を置きます。 注:収集、拭き取り、ラベル付け、箱内への配置中に卵を慎重に取り扱ってください。卵の位置と位置合わせは、彼らが置かれたのと同じである必要があり、任意の動きは胚の発達を阻害します。</li>
	<li>手動で卵の半分を寝具に埋め、カバーし、30°Cに設定されたインキュベーター内に箱を置きます。卵を10〜17日間インキュベートし、この研究でそれぞれ使用される胚期12、13、および18を得る。脱水を避け、胚の正常な発達のための水分レベルを維持するために、1日おきに寝具媒体を部分的に濡らすために蒸留水を追加します。 注:インキュベーションおよびステージング胚は、以前に発表された完全な発達表に従っている39.</li>
	<li>先の尖ったはさみを使って、後卵殻と黄身膜の片側を一緒に、長い軸に垂直に切り取って、胚を固定します。胚性ディスクを切断しないように、はさみを慎重に卵黄に挿入します。今、長い軸に沿って卵の側面をカットし、短い軸に沿って卵の反対側をカットします。</li>
	<li>鉗子を使用して胚側を上に切り取った部分を開きます。卵殻のもう一方の側面を切り取り、切除した部分をリン酸緩衝生理食(PBSは7.4のpHで)に置きます。 注:カメの卵は、非常に粘性の卵黄で満たされ、胚の後部側は卵殻膜に付着します。胚の近くの卵殻膜は、半透明の白から不透明なチョーク状の白へのインキュベーションに伴って変化する。これにより、長い軸の中心に胚を見つけ、外側40、41から暗い石灰化スポットとして見ることができます。</li>
	<li>立体顕微鏡を使用して、鉗子を使用して卵殻から胚を剥離することにより、卵膜と一緒に胚を分離します。鉗子とマイクロハサミを使用して胚外膜を取り除きます。胚スプーンを使って胚をペトリ皿の新鮮なPBSに移し、血液や黄身を洗浄する。</li>
	<li>明確な12ウェルプレートを使用して、4°CでPBSまたはPBSで2-3%グルタルアルデヒドで4%パラホルムアルデヒドで一晩胚を固定します。胚の大きさに応じて、各ウェルに1~3個の胚を配置します。2~3日間の固定時間を延長することにより、古い胚の完全な浸潤(サンプルは白く見える)を確認してください。胚を3倍にすすいで、新鮮なPBSで5分間すすいで下します。 注:12ウェルプレート用のポリエステルメッシュボトムを備えたポリスチレンインサートを使用して、1つの溶媒から別の溶媒に標本を移すことによって、胚の表面を損傷しないようにしてください。</li>
	<li>蒸留水中の一連のエタノール濃度を用いてサンプルを脱水:30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%、各脱水液で1時間のサンプルを処理します。完全な脱水を確実にするために、100%エタノールでステップを2回繰り返します。直ちに使用しない場合は、検体を-20°Cで70%エタノールで長期間保存してください。</li>
	<li>一連のヘキサメチルジラザナ(HMDS)を用いた乾燥胚(HMDS)から100%エタノール濃度:1:2、2:1および100%。各溶液のサンプルを20分間放置し、プロセス中にペトリ皿を部分的に覆ったままにしておきます。 注:HMDSは非常に有毒であるとして必要な個人的な保護装置とヒュームフードにHMDSを含むすべてのステップを実行します。</li>
	<li>最終的な100%HMDS溶液中の胚を完全または部分的にHMDSの蒸発を助けるヒュームフードで完全または部分的に覆われたままにし、サンプルを取り付け、スパッタコーティングの準備を残します。皿を覆い、サンプルの上にほこりが落ち着くのを防ぎます。 注:組織は完全な乾燥後に白く表示され、部分的に乾燥したサンプルは、より長い時間のためにヒュームフードにこれらの組織を残し、色で黄色に見えます。</li>
	<li>分析したサンプルのサイズごとにアルミニウムスタブとカーボン粘着テープのサイズを選択します。ダブルスティックカーボン導電テープ(12mm)を使用して、標準的なアルミピンスタブ(12.7 mm x 8 mm)に乾燥したサンプルを慎重に取り付けます。</li>
	<li>スパッタコーターのチャンバーに取り付けられたサンプルを導入し、電荷効果を排除するために、金の非常に薄いフィルムで標本をコーティングします。金板は35 mAスパッタで60〜120sの試料を出す。</li>
	<li>セットの組み立てをしっかりと固定して、対応する細孔プレートにスタブを取り付けます。サンプル交換ツールを使用して、サンプルホルダーをSEMのサンプルチャンバに出入りします。10 kVの加速ビーム電圧と発光電流10μAで高真空モードでサンプルを画像化します。 注:サンプル、サンプルホルダー、取り付けスタブ、および転送ツールを取り扱う場合は、必ず手袋を着用し、手からSEMシステムへのグリース汚染を避けてください。</li>
	<li>以下に示す代替技術を試験して、上記の手順から得られた試料の分解能を比較する。<ol>
<li>ステップ1.7の後に室温で1時間の1%の四酸化オスミウムを持つ後固定を含める。</li>
		<li>HMDSの急速な蒸発のためにステップ1.10でHMDSを部分的または完全に取り外します。</li>
		<li>ステップ3.3-3.4に従って、クリティカルポイント乾燥(CPD)を使用してステップ1.8後に胚を処理します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 空気乾燥法を用いたSEM用卵殻の準備
<ol><li>手順1.1-1.7で指定されているように胚を固定するために、塗装されたカメ(クリーセミースピクタ)の卵を収集し、インキュベートします。</li>
	<li>ステップ2.1の胚の固定後に蒸留水で卵殻を保存します。卵殻を少なくとも1時間蒸留水に浸して卵殻を完全にきれいにし、黄身とアルブミンの汚染を排除します。</li>
	<li>一晩ヒュームフードで繊細な帯電防止ワイプで洗浄した後の空気乾燥卵殻。乾燥した卵殻は、数とステージでラベル付けされたきれいな標本ボトルに保管してください。</li>
	<li>ステップ1.11-1.13で指定されたステップに従って標本をマウントし、スパッタコートおよびイメージします。</li>
</ol>3. SEM用真菌培養物を準備するための重要な点乾燥方法
<ol><li>スライド カルチャの確立<ol>
<li>真菌培養のためのジャガイモデキストロース寒天(PDA)培地を準備する:エルレンマイヤーフラスコで蒸留水の1LにPDA電力の39グラムを追加します。フラスコをよく混ぜて、メディアを121°Cで30分間オートクレーブし、培地液を冷却し、無菌マイクロピペットを使用して抗生物質クロラムフェニコール(25μg/mL)を加えます。 注:殺菌後、寒天溶液は熱くする必要があり、すぐに固化しません。抗生物質が不活性化しないように十分に冷却してください。</li>
		<li>それを旋回して混ぜ、プレート(10cmペトリ皿ごとに約10〜12mLのメディア)を注ぎ、慎重に積み重ねて固めさせます。</li>
		<li>無菌のメスブレードを使用して、1インチの約1/2から3/4の寒天の小さなブロックを切り取ります。寒天ブロックを取り外し、きれいなガラス顕微鏡スライドの上に置きます。</li>
		<li>汚れを防ぎ、インキュベーション中の水分を保つために、スライドをきれいなペトリ皿に入れます。</li>
		<li>無菌のつまようじを使用してペトリ皿の底からスライドを上げ、プレートとスライドの間に表面張力を作成し、インキュベーション後の繊細な成長を妨げることなくガラススライドを取り除きます。</li>
		<li>滅菌ループまたは針を使用して、試料の接種からスライド上の寒天ブロックの4つの側面のそれぞれに真菌の一部を移します。</li>
		<li>接種後の寒天ブロックの表面にきれいなカバースリップを置きます。成長する真菌のための水分を確保するために、スライドの周りのペトリ皿に滅菌蒸留水の数滴を追加します。</li>
		<li>パラフィンフィルムを使用してプレートを部分的にシールし、適切な時間の長さのために30°Cでプレートをインキュベートします(フザリウム種のインキュベートの場合は36〜48時間)。</li>
		<li>ペトリ皿からスライドを取り外し、無菌鉗子を使用して寒天ブロックからしっかりと付着したカバースリップを分離します。4°Cで一晩PBSで3%グルタルアルデヒドで寒天ブロックを固定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>エタノールシリーズを通過してサンプルを脱水する:10%、25%、50%、75%および90%、変化あたり15分。完全な飽和を確保するために、それぞれ30分間続く100%エタノールの2つの変化で最終的な脱水のためのサンプルを処理します。</li>
	<li>臨界点乾燥:CPD装置のチャンバに脱水サンプルを配置します。液体CO2が完全にチャンバーを満たすまで、液体CO2を可能にし、エタノールを排出できるようにバルブを開けてチャンバをシールして冷却します。<ol>
<li>チャンバ圧力が1000psiを超え、温度が31°Cを超えると、CO2の液体および気体相が平衡状態にある場合、チャンバをゆっくりとシールして加熱します。表面張力の影響を避けるために、チャンバとサンプルからCO2をガスとしてゆっくりと排出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ1.11-1.13で指定された手順に従って、試料の取り付け、金めっき、およびイメージングを実行します。</li>
	<li>ステップ1.9-1.13に従ってHMDSを用いてステップ3.2から試料を化学的に乾燥して比較分析を行います。</li>
</ol>

著者は開示するものが何もない

我々の研究では、異なる固定剤、脱水および乾燥方法を試験し、胚、卵殻、真菌培養物の3つの異なる繊細な生物学的サンプルを調べた。SEM は一般的にサーフェス解析に使用されるので、固定浸透はあまり関係ありませんが、固定性の低い内部構造は内側の縮小や崩壊の表面構造を引き起こすことを理解する必要があります。延長された固定時間はまた、固定期間に応じて数回固定溶液を置き換え、より大きな組織サンプルのために考慮されるべきである。固定性と組織との間の活発な相互作用のために、細胞の浸透特性は大幅に変化します。組織液は固定性を希釈し、したがって、全体的な浸透性に寄与するアルデヒド効果は、細胞量に及ぼす影響に関する限り無視することができる。また、ホルムアルデヒドは組織に速く浸透し、グルタルアルデヒドと比較してクロスリンカーとしてより効果的です。バッファーホルムアルデヒド-グルタルアルデヒド混合物は、多種多様な組織を固定するために報告されたが、単層および細胞懸濁液の希釈液は15、16を固定するのにより適していた。しかし、希釈された溶液も高張性であ...

走査型電子顕微鏡(SEM)超構造解析および細胞内イメージングサプリメントは、原核生物、植物、動物の3次元プロファイリングのための光顕微鏡を補完する。SEMの高い空間分解能は、ナノメートルからマイクロメートルスケールの標本の微細構造特性の検査に利用できる最も汎用性の高い強力な技術の1つになります。乾燥した標本は、機能的関係1、2、3に関する有効な結論を開発するための基礎を提供する強烈な詳細を持つ組成および地形構造に解決される,4,5,6,7,8,9.生物標本のSEM画像を解釈する場合、処理中に作成された天然構造とアーティファクトを区別することは大きな課題です。SEMは、一般に、試料10、11から放出される一次、二次または逆散乱電子ビームに影響を与えるガス分子からの干渉を避けるために、非常に高い真空で作動する。また、生物材料は、その不十分または非伝導性による放射線損傷の影響を受けやすい。SEMに積み込まれた試料は、完全に乾燥し、任意の有機汚染物質を含まないことが不可欠です10,11.生物標本は主に水で構成されているので、ネイティブ構造が保持されるように追加の準備技術が必要です。
得られる分解能は、利用される試料の種類および器械の変数に特有の調製方法を最適化することに基づいている。したがって、すべての組織タイプに対して一般化された処理ステップを使用することを避ける必要がある。一部の生物標本は、構造を維持するためにより厳格な処理を必要とし、収縮や崩壊などの乾燥アーティファクトの導入を避けるために、繊細な種類のサンプルにはより多くの時間と注意が必要になる場合があります。サンプル調製は、SEMイメージングにおける重要なステップです。形態学的研究の所見は、検体調製手順12,13によって著しく影響を受ける。多くの生物学的サンプルの一般的な調製工程は、表面をSEM分析用に導電性に変換するために、金、白金、パラジウムなどの金属を用いて固定、脱水、コーティングを行います。使用されるステップの性質と組み合わせは、組織の種類、および研究の具体的な目標によって異なります。電荷の蓄積、真空および電子ビーム損傷に対する感度は、柔らかい繊細な生物学的サンプルを処理する際に問題を引き起こす、物体のネイティブ構造を保持するために追加の処理ステップを必要とする。四酸化オスミウム固定などの従来の方法を使用して、脱水は収縮および繊細な組織の崩壊を引き起こす14,15,16,17.この研究の目的は、以前の研究からのアイデアと、柔らかい繊細な組織(爬虫類の胚、塗装されたカメの卵殻、真菌培養物)を準備し、画像化するための修正と組み合わせることによって導き出されたエレガントな方法論を確立することです。
適切な固定方法の選択は、生物標本の顕微鏡分析のための最初の最も重要なステップです。分解による形態の変化を防ぐためには、生物から分離した直後に組織を固定することが不可欠です。効果的な固定剤は、細胞を迅速に浸透させ、その後の処理ステップとSEM17の下での検査の両方に耐えるためにサンプルの構造を安定させるために不可逆的に効果を維持することによって細胞プロセスを終了する必要があります,18.いくつかの化学的および物理的な固定方法が知られているが、化学的固定は、自己解動、腐敗、および乾燥効果による細胞変化を避けるために、生物標本のためにより一般的に使用される。文献17、19、20、21、22、23、変性によって働く固定剤で議論される多数の固定化学製剤があり、生体高分子を凝固させ、高分子を共生して固定するもの。アルコールは、超構造を非常に不十分に保存する変性固定剤として使用され、主に光顕微鏡検査に使用され、電子顕微鏡分析には推奨されません。ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムなどの架橋固定剤は、組織内の高分子間に分子間および分子内架橋を作成し、超構造の優れた保存を提供する11 ,24,25,26.生物学的サンプルは温度に敏感です。固定の開始時の温度は、膜タンパク質の横移動性を低下させ、細胞間分子の拡散を遅くし、固定11の速度を遅くするために4°Cであることが推奨される。組織の固定に必要な時間は、サンプルのサイズと固定性が拡散し、試料の成分と反応する速度に大きく依存します。4°CでPBSで4%パラホルムアルデヒドまたは3%グルタルアルデヒドの一晩固定は、より小さな繊細なサンプルを処理することを可能にする順次浸透特性のために本研究で使用される標本のSEM分析のための好ましい方法です17,18歳,19歳,20歳,27.四酸化オスミウムとのポスト固定ステップは、その有毒性のためだけでなく、この研究で分析されたサンプルの画質を向上させる追加の利点を実装しないことが判明しました。
生物学的サンプルには、SEM操作を妨げる流体が含まれています。したがって、サンプルは、SEMサンプルチャンバに挿入する前に乾燥する必要があります。脱水が確実に行われるようになると、表面張力/乾燥のために試料にアーティファクトを作り出さずに溶媒を組織から除去する必要があります。SEMイメージングの処理組織の間に3つの異なる乾燥方法が一般的に使用されました:空気乾燥、臨界点乾燥、および凍結乾燥サンプル28、29、30、31。いくつかの研究は、動物組織サンプル28、29、30、31と同じ結果を生成するすべての3つの乾燥方法を報告します。より小さい標本に用いられる一般的な慣行は、アルコールおよびヘキサメチルジラザン(HMDS)の濃度シリーズを上昇させることによって化学的脱水であるが、より大きい標本は臨界点乾燥(CPD)器械32を使用して乾燥される。乾燥プロセス中に、液体/ガス界面によって試料を通過する小さな空洞で形成されるかなりの力;これは、中空構造33の完全な崩壊につながる可能性さえあります.処理によって発生する変形は、その後、試料のネイティブ構造特徴と誤解される可能性があります。したがって、処理のための一般化された現象を排除し、特に繊細な組織標本を分析する場合は、組織の種類ごとに独自の乾燥プロセスを標準化する必要があります。
上記のすべてのプロセスの様々な組み合わせを用いて行われたいくつかの試験では、爬虫類胚、塗装カメの卵殻、真菌培養の3つの繊細な組織のSEM分析に使用できる方法を標準化しました。発達生物学者と形態学者は、代表的な脊椎動物における胚発生時の正常および異常な形態形成について説明する。遺伝子シグナル伝達経路の調査は、新しい構造の形態学的記述に依存する。SEM解析中に脊椎動物の胚構造が急激に変化するのを防ぐために、脱水後の化学乾燥をお勧めします。HMDSを使用した化学乾燥は比較的新しい乾燥方法であり、相対的な速さ、使いやすさ、コストの損失、および必要な限られた専門知識と機器が含まれます9。CPDは、特定の温度および圧力で試料全体に通過CO2を使用して一般的に使用される乾燥技術です。我々は、HMDSが柔らかい繊細な組織を乾燥するのに適しており、胚組織に広範な変形を引き起こした臨界点乾燥と比較して、より大きなサンプルを処理することを可能にすることを同定した。真菌34の形態学的特性を研究するためにSEMイメージングのためのサンプルを調造するためにいくつかの方法が使用されている。真菌標本は一般的に四酸化オスミウムで固定され、エタノール脱水と臨界点乾燥が続き、満足のいく結果をもたらす可能性があるが、四酸化オスミウム6、7、35の毒性作用は満足のいく結果をもたらす可能性がある。処理中に溶液を変更しながら真菌材料を失うことは顕著な欠点です。固定せずに空気乾燥を用いた試料調製技術も36回実施されていますが、構造の縮小や崩壊が起き、種を特徴付けながら、このような試料の観察が誤解されやすい。真菌性ハイファは液体と接触してその完全性を失い、さらに乾燥は構造を復元するために達成されない場合があります。この効果のために、凍結乾燥は、真菌菌糸体のような軟部組織を乾燥させるために一般的に使用されます。凍結乾燥はきれいな材料のためにうまく機能しますが、塩や分泌物の存在は、SEMの視聴段階でのみ識別される表面の詳細を不明瞭にします。スライド培養法をグルタルアルデヒド固定と臨界点乾燥と結合し、無傷の真菌性菌性菌および胞子の構造的詳細を得た。CPD乾燥は胚の収縮を引き起こしたが、グルタルアルデヒド固定と相まって、よく保存された菌構造をもたらした。卵殻は、保護カバーとして機能するだけでなく、機械的安定性、ガスと水への透過性、および発達する胚のためのカルシウム予備を提供することによって、卵性動物の胚にとって最も重要です。淡水カメの卵殻は、その構造に基づいて「硬質」に分類され、その利用可能性のために生物学者1、2、3、4から大きな注目を集めています。,5,6,7,37歳,38.
私たちは、任意の硬質卵殻種に適用することができる塗装カメの卵殻と殻膜の簡単な検査のための簡単な方法を詳述します。作成方法は、結果として得られる画質と潜在的なアーティファクトの減少に基づいて評価されました。

<table><tbody><tr><td>スライド培養用</td><td>寒天</td><td>フィッシャー科学</td><td>S25127A</td></tr><tr><td>アルミピンスタブ</td><td>Tedpella</td><td>16111</td><td>12.7 mm x 8 mm</td></tr><tr><td>BD Difco 脱水培養培地:ジャガイモ デキストロース 寒天</td><td>BD 213400</td><td>DF0013-17-6</td><td>菌類、酵母、カビの単離および培養用培地</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP904-100</td><td>培地用抗生物質</td></tr><tr><td>粗いバーミキュライト</td><td>温室メガストア</td><td>SO-VER-12</td><td>寝具媒体</td></tr><tr><td>クリア12ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>07-201-589</td><td>胚固定用</td></tr><tr><td>カバースリップフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>スS17525B</td><td>スライド培養用</td></tr><tr><td>クリティカルポイントドライヤー</td><td>クォーラムCPD</td><td>EMS850</td><td>クリティカルポイント乾燥</td></tr><tr><td>培養皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ック08 747B</td><td>DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A406P 4</td><td>脱水剤</td></tr><tr><td>鉗子 - 水瓶座ピンセット</td><td>テドペラ</td><td>5804</td><td>スタイル 4、長さ 108mm、幅 x 厚さ 0.017 x 0.17 mm</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>フィッシャー サイエンティフィッシュ サイエンティ</td>フィック <td>G151-1</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>スパッタコーター用ゴールド ターゲット</td><td>デントン バキューム</td><td>TAR001-0158</td><td>ゴールドターゲット、2.375&プライム;D X .002&プライム;</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazana</td><td>Fischer Scientific</td><td>C19479-5000</td><td>化学乾燥剤</td></tr><tr><td>キム ワイプ</td><td>Kimtech</td><td>S-8115</td><td>クリーニング</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>67-762-16</td><td>スライド培養用</td></tr><tr><td>顕微鏡検査用 はさみ</td><td>Tedpella</td><td>1327</td><td>ダブルポインテッド、ステンレス鋼、100 mm L (3-5/8")</td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>テドペラ</td><td>1346</td><td>バンナス型、ストレート、80mm L</td></tr><tr><td>モリア 穴あき胚スプーン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10370-17</td><td>長さ 14.5 cm、先端直径 20 mm、スプーン深さ 5 mm</td></tr><tr><td>ネットウェル インサート</td><td>コーニング</td><td>0330B09</td><td>15 mm インサート 74 & マイクロ;mメッシュサイズポリエステル膜は、試料処理中に便利なキャリアとして機能します</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T353 500</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>ピートモス</td><td>ウォルマート-ミラクルグロ</td><td>551705263</td><td>寝具媒体</td></tr><tr><td>PELCOタブ ダブルスティックカーボン導電性テープ</td><td>Tedpella</td><td>5000</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>ODスパッタコーター</td><td>デントン真空</td><td>デスクV</td><td>薄い金属コーティング</td></tr>、<tr><td>SEM</td><td>、JEOL、USA、</td><td>JEOL、JSM、6610LV、走査型、電子スコープ</td><td>、電子顕微鏡</td></tr></tbody></table>

電子顕微鏡検査用胚、卵殻、真菌培養の処理

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

走査型電子顕微鏡(SEM)は、様々な生物学的および非生物学的サンプルの超構造解析に広く使用されていますが、異なる生物学的サンプルの処理に関与する方法には独自の手法が含まれます。サンプルを処理するための文献に記載されているすべての従来の慣行は、まだ有用なアプリケーションを見つけるが、サンプル準備の微妙な変更は、画像の品質を変更することができますだけでなく、アーティファクトを導入します。したがって、分析された組織の種類に特有のユニークなサンプル調製技術を使用して、超構造分解能を持つ良好な品質の画像を得るために必要とされる。本研究の焦点は、SEMを用いて胚、硬質卵殻、真菌培養物をイメージングするための最適なサンプル調製プロトコルを提供することにある。以下の最適化は、研究された3つの異なる繊細な生物学的サンプルに対して良好な結果を得るために推奨された。4%パラホルムアルデヒドまたは3%グルタルアルデヒドのような穏やかな固定剤の使用に続いて、エタノールシリーズで脱水が必須です。スライド培養物によって得られた寒天ブロック上の真菌菌糸体は、寒天プレートから直接採取された培養物と比較して、より優れた超構造性を生み出します。HMDSを使用した胚の化学乾燥は、臨界点乾燥と比較して表面張力アーティファクトを導入することなく乾燥を提供します。HMDSは、サンプルが乾燥中に脆くならないため、収縮によるひび割れを防ぎます。しかし、真菌培養の場合、クリティカルポイント乾燥は化学乾燥に比べて許容可能な画質を提供します。卵殻は取付け前に徹底的な洗浄および空気乾燥を除いて特別な準備ステップなしでイメージすることができる。調製方法論は、各試験で得られた許容可能な画質に基づいて標準化された。

図1は、塗装されたカメ(クリーセミースピクタ)胚の走査電子微量解析を示す。塗装されたカメの卵を寝具媒体上に集め、インキュベートし、化学乾燥後のアルミニウムスタブに取り付け、SEMイメージングに用いた(図1A-E)。ステージ12胚の横図は頭蓋骨の構造を示す;上顎の顕著さは顎骨を越えて広がり、よく印が付いている鼻のピットを媒的に制限する;5つの咽頭アーチも観察された(図1F)。胚の後尾領域で新たに形成されたソミテは、セグメント化された体のソミトと比較して容易にカウント可能である。前肢の芽は、後肢の芽に比べて長く見え、心室よりもより大胆にポイントします。カラペース尾根の明確に定義された成長は、ステージ15胚の四肢間側部領域全体に沿って見られる(図1G.ステージ18では、塗装されたカメは短く...

ここでは、走査電子顕微鏡(SEM)を用いて繊細な組織サンプルをイメージングするための詳細な処理プロトコルを紹介する。すなわち、ヘキサメチル・ジシラザナ(HMDS)化学乾燥、単純な空気乾燥、および臨界点乾燥の3つの異なる処理方法が、硬質卵殻、初期発達段階における胚、および真菌培養物をそれぞれ調製するために記載されている。

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

走査型電子顕微鏡を用いて、カメの胚、硬質卵殻、真菌培養物をイメージングするためのサンプル調製プロトコルを標準化しています。これらの包括的な方法は、既知のプロトコルへの微妙な変更を使用して、3つの繊細な組織を処理し、元の構造とアーティファクトの処理を可能にします。私と一緒に手順を実証することは、私の研究室の大学院生ジェシカ・ギボンズです。巣の季節にフィールドサイトからカメの卵を収集する前に、プラスチックボックスの側面に沿って、そして彼らの蓋に4〜6つの0.25センチメートルの穴を作り、気を出るようにします。バーミチュライトと泥炭苔の寝具の混合物の湿った混合物を1対1の比率で箱に充填する前に。巣の場所で、卵を明らかにするために土壌を静かに取り除き、各カメの卵の表面を希釈したヨウ素チンキで拭き取り、インキュベーション中の微生物汚染から保護します。1箱あたり最大8~9個の卵を、産んだのと同じ方向とアライメントに置き、個々のクラッチを互いに分離します。すべての卵が採取されたら、手動で卵を半分の寝具に埋め、蓋付き箱を30°Cインキュベーター内に10〜17日間置き、それぞれ胚性の段階12、13、18個の胚を得る。脱水を避けるために、一日おきに寝具媒体を部分的に濡らし、正常な胚発生のための水分レベルを維持するために蒸留水を加えます。開発の適切な段階で、尖ったはさみを使用して、卵の長い軸に垂直な、一緒に後部卵殻と黄身膜の片側にカットを行います。次に、短い軸に沿って卵の反対側を切断し、鉗子を使用して、胚側を上に切除した切除片を剥離する。卵殻のもう一方の側側を切り、切除した殻をPBSに入れます。実体顕微鏡と鉗子を用いて、卵殻から胚と黄身の膜を剥がす。鉗子とマイクロハサミを使用して余分な胚膜を取り除き、胚スプーンを使用して胚を新鮮なPBSのペトリ皿に移します。血液と黄身を洗い流した後、12ウェルプレートのウェルあたり最大3つの胚を置き、摂氏4度で4%パラホルムアルデヒドを2〜3日間含む。サンプルが白く見える場合は、ポリエステルメッシュボトム付きのポリスチレンインサートを使用して、洗浄ごとに新鮮なPBSで3回の5分間の洗浄で胚を洗い流します。最後の洗浄後、上昇エタノール系列で1濃度で1時間脱水します。2番目のエタノール浸漬後、一連のHMDSで胚を乾燥させて、部分的に覆われたペトリ皿で浸漬ごとに20分間エタノール濃度を行う。その後、胚を最後の100%HMDS溶液に入れ、一晩ヒュームフードで完全または部分的に覆う。エタノールに対するHDMSの濃度を徐々に増加させることによる遅い乾燥は、胚における優れた表面構造を明らかにするために重要である。翌朝、ダブルスティックカーボン導電テープを使用して、完全に乾燥したサンプルを標準的なアルミニウムピンスタブに慎重に取り付けます。すべてのサンプルが取り付けられているとき、35ミリアンペアスパッタで60〜120秒間金の非常に薄いフィルムで標本をコーティングするためにスパッタコーターチャンバーにサンプルを導入します。次に、セットねじをしっかりと固定して、対応する注ぎプレートにスタブを取り付けます。サンプル交換ツールを使用して、サンプルホルダーを走査型電子顕微鏡のサンプルチャンバーに移してイメージングします。走査型電子顕微鏡用の卵殻を準備するには、卵殻を胚の収穫後少なくとも1時間蒸留水に入れて、卵黄またはアルブミン汚染を除去する。次に、空気は一晩煙のフードで繊細な静電気防止ワイプで洗浄された卵殻を乾燥させます。乾燥した卵殻を清潔な標本ボトルに保管し、数と胚の段階でラベル付けします。その後、取り付け、スパッタコート、胚のためにちょうど実証したように卵殻標本を画像化します。滑り物の真菌培養を確立するには、無菌メスを使用して、固体ジャガイモデキストロース寒天の半分から4分の3インチのブロックをカットし、個々のガラス顕微鏡スライドにブロックを置きます。きれいなペトリ皿の底に滅菌爪楊枝を置き、プレートとスライドの間に表面張力を作り出すためにスライドを上げます。ペトリ皿のつまようじに各スライドを置きます。次に、滅菌ループを使用して、試料接種から寒天ブロックの4つの側面のそれぞれに真菌を移す。成長する真菌の水分を確保するために、スライドの周りのペトリ皿に滅菌蒸留水の数滴を追加します。パラフィンフィルムでプレートを部分的に密封し、真菌種に適したインキュベーション期間のために30°Cインキュベーターにプレートを置きます。インキュベーションの最後に、ペトリ皿からスライドを取り出し、滅菌鉗子を使用して、しっかりと接着した寒天ブロックをスライドから3%グルタルアルデヒドの容器に移し、摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、サンプルを上昇エタノール系列で15分間脱水する。90%浸漬後、100%エタノールに2つの30分の変化を伴う最終脱水用サンプルを処理し、脱水サンプルを臨界点乾燥装置のチャンバーに入れる前に完全な飽和を確保する。チャンバーを密封し、バルブを開けて液体二酸化炭素を通気させ、液体二酸化炭素がチャンバーを完全に満たすまでエタノールを通気させます。次に、チャンバー圧が1平方インチ当たり1,000ポンドの圧力を超え、温度が摂氏31度を超え、二酸化炭素の液体および気体空間が平衡状態にあるときに、チャンバを密閉し、臨界点を達成するためにチャンバをゆっくりと加熱する。次に、チャンバーと試料からガスとして二酸化炭素をゆっくりと排出し、試料に対する表面張力の影響を避け、試験的に真菌標本を取り付け、プレート、および画像化する。ステージ12に塗られたカメの胚の横方向走査電子顕微鏡写真図は、上顎の目立ちが下顎管を越えてどのように広がり、内側がよくマークされた鼻穴を制限するかを明らかにする。5つの咽頭のアーチも観察することができる。ステージ15胚では、新たに形成されたスマイトは胚の後尾部領域で見ることができ、前肢の芽は腹側よりも皮質的に指す。カラパス尾根の明確に定義された成長は、胚の四肢間側面領域全体に沿って視覚化することもできる。ステージ18では、上部くちばしの中央ノッチに収まる端子フックを備えた少し上向きの下のくちばしで短い突出したスナクが形成されました。上顎はノッチの外観を示し、上顎の先端に小さな卵歯が形成されているのが見えます。走査型電子顕微鏡によるクリセミスピクタ卵殻及びシェル膜の超構造解析は、内糸状殻膜にしっかりと付着した外カルカリヌス卵殻層を明らかにする。卵殻の外面は、様々なサイズの小さな丸みを帯びたくぼみまたは細孔の濃度を有するグループおよび隣接するシェル単位の間に配置された球状の球状の小結節で作られたよく区別されたミネラル化されたシェル単位から成っている。一般的な方法論は、SEMを使用してまともな画質を達成するためにすべての生物学的標本のために一般化することはできません。化学および空気乾燥法は、他の有機サンプルにも使用することができ、カップリングスライド培養技術は、すべての柔らかく、堅牢な微生物培養に使用することができます。

processing-embryo-eggshell-fungal-culture-for-scanning-electron

Research

JoVE Journal

Environment

環境

この記事では、我々は長期的な有効にするシンプルな方法論を提示...

アン EX - OVO</emイメージングとマイクロサーアプリケーションに適して>ニワトリ胚培養システム

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

我々は、マウス胚の皮膚の切開およびex vivoでの文化について説明します。培養系は、組織表面を横切って気液界面を維持し、倒立顕微鏡でイメージングを可能にする。メラノブラスト、現像皮膚の成分は、それらの蛍光挙動は、共焦点顕微鏡を用いて観察することを可能に標識される。...

ex vivoで培養マウス胚の皮膚およびメラノブラストの移行のライブイメージング

私たちは、マウス胚の3次元(3D)画像を取得するための高解像度の顕微鏡法を用いた詳細なプロトコルを記述します。この改良されたプロトコルは、蛍光色素の浸透性を高めるために改良された組織調製法を利用しているため、小さな標本と大きな標本の両方の形態測定分析が可能になります。...

高解像度落射顕微鏡を用いた3次元画像の迅速な取得

&gt;jove_content&lt;走査型電子顕微鏡観察のための生物学的サンプルの処理における問題には、細胞の崩壊、湿った微小環境からのサンプルの処理、および細胞破壊が含まれます。ここでは、花分裂組織、卵分裂組織、真菌(Agaricales)などの困難なサンプルの調製に適した低コストで比較的迅速なプロトコルをまとめ、詳細に説明しています。...

問題のあるプラント、卵菌類、および真菌サンプルのための電子顕微鏡（SEM）プロトコルをスキャン

光シートベースの蛍光顕微鏡による昆虫の胚の形態形成を撮像する技術の状態となっています。このプロトコルは、輪郭とモドキTribolium castaneumの胚に適した3つの取り付け技術を比較し、ライブイメージングに適して2つの新規のカスタムメイドのトランスジェニック系統を導入し、本質的な品質管理を説明し、現在の実験の限界を示しています。...

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

いくつかのテクニックを使用して視覚化することができますマウス初期胚のオーガナイザーをシグナリング過渡では脊索板とノードです。ここでは、我々 は詳細にその構造と形態形成を研究する技術の 2 つを行う方法をについて説明: 1) 走査電子顕微鏡 (SEM);2) 全台紙蛍光...

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

SEM 解析、種の同定や表現型差別を支援する効果的な方法です。このプロトコルは 3...

原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (SEM) での乾燥の準備

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。...

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

マウス胚における初期心臓前駆細胞のライブイメージング

学ぶ走査型電子顕微鏡による亀胚、卵殻、真菌培養の標準化された試料調製プロトコル。HMDS化学乾燥、空気乾燥、臨界点乾燥を用いて繊細な組織構造を保存し、構造と人工産物を区別する方法を解説します。

電子顕微鏡検査用胚、卵殻、真菌培養の処理

さらに動画を探す