Name: ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学ぶ ドーサルルート神経節マクロファージの機械的解離による迅速分離法。マウスDRGからCX3CR1陽性マクロファージを高生存率で単離し、神経障害性疼痛と軸索修復における神経免疫応答を解析する効率的な手法です。

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研究は、によってサポートされました: 麻酔教育研究のための財団 (XY);麻酔および周術的ケアのUCSF部門 (XY);1R01NS100801-01(GZ)を使用しています。本研究は、NIH(P30CA082103)の助成を通じて、HDFCCC細胞分析共有資源施設の一部を支援した。

すべての動物実験は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の機関動物ケア・使用委員会によって承認され、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドに従って実施されました。
1. 実験マウスから腰椎DRGを採取する
<ol><li>実験を開始する前に、9巻の培地を1体のCa++/Mg++-free 10x HBSSと混合して密度勾配媒体(例えば、Percoll)の作業溶液を調製する。氷の上に置いておけ</li>
	<li>2.5%アバーチンでマウスを麻酔する。後ろ足のピンチに対する応答の欠如によって動物が完全に麻酔されたことを確認します。 注:6〜8週齢の雄マウスと雌マウスの両方を用いた。</li>
	<li>予熱した1x PBSの10 mLでマウスをトランスカルティブに浸透させます。<ol>
<li>マウスを化学ヒュームフードの中にテープで固定した4本の足で、マウスをサフィンの位置に置きます。鉗子によって肋骨ケージの下の皮膚を持ち上げ、肝臓および横隔膜を露出させるために外科はさみで小さい切開をする。</li>
		<li>横隔膜と肋骨ケージを切るためにはさみを使い続け、胸膜腔を開けて心臓を露出させる。</li>
		<li>アイリスはさみで右心房の付属品を素早く切ります。出血が指摘されたら、左心室の後端に30Gの針を挿入し、ゆっくりと動物を浸透させるために予め冷やされた1x PBSの10 mLを注入する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>起こりやすい位置に置かれたマウス上で、後部ラミネクトミー15を行う。 注:細胞培養が計画されている場合は、切開前に70%のエタノールでマウスにスプレーし、解剖のために殺菌前の手術器具を使用してください。<ol>
<li>サイズ11メスを使用して、胸部領域から仙骨領域まで始まる1つの縦方向の深部切開を行います。背中の筋肉層を露出させるにはさみで皮膚を取り除きます。</li>
		<li>フリードマン・ピアソン・ロンゲールを使用して、腰椎プロセスと両側横断プロセスが露出するまで、結合組織と筋肉を剥離します。</li>
		<li>Noyesスプリングシザーを使用して背部脊柱を慎重に開き、フリードマン・ピアソン・ロンゲールに切り替えて椎骨を取り除き、脊髄を損傷した脊髄を露出させる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>慎重にイプシラテラルおよび反対索腰部DRG(我々の研究ではL4/L5 DRG)を解剖し、氷冷Ca++/Mg++-フリー1x HBSSをダウン組織ホモジナイザーで1mLに入れます。これで、組織はステップ 2 の準備が整いました。 注:可能であれば、DRGに取り付けられた脊髄神経をトリミングします。</li>
</ol>2. マウス腰椎DRGから単一細胞を分離する
<ol><li>Dounceホモジナイザー20〜25回で緩い害虫でDRG組織を均質化します。</li>
	<li>無菌の70 μmナイロン電池ストレーナーを無菌50 mL円錐管に入れます。800 μLの氷冷1x HBSSでセルストレーナーを濡らし、フロースルーを円錐管に集みます。</li>
	<li>ピペットを使用してホモジナイザーから均質化された組織懸濁液を収集し、50 mL円錐管に湿った70 μmナイロンセルストレーナーを通過します。</li>
	<li>ホモジナイザーを800 μLの氷冷1x HBSSで2回すすり、その後、セルストレーナーと同じ50 mL円錐管にデカントして収率を上げることができます。</li>
	<li>無菌5 mLポリスチレンFACSチューブに平衡化された氷冷等対位密度勾配媒体(ステップ1.1で調製)の1.5 mLを追加します。</li>
	<li>50 mL円錐管(ステップ2.4)から均質化したセルをFACSチューブに移し、上下にピペッティングして密度勾配媒体とよく混ぜます。上部をシールするために、1x HBSSの500 μLを追加します。</li>
	<li>4°Cで20分間800xgで遠心分離によって細胞をペレットする。</li>
	<li>FACSチューブの底部の細胞ペレットを乱すことなく、培地中にミエリンを含む上清を慎重に吸引する。</li>
	<li>FACS分析のために5%の胎児ウシ血清(FBS)を含むPBSまたはFACSバッファー内の細胞を再中断する。 注: 1匹のマウスのL4 /L5 DRGからは、少なくとも50,000~100,000セルが期待されます。<ol>
<li>5%の胎児牛血清を含むPBSの100 μLで機械的に単離されたDRG細胞(L4/L5)を再中断し、1時間4°Cで暗闇の中でαマウスCX3CR1-APC抗体(1:2,000)でインキュベートします。</li>
		<li>一度PBSの5 mLで細胞を洗浄します。4 °Cで8分間細胞360 x gを遠心分離します。</li>
		<li>上清を吸引し、次いでFCAS分析のために300μLのPBSで細胞ペレットを再中断する。セルの並べ替えが計画されている場合は、代わりに FACS バッファー内のセルを再中断します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+regulation+by+non-neuronal+cells+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation.</a> Science. 354 (6312), 572-577 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+types+of+macrophage+in+dorsal+root+ganglia+and+spinal+nerves+proximal+to+sciatic+and+spinal+nerve+transections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat.</a> Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).</li>
<li>Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+cargo+including+microRNA+regulates+sensory+neuron+to+macrophage+communication+after+nerve+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma.</a> Nature Communication. 8 (1), 1778(2017).</li>
<li>Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+differences+in+neuropathic+pain+modalities+revealed+by+correlating+behavior+with+global+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling.</a> Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).</li>
<li>Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglion+Infiltration+by+Macrophages+Contributes+to+Paclitaxel+Chemotherapy-Induced+Peripheral+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy.</a> The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).</li>
<li>Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+macrophages+reduces+axonal+degeneration+and+hyperalgesia+following+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury.</a> Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).</li>
<li>Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+monocytes+synergistically+promote+the+transition+from+acute+to+chronic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury.</a> Nature Communication. 7, 12029(2016).</li>
<li>Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cysteine+protease+cathepsin+S+in+neuropathic+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia.</a> Pain. 130 (3), 225-234 (2007).</li>
<li>Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK%2FNF-kappaB-dependent+satellite+glia+activation+induces+spinal+cord+microglia+activation+and+neuropathic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury.</a> Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).</li>
<li>Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+macrophages+in+generation+of+nerve+injury-induced+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia.</a> Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).</li>
<li>Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+the+peripheral+nervous+system+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury.</a> Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).</li>
<li>Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy6G-+myeloid+cells+mediate+mechanical+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Isolation+and+Primary+Culture+to+Study+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release.</a> Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).</li>
<li>Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+macrophage+ablation+in+transgenic+mice+expressing+a+Fas-based+suicide+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).</li>
<li>Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+peripheral+not+central+immune+responses+to+pain-inducing+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury.</a> Science Reports. 7 (1), 16460(2017).</li>
<li>Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+Activation+of+Primary+Sensory+Neurons+Contributes+to+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine+protease+inhibitor+SerpinA3N+attenuates+neuropathic+pain+by+inhibiting+T+cell-derived+leukocyte+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase.</a> Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).</li>
</ol>

著者は、この原稿に関連する競合する金銭的利益を宣言しません。

ここでは、マウスDRGから分離されたマクロファージを効果的に濃縮する新しい方法を紹介する。DRG免疫細胞を単離する従来のアプローチは、酵素消化15、18を必要とし、これは現在、望ましくない細胞損傷を制限し、収率を増加させるために、我々のプロトコルで機械的均質化に置き換えられています。したがって、新しいプロトコルは、はるかに少ない時間がかかります。さらに重要なことは、酵素消化がマクロファージを刺激し、分子シグネチャを変更する可能性があることです。対照的に、私たちの機械的アプローチは、細胞のストレスを大幅に制限します。
FACS解析を用いて、単離されたDRG細胞におけるマクロファージをさらに特徴付け、大きな細胞回収を実証した。このプロトコルの下で単離されたDRG細胞の80%以上が生存可能であることが判明した(図2D)。1匹のマウスのL4/L5 DRGからは、少なくとも50,000~100,000セルが期待されて...

免疫細胞が末梢神経損傷1、2に続く神経因性疼痛に寄与するというかなりの証拠がある。成熟マクロファージを含む末梢単球細胞は、有病動細胞症、抗原提示、およびサイトカイン放出を通じて組織損傷および全身感染に応答することが知られている。脊髄後角における神経損傷誘発ミクログリア活性化と並行して、後部根神経節(DRG)におけるマクロファージも神経損傷3,4後に有意に膨張する。特に、マクロファージがDRG5,6,7の感覚ニューロンと相互作用することにより末梢神経損傷後の神経因性疼痛発症に寄与するかどうかを判断する関心が高まっている。8,9,10歳,11.さらに、最近の研究はまた、神経損傷後の軸線修復におけるDRGマクロファージの寄与を含む12,13.別の研究はさらに、マクロファージ亜集団(すなわち、CD11b+Ly6ChiおよびCD11b+Ly6C低/-細胞)が機械的過敏症14において異なる役割を果たしうる可能性があることを示唆している。したがって、神経損傷の文脈におけるDRGマクロファージの応答を迅速に表現することは、神経因性疼痛に寄与する神経免疫因子を同定するのに役立つ可能性がある。
従来、DRG中のマクロファージを単離するプロトコルは、酵素消化15、16を含む複数のステップを含む。この手法は、多くの場合、時間がかかり、大規模な実験にはコストがかかる可能性があります。コラゲナーゼII型(4mg/mL)とジスパーゼ型II(4.7mg/mL)を20分間推奨していたが、この酵素に曝露した後の細胞は細胞損傷や細胞死に起こりやすく、低につながる可能性がある。収量。さらに、バッチからバッチへの酵素の品質の違いは、このプロセスの効率にさらに影響を与える可能性があります。さらに重要なことは、酵素消化にさらされたマクロファージは、望ましくない刺激を受ける可能性があるため、生体内状態とは大きく異なる可能性があります。この変更は、機能的研究の結果を複雑にする可能性があります。
ここでは、機械的解離を用いてDRGマクロファージを4°Cで迅速に単離する酵素フリープロトコルについて説明する。サンプルは細胞のストレスを制限するために氷の上に保たれます。その結果、我々のアプローチは、単離の一貫性を維持するための利点を提供し、単離された細胞は、おそらくより健康で、刺激が少ない。さらに、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析により単離細胞の品質を検証するエビデンスを提示する。

<table><tbody><tr><td>AP20187</td><td>Clontech</td><td>635058</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-マウス CX3CR1-APC 抗体</td><td>Biolegend</td><td>149007</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー (70 mm ナイロン)</td> <td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 組織ホモジナイザー</td><td>Wheaton</td><td>357538 (1ml)</td><td></td></tr><tr><td>FACSチューブ(5ml)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>HBSS(10x、Ca++/Mg++-free)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Spring Scissor</td><td>FST</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P4937-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma</td><td>P4864-10ミリリットル</td><td></td></tr></tbody></table>

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

末梢神経損傷後の後の後の後の後の後の後の後部根神経節の免疫細胞と感覚ニューロン間の分子と細胞の相互作用を研究する関心が高まっています。マクロファージを含む末梢単球細胞は、有毒症、抗原提示、およびサイトカイン放出を通じて組織損傷に応答することが知られている。新たな証拠は、神経因性疼痛の発症および神経損傷の文脈における軸線修復に対する背中根神経節マクロファージの寄与に関与している。神経損傷の文脈における後部根神経神経マクロファージの反応を迅速に表現(または「急速に単離」)することは、未知の神経免疫因子を同定することが望まれている。ここでは、酵素フリーの機械的解離プロトコルを使用して、マクロファージを後部根神経節から迅速かつ効果的に分離する方法を示します。サンプルは細胞のストレスを制限するために全体を通して氷の上に保たれます。このプロトコルは、標準的な酵素プロトコルに比べてはるかに時間がかからず、蛍光活性化細胞選別分析に日常的に使用されています。

単離細胞を検証するために、まずマクロファージ・ファス誘発性アポトーシス(MAFIA)トランスジェニックマウス17を選択した。この線は、マクロファージとミクログリアの両方で特異的に発現されるCSF1受容体(CSF1R)のプロモーターの制御下で、薬物誘導性FK506結合タンパク質(FKBP)-Fas自殺融合遺伝子および緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現する。FK結合タンパク質ダイネライザーの全身注射、AP20187(AP)は、トランスジーンを発現する細胞のアポトーシスを誘導する。EGFPの発現はまた、DRG内のマクロファージを監視することを可能にする。MAFIAマウスのマクロファージを枯渇させるために、我々はAP(1 mg/kg)の毎日3回の食肉注射で研究を開始した。最後の注射後、DRGはGFPに対する免疫染色のために切除した。我々は、VEH処理マウスと比較してAP処理マウスのDRGにおけるGFP+細胞の有意な損失を記録した(図1A-B)。別の実験では、このプロトコルを使用して...

ここでは、表現型および機能解析のための後部根神経節からマクロファージを迅速に分離するための機械的解離プロトコルを提示する。

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

新たな証拠は、神経損傷の文脈における神経因性疼痛の発達および軸索修復への後根神経節マクロファージの寄与に関与している。急速に、未知の神経免疫因子を同定するために、後根神経節マクロファージの応答を迅速にフェノノタイピングすることが望まれる。ここでは、酵素を含まない機械的解離プロトコルを使用して、我々の研究室がドーサル根神経節からマクロファージを迅速かつ効果的に分離する方法を示す。このプロトコルは、標準的な酵素プロトコルに比べてはるかに時間がかかり、蛍光活性化細胞選別分析に日常的に使用してきました。実験を開始する前に、9個の培地を1体積のカルシウムとマグネシウムフリーの10X HBSSと混合して、密度勾配媒体の働く溶液を調製し、氷の上に保管します。後足ピンチに対する応答の欠如によってマウスが完全に麻酔されていることを確認します。テープで固定された4本の足で、薬液のヒュームフードの中に麻酔をかけられたマウスを置くことから始めます。鉗子を使用して、胸部の下の皮膚を持ち上げます。そして、手術用はさみで、肝臓と横隔膜を露出させるために小さな切開を行います。同じはさみを使用して、横隔膜と胸部を切ります。そして、胸膜腔を開いて鼓動心臓を露出する。次に虹彩はさみで、すぐに右心房の付属物をカットします。出血が指摘されたら、左心室の後部端に30ゲージの針を挿入し、ゆっくりと動物を浸透させるために10ミリリットルの予冷1X PBSを注入する。足切り切れ切れ術を行うために、マウスを起こしやすい位置に置きます。大きさ11メスを使用して、胸部領域から仙骨領域まで2つの縦方向深部深切開を行います。次に、後筋層を露出する皮膚を除去する。その後、フリードマン・ピアソン・ロンガーで、腰仙骨脊椎プロセスと両側横方向のプロセスが暴露されるまで、結合組織および筋肉を剥がす。まず、フリードマン・ピアソンの回転器を使用して背骨の柱を慎重に開き、フリードマン・ピアソン・ロンガーとノイエスのスプリングハサミを切り替えて椎骨を取り除き、脊髄を無傷の脊髄を露出させます。慎重にイプシテララルと逆角腰神経DRGを解剖.Dounce組織ホモジナイザーで氷冷カルシウムとマグネシウムフリーの1X HBSSの1ミリリットルに入れる。DounceホモジナイザーのDRG組織を緩い害虫で20〜25回均質化する。滅菌50ミリリットルの円錐管に無菌70マイクロメートルのナイロンセルストレーナーを入れる。800マイクロリットルの氷コード1X HBSSを使用して、細胞ストレーナーを濡らします。ホモジナイザーから均質化した組織懸濁液を湿った細胞のストレーナーに集め、50ミリリットルの円錐管に集めるピペットを使用する。ホモジナイザーを800マイクロリットルの氷冷1X HBSSで2回リンスし、液体を同じ50ミリリットル円錐形チューブに集めて収量を増やします。平衡した氷冷同位密度勾配媒体の1.5ミリリットルを無菌5ミリリットルポリスチレンフラスコチューブに加えます。50ミリリットルの円錐管からこのフラスコチューブにホモネート細胞を移します。そして、よく混ぜるために上下にピペット。さらに500マイクロリットルの1X HBSSを追加して上部を密封します。800倍Gで細胞を摂氏4度で20分間遠心分離する。チューブの底部の細胞ペレットを邪魔することなく、ミエリンを含む上清を慎重に培地に吸引する。5%のウシ胎児血清を含むPBSの100マイクロリットルをペレットに加え、DRG細胞を再中断する。次に、アルファマウスCX3CR1 APC抗体を細胞に加え、摂氏4度で暗闇の中で1時間インキュベートします。5ミリリットルのPBSで細胞を1回洗います。セルを摂氏4度で8分間Gの360倍に遠心分離する。上清を吸引し、その後、細胞ペレットを300マイクロリットルのPBSで再懸濁して事実分析を行う。マクロファージを枯渇させるためにFK結合タンパク質二量体APをMaFIAマウスに腹腔内注射した後、AP処理マウスのDRGにおけるGFP陽性細胞の有意な損失があった。事実分析は、AP処理マウスにおけるGFP高集団の枯渇に成功したことを明らかにし、単離された細胞の高品質を実証した。処置動物のDRGから全単離細胞の4%がGFP高マクロファージであった。対照的に、全DRG細胞のわずか0.4%が、AP処理マウスにおいてGFP高マクロファージであった。野生型マウスから機械的に単離されたDRG細胞を、ΑマウスCX3CR1-APC抗体で染色した。DRG細胞の6%はCX3CR1陽性マクロファージであった。細胞生存率をヨウ化プロピジウムで評価した際、80%以上の新たに単離されたDRG細胞が生存可能であることが明らかになった。不満足な細胞収量が指摘された場合、DRG組織の不十分または過剰な均質化が疑われる可能性がある。また、DRG解剖は初心者のために繰り返し練習を必要とするかもしれません。おそらく、私たちのプロトコルの適用は、衛星細胞やT細胞などの他の非神経細胞を研究するために拡大することができます。さらなる研究は、細胞単離の有効性を確認するために必要とすることができる。

rapid-isolation-of-dorsal-root-ganglion-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、機械的な解離技術を使用してマウスの後根神経節(DRG)からマクロファージを分離する酵素フリーのプロトコルを示しています。採取したばかりのDRG組織を均質化した後、マクロファージ上の細胞表面受容体に対する抗体を使用して細胞を蛍光標識し、続いてフローサイトメトリーを実施してサンプル中のマクロファージの存在を確認します。...

機械的解離を用いたマウス背側根神経節からのマクロファージの単離

このビデオは、後根神経節(DRG)からニューロンを採取する方法を示しています。ラットの脊柱からDRGを単離し、酵素で処理した後、機械的に解離して単一細胞懸濁液を得る。ニューロンは、密度勾配遠心分離を使用してグリア細胞から分離され、増殖培地で培養されます。...

神経細胞培養のための背根神経節の採取と解離の技術

このビデオは、免疫パニングによって後根神経節からニューロン培養を濃縮し、それによって神経学的研究のためのそれらの純度と有用性を向上させるためのプロトコルを示しています。...

イムノパニングによる背根神経節のニューロン濃縮

このビデオでは、ラットの脊柱から後根神経節(DRG)細胞を分離して培養する技術を示しています。脊柱から切除されたDRGを酵素で処理し、機械的に解離させて単一細胞懸濁液を得る。細胞は、グリア細胞の増殖を制限し、ニューロンの成長を促進する阻害剤と成長因子をそれぞれ含む培地で培養されます。...

ラット脊柱からの初代背根神経節細胞培養の確立

後根神経節（DRG）、末梢神経系の感覚ニューロンを含む構造である。解離した場合、それらは損傷部位でのインビボ環境を模倣し、in vitroでの神経再生及び髄鞘形成を研究するための貴重なモデルを提供し、SC-ような脂肪由来幹細胞（ASC）と共培養することができる。...

根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em&gt;インビトロ</em末梢神経再生を研究するために&gt;共培養モデル

このプロトコルは、ラットから分離された後根神経節(DRG)ニューロンの単離と、軸索の整列を強化するための静的なプレストレッチ細胞培養システム上でのDRGニューロンの培養、そしてその後のシュワン細胞(SC)の共培養による髄鞘形成を促進することを説明しています。...

後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

ここでは、脊髄の油圧押し出しと、同じげっ歯類の特定の後根神経節（DRG）の同定と分離のためのプロトコルを提示します。標準的な脊髄分離法と比較して、この方法は大幅に迅速で、組織損傷のリスクを軽減します。...

げっ歯類での後根神経節の脊髄および単離の油圧押出

ミクログリアの機能の詳細を理解するための努力は、生体内で成熟したミクログリアの特性を要約ミクログリア培養モデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは定義されている培地条件下で高度分岐し成熟ラット...

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

後根神経節 (DRG) の初代培養は、生理機能や感覚ニューロンの病理に関連するイベントを研究するよく使用されます。ここでは、我々 は FF 神経ペプチド受容体選択的なアゴニスト 2...

伝達物質の放出を勉強する後根神経節細胞の分離と培養

このプロトコルは、成体のSprague...

末梢神経細胞の特徴を研究するためのマルチコンパートメントデバイスにおける後根神経節の採取、埋め込み、および培養

背根神経節(DRG)は一次感覚神経細胞体を含み、末梢感覚信号を脊髄に中継します。このプロトコルは、構造的に完全な神経節の標準化された分離、解剖学的節節識別、初心者ユーザー向けの直感的な指導、そして手技的組織損傷の軽減を支援するマウスDRG解離の方法を説明しています。...

マウス背根神経節の解離と分離

学ぶ ドーサルルート神経節マクロファージの機械的解離による迅速分離法。マウスDRGからCX3CR1陽性マクロファージを高生存率で単離し、神経障害性疼痛と軸索修復における神経免疫応答を解析する効率的な手法です。

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

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