円形RT-PCRベースの戦略を用いたトウモロコシミトコンドリオンにおける一次写物と処理された転写物の判別とマッピング

このプロトコルは、トウモロコシミトコンドリアにおける一次および処理された転写物のマッピングおよび識別に使用されます。この技術はRNAの正規化ステップを含み、一次と処理された転写物間の明確な識別を妨げる不安定な5つの素数三リン酸の影響を最小にする。トウモロコシミトコンドリアのほかに,この方法はプラスチドおよび他の植物ミトコンドリアに適用することができる。

氷の上の50ミリリットルの管に開発カーネルの20グラムを収集することによって開始します。カーネルを冷却したモルタルに移し、10~20ミリリットルの氷冷抽出バッファーを追加します。カーネルを完全に粉砕し、抽出バッファーを追加し、フィルタークロスの2つの層を通して地面組織をフィルタリングします。

濾液を8,000倍Gで10分間遠心する。その後、上清を新しいチューブに移し、濾液を捨てます。チューブを20,000倍Gで10分間遠心する。

上清を注ぎ、6ミリリットルの洗浄バッファーにペレットを再び懸濁します。懸濁液を5つの1.5ミリリットルRNaseフリーチューブにアリコートし、14,000倍Gで5分間遠心分離する。上清を捨て、ミトコンドリアペレットを液体窒素で凍結します。

メーカーの指示に従って市販の試薬を使用してミトコンドリアRNAを抽出し、RNA 5プライムポリホスファターゼ処理を設定します。次いで、RNA精製キットでRNAを回収します。RNA抽出に使用する試薬は危険です。

常にヒュームフードで動作し、常にラボコートと手袋を着用してください。5つのプライムポリホスファターゼ処理と非処理ミトコンドリアRNAの同量を使用して2回の回覧反応を調製する。2つの反応を摂氏16度で12~16時間インキュベートし、以前に使用したRNA精製キットで自己合統性RNAを回収します。

26 SCRTの等しい比率と最大7つの他の逆転写プライマーを持つプライマー混合物を調製することによって開始します。原稿の指示に従って2つの逆転写反応系を組み立て、50分間摂氏42度でインキュベートする。cDNAを正常化するには、5つの主なポリホスファターゼ処理または非処理RNAから同じ量のcDNAを用いて2つのPCR反応を調製し、原稿に記載されたサーモサイクル条件下で反応を実行する。

26S成熟rRNAによる正規化は、一次と処理されたトランスクリプトを区別するための重要なステップです。2つのPCR産物の量を比較し、必要に応じてテンプレートcDNAの量を調整して正規化を最適化します。標的写本の5つの素数から3つの素数接合部に適切な量の正規化されたcDNAと一対の発散プライマーを用いてPCR反応のペアを調製し、原稿の指示に従ってPCRを行う。

次に、ゲルDNA回収キットを使用して、入れ子になったPCRによって増幅される顕著なバンドを分離します。標準的な手法を使用してゲル精製PCR産物をベクターにクローン化し、コロニーPCRを実行して標的インサートを含む陽性クローンを選択します。基本的な局所アライメント検索ツールまたはBLASTを使用して、PCR産物を配列し、シーケンシングデータをトウモロコシミトコンドリアゲノムに位置合わせします。

生物トウモロコシを選択し、データベースヌクレオチドコレクションを検索します。回合された転写物の5つの素数から3つの素数接合を見つけ、5つの素数および3つの素数転写物の項の位置を決定する。RNAプローブを調製するために使用されるDNA断片を増幅し、T7プロモーターを含む以前に使用されたベクターにクローン化し、挿入部位の上流に17塩基対を含む。

DIG-11-UTPでRNAプローブにラベルを付け、市販キットを使用してRNAハイブリダイゼーションを行います。正規化された5つのプライムポリホスファターゼ処理と非処理RNAから得られた円形RT-PCR産物を比較することにより、一次および処理された5つの素端を判別します。次に、マッピング結果に基づいて定量的RT-PCRプライマーを設計し、RT-PCRで判別結果を検証します。

COX-2遺伝子を例に挙げ、環状RT-PCR法によるマイズミトコンドリア転写物のマッピングと識別を実証した。正規化されたcDNAはPCRのテンプレートとして使用され、その結果、5つのプライムポリホスファターゼ処理サンプルから2つの顕著なバンドが増幅されました。2つのバンドは、ゲルから回収されたCOX-2 1と2と命名され、ベクターにクローン化された。

コロニーPCRの結果は、陽性クローンが、末語が5つの素数または3つの素数末語を有することを意味する可変サイズの挿入物を含んでいることを示した。シーケンシングの結果から、COX-2の1と2はストップコドンの下流の39ヌクレオチドで同じ3つの素端を有し、5つの素端点はそれぞれ992〜1、030および1、276〜1、283ヌクレオチドが開始コドンの上流に位置することを示した。RNAゲルブロットハイブリダイゼーションを行い、回回RT-PCRマッピング結果を検証し、COX-21と2と同様のサイズを有する2つの主要バンドを検出した。

別のダイバージェントプライマーのペアは、COX-2 3および4つのバンドをRNAゲルブロットで検出し、初回の円形RT-PCRでは増幅しないように設計されました。定量的RT-PCRの結果により、COX-2 1、2、3、4は5つのプライムポリホスファターゼに敏感であり、主要な5つのプライムテルミニを持っていることを確認した。このプロトコルには含まれていませんが、5 つの素数マッピング結果を検証するために、Primer 拡張分析を実行できます。