Name: 自由に動くマウスの二重部位高密度記録のための回収可能なオプトシリコンプローブとテトロードを備えたハイブリッドマイクロドライブシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶ 自由に動くマウスにおける多部位神経記録と光遺伝学操作のためのハイブリッドマイクロドライブ構築法。テトロードと回収可能なオプトシリコンプローブを組み合わせ、脳領域間の動的相互作用を研究できます。

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本研究は、日本学術振興会海外研究フェローシップ協会(HO)、奨学金プログラム(TK)、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム(TK)、脳研究財団(TK)、教員科学技術取得、および一部の支援を受けています。リテンションプログラム(TK)、脳行動研究財団(TK)、住友財団研究助成金(JY)、NARSAD若手研究者研究助成金(JY)。私たちは、原稿の準備中に貴重なコメントや提案のためにW.マークスに感謝します。

著者は何も開示していない。

このプロトコルは、独立した調節可能な四位体と自由に振る舞うマウスのシリコンプローブを使用して、2つの脳領域からの神経活動の記録を可能にするハイブリッドマイクロドライブアレイを構築し、移植する方法を示す。また、光遺伝学的実験と実験後のシリコンプローブの回収を示す。調整可能なシリコンプローブ33またはオプトシリコンプローブ36の移植は、マウスで以前に実証されていますが、このプロトコルは、同時テトローデアレイとオプトシリコンプローブ移植において明確な利点を有し、柔軟に対応します。埋め込まれた調査のタイプの選択。埋め込まれたプローブの種類は、マルチシャンクプローブ27、44または超密度ニューロピクセル21、45などの実験の目的に応じて切り替えることができる。注入7の調整および角度は<...

ニューロン活動が学習や記憶などの認知プロセスをどのようにサポートしているかを理解することは、異なる脳領域が動的にどのように相互作用するかを調べていくうえで重要です。認知タスクの根底にある神経活動のダイナミクスを解明するために、マイクロドライブアレイ1、2、3、の助けを借りて自由に動く動物において、大規模な細胞外電気生理学が行われてきた。 4.過去20年間で、いくつかのタイプのマイクロドライブアレイは、ラット5、6、7、8およびマウス9の複数の脳領域に電極を移植するために開発された。10歳,11歳,12.それにもかかわらず、現在のマイクロドライブの設計は、一般的に複数のプローブタイプの使用を許可していない、研究者は、特定の利点と制限を持つ単一の電極タイプを選択することを余儀なくされています。例えば、テトロード配列は、後部海馬CA11、13などの人口密度の高い脳領域に適していますが、シリコンプローブは解剖学的接続を研究するためのより良い幾何学的プロファイルを与えます14 ,15.
テトロデスとシリコンプローブは、多くの場合、生体内慢性記録に使用され、それぞれが独自の長所と短所を持っています。テトロデスは、費用対効果と機械的剛性に加えて、単一の電極16、17よりも優れた単一ユニット絶縁で重要な利点を有することが証明されています。彼らはまた、マイクロドライブ8、18、19、20と組み合わせると、単一ユニット活動のより高い収率を提供します。神経回路21の機能を理解するために同時に記録されたニューロンの数を増やすることが不可欠である。例えば、時間関連の22細胞や報酬コーディング23細胞などの機能的に異種細胞タイプの小さな集団を調査するためには、多数の細胞が必要である。スパイクシーケンス13、24、25のデコード品質を向上させるためには、はるかに高いセル番号が必要です。
しかし、テトロデスは、皮質や視床など、空間的に分布する細胞を記録する上で欠点がある。テトロデスとは対照的に、シリコンプローブは、局所的な電界電位(LFP)の空間分布および相互作用を提供し、局所構造14,26内のスパイク活動を提供することができる。マルチシャンクシリコンプローブは、記録部数をさらに増やし、単一または隣接する構造27間で記録を可能にする。しかし、このようなアレイは、テトロデスに比べて電極部位の位置決めにおいて柔軟性が低い。さらに、高密度プローブでは、tetrodes28、29、30によって取得されたデータをミラーリングするために、隣接チャネルのアクションポテンシャルに関する情報を抽出するために、複雑なスパイクソートアルゴリズムが必要です。したがって、単一ユニットの全体的な収率は、多くの場合、テトロデスよりも低いです。さらに、シリコンプローブは、その脆弱性と高コストのために不利です。したがって、テトロデス対シリコンプローブの選択は、記録の目的に依存し、記録部位で高い単一単位または空間プロファイリングの高い収率を得るかどうかが優先されるかどうかが問題である。
神経活動を記録することに加えて、光遺伝学的操作は、特定の細胞の種類や経路が神経回路機能にどのように寄与するかを調べる神経科学のより強力なツールの一つとなっています13,31, 32、33.しかし、光遺伝学的実験は、光源34、35、36に光ファイバコネクタを取り付けるためにマイクロドライブアレイ設計に追加の考慮を必要とする。多くの場合、光ファイバを接続するには比較的大きな力が必要であり、脳内のプローブの機械的シフトにつながる可能性があります。したがって、従来のマイクロドライブアレイに埋め込み型光ファイバを組み合わせるのは簡単な作業ではありません。
上記の理由から、研究者は、電極の種類の選択を最適化するか、記録の目的に応じて光ファイバを埋め込む必要がある。例えばテトロデスは海馬1、13においてより高い単位収率を達成するために使用され、シリコンプローブは中間内皮質(MEC)37などの皮質領域の層深度プロファイルを調製するために使用される。現在、テトロデスとシリコンプローブの同時移植のためのマイクロドライブは、ラット5,11について報告されていた。しかし、マイクロドライブの重量、マウスヘッド上のスペースの限り、異なるプローブを採用するようにマイクロドライブを設計するための空間要件のために、マウスに複数のテトロデスとシリコンプローブを埋め込むことは非常に困難です。マイクロドライブなしでシリコンプローブを埋め込むことは可能であるが、この手順はプローブの調整を可能にせず、シリコンプローブ回収12、38の成功率を低下させる。さらに、光遺伝学的実験は、マイクロドライブアレイ設計に追加の考慮事項を必要とします。このプロトコルは、自由に動くマウスで慢性記録用のマイクロドライブアレイを構築して移植する方法を示し、9つの独立して調節可能なテトロデスと1つの調節可能な光シリコンプローブの移植を可能にする。このマイクロドライブの配列はまたシリコン調査の光遺伝学的実験そして回復を促進する。

<table><tbody><tr><td>#00-90ネジ</td><td>J.I.モリス</td><td>#00-90-1/8</td><td>EIBネジ</td></tr><tr><td>#0-80ナット</td><td>小部品</td><td></td><td>B00DGB7CT2真鍮ナット ファイバーフェルールホルダー保持用</td></tr><tr><td>#0-80ネジ</td> 小<td>部品</td><td>B000FMZ57G</td><td>真鍮小ネジ プローブコネクタマウント、ファイバーフェルールホルダー、シールドコーン用</td></tr><tr><td>22Ga ポリエーテルエーテルケトンチューブ</td><td>小部品</td><td>SLPT-22-24</td><td>シャトルへの取り付け用、内径0.025インチ</td></tr><tr><td>23Gaステンレスチューブ</td><td>四極管用</td><td>小部品</td><td>HTX-23R</td> 四極管用</tr><tr><td>小部品 23Gaステンレス線</td> L型・支線用<td>小部品</td><td>HTX-23R-24-10</td><td>L字型・支線用</td></tr>小<tr>部品<td>26Gaステンレス線</td> ガイド<td>ポスト用</td><td>小部品</td><td>GWX-0200</td></tr> 四<tr><td></td><td>極管</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用小部品 HTX-30R3D CADソフトウェアパッケージ</td><td>Dassault Syst&egrave;mes</td><td>SolidWorks 2003</td><td></td></tr><tr><td>3Dプリンタ</td><td>FormLab</td><td>Form2</td><td></td></tr><tr><td>5.5milポリイミド絶縁チューブHPC</td><td>医療</td><td>72113900001-012</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイルテープ</td><td>Tyco</td><td>タイコ接着剤617022アルミホイルテープ</td>代替<td>シールドコーン</td></tr><tr><td>導電性ペースト</td><td>YSHIELD</td><td>HSF54</td>シールドコーン<td>のための</td></tr><tr><td>シリコンプローブマイクロドライブAMT</td><td></td><td>UNM1.25-HalfMoon</td><td>半月ステンレス製ネジ用にカスタマイズされたネジ、直径1.5 mm、300 & マイクロ。</td></tr><tr><td>四極管マイクロドライブ</td><td>AMT</td><td>Yamamoto_0000-160_9mm</td><td>マイナスステンレスネジ、直径0.5 mm、160 & マイクロ用mスレッドピッチカスタマイズネジメートルの糸ピッチ、私達の設計</td></tr><tr><td>歯科アクリル</td><td>Stoelting51459</td><td></td><td></td></tr><tr><td>歯科モデル樹脂</td><td>FormLab</td><td>RS-F2-DMBE-02</td><td></td></tr><tr><td>Dremel回転工具</td><td>Dremel</td><td>モデル800</td><td>グラインダー</td></tr><tr><td>ドリルビット</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>電気インターフェースボード</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36-Narrow</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ</td><td>Devcon</td><td>GLU-735.90</td><td>5分エポキシ</td></tr><tr><td>目の軟膏</td><td>Dechra</td><td>Puralube眼科軟膏</td>は<td>、手術中にマウスの目が乾燥するのを防ぐ</td></tr>ため <tr><td>繊維研磨シート</td><td>Thorlabs</td><td>LFG5P</td> 光ファイバー<td></td></tr><tr><td>ファインピンセット</td>を研磨するための <td>Protech International</td><td>15-368</td><td>シリコンプローブゴールドをロード/回収するための</td></tr><tr><td>ピン</td><td>Neuralynx</td><td>EIB ピン 小型</td><td></td></tr><tr><td>アース線</td><td>AMシステム</td><td>781500</td><td>0.010インチ 裸銀線</td></tr><tr><td>ヘッドステージ プリアンプ</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36</td><td></td></tr><tr><td>インピーダンスメーター</td><td>BAK エレクトロニクス</td><td>モデル IMP-2</td><td>1 kHz テスト周波数</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>ZONA</td><td>36-105</td><td>潤滑ネジとワイヤー光ファイバー用</td></tr><tr><td></td><td>Doric</td><td>MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT</td><td></td></tr><tr><td>記録システム</td><td>Neuralynx</td><td>Digital Lynx 4SX</td><td></td></tr><tr><td>ルビーファイバースクライブ</td><td>Thorlabs</td><td>S90R</td><td>光ファイバーを切断</td></tr><tr><td>シリコングリース</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>29051-45</td><td></td></tr><tr><td>シリコンプローブ</td><td>Neuronexus</td><td>A1x32-Edge-5mm-20-177</td><td>図3、4A、4B、5</td></tr><tr><td>シリコンプローブ</td><td>ニューロネクサス</td><td>A1x32-6mm-50-177</td><td>図4C</td></tr><tr><td>シリコンプローブ洗浄液</td><td>アルコン</td><td>AL10078844</td><td>コンタクトレンズクリーナー</td></tr><tr><td>シリコンラバー</td><td>スムースオン</td><td>ドラゴンスキン 10</td><td>マイクロドライブモールドの準備のための</td></tr><tr><td>FAST シルバーペイント</td><td>GC電子</td><td>22-023</td><td>シルバープリントIIコーティング、アース線に使用</td></tr> ド<tr><td>クロネジ</td><td>オットー・フライ</td><td>2647-10AC</td><td>直径0.8mm、糸ピッチ0.200mm</td></tr><tr><td>標準手術用ハサミ</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>定位固定装置</td><td>Kopf</td><td>モデル942</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>ロクタイト</td><td>LOC230992</td><td>ガイドポスト用</td>ロックタイト</tr> 手術<tr><td>用ピン</td>セット <td>ROBOZ</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>四極管ツイスター</td><td>山本淳</td><td>TT-01</td><td></td></tr><tr><td>四極管ワイヤー</td><td>Sandvik</td><td>PX000004</td><td></td></tr></tbody></table>

自由に動くマウスの二重部位高密度記録のための回収可能なオプトシリコンプローブとテトロードを備えたハイブリッドマイクロドライブシステム

Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice

多地域の神経記録は、複数の脳領域間の微細な時間スケールの相互作用を理解するために重要な情報を提供することができます。しかし、従来のマイクロドライブ設計では、単一または複数の領域から記録する電極の1種類のみを使用することが可能で、単一ユニットまたは深度プロファイル記録の収率が制限されます。また、多くの場合、電極記録と光遺伝学的ツールを組み合わせて経路や細胞タイプの特定の活性を標的にする機能を制限します。ここでは、収量を最適化するためにマウスを自由に移動するためのハイブリッドマイクロドライブアレイと、マイクロドライブアレイの製造と再利用の説明を示します。現在の設計は自由に動くマウスで同時に2つの異なった脳区域に埋め込まれる9つのテトロデスおよび1つのオプトシリコンの調査を採用する。テトロデスおよび光シリコンプローブは、ユニットおよび振動活性の収率を最大化するために、脳内の背筋軸に沿って独立して調整可能です。このマイクロドライブアレイには、光のセットアップが組み込まれ、光遺伝学的操作を媒次化して、長距離神経回路の局所または細胞型固有の応答と機能を調べることもできます。さらに、オプトシリコンプローブは、各実験後に安全に回収し、再利用することができます。マイクロドライブアレイは3Dプリント部品で構成されているため、様々な設定に合わせてマイクロドライブの設計を簡単に変更できます。最初に説明したマイクロドライブアレイの設計と光遺伝学実験用のシリコンプローブに光ファイバを取り付ける方法、続いてテトロードバンドルの製造とアレイのマウス脳への移植方法について説明します。光遺伝学的刺激と組み合わせた局所視野電位とユニットスパイクの記録はまた、自由に動くマウスにおけるマイクロドライブアレイシステムの実現可能性を実証する。

マイクロドライブアレイは5日以内に構築された。マイクロドライブ調製のタイムラインを表2に示す。このマイクロドライブを用いて、9個のテトロデスと1つのシリコンプローブをマウスの海馬CA1およびMECに移植した[21週齢/29g体重オスpOxr1-Cre(C57BL/6背景)]。このトランスジェニックマウスは、MEC層IIIピラミッド型ニューロン中のCreを発現する。マウスをAAV5-DIO-ChR2-YFPの200 nL(力価:7.7 x 1012 gc/mL)を電極インプラントの10週間前にMECに注入した。LFPはローパスフィルタ(1~500Hz)を使用して記録され、ハイパスフィルタ(0.8~5kHz)を使用してスパイクユニットを検出しました。光刺激(λ=450nm)は、ファイバコネクタの端部で測定された10.6mW強度で1ミリ秒のパルス幅を用いて行った。テトロード記録用の基準電極を専用テトロード線を用いて白質に配置した。シリコンプローブ記録の基準は、プローブのトップチャンネルとして設定した。
テトロード調整後、リニアトラッ...

このプロトコルは、自由に動くマウスの2つの脳領域に9つの独立して調節可能なテトロデスと1つの調節可能な光シリコンプローブの移植を可能にするハイブリッドマイクロドライブアレイの構築について説明する。また、オプトシリコンプローブを複数の目的で安全に回収・再利用する方法も実証されています。

Multi-regional neural recordings can provide crucial information to understanding fine-timescale interactions between multiple brain regions. However, ...

当社のハイブリッドマイクロドライブ設計により、実験者は複数の脳領域から記録するだけでなく、異なるタイプの電極を選択して歩留まりと安定性を最適化することができます。9つのテトロデ、シリコンリニアプローブ、およびマイクロドライブアレイで調整可能で再利用可能な光ファイバーを組み合わせ、自由に動くマウスによるin vivo実験を行いました。この技術は、ラットまたはマーモセットのような他の大きな動物に容易に適応させることができる。シリコンプローブは非常に壊れやすい。例えば、光ファイバーを適応させる場合やシャトルアセンブリをマイクロドライブに回転させる場合など、プローブを扱う際には注意が必要です。マイクロドライブアレイは5つの部品から成ります。シリコンプローブ用のマイクロドライブスクリューを準備するには、まずマイクロドライブのプラスチックパターンを3Dプリントし、パターンの周りにテープを置いてパターンの周りに一時的な壁を作ります。液体シリコンゲルをパターンに注ぎ、穏やかな揺れで気泡を取り除きます。シリコンが硬化したら、慎重にパターンからシリコンゲルモールドを除去します。次に、回転式グラインダーを使用して、23ゲージのステンレス鋼ワイヤーチューブの長さ18と9.5mmをカットし、グラインダーを使用してチューブの上部2〜3mmを粗くします。少量のシリコンオイルをカスタムねじに塗布し、チューブとネジを金型にセットします。歯科用アクリルを金型に注ぎ、注射器を使用してチューブとネジの周りの気泡を除去します。歯科アクリルが完全に硬化したら、金型からマイクロドライブネジを取り外し、ペンチを使用して18mmワイヤーチップの一端から60度の角度に6mmを曲げます。回転ツールを使用してマイクロドライブねじを回転させて品質を確認し、マイクロドライブネジをマイクロドライブアレイ本体に取り付け、ネジを回してスムーズに上下に動くことができるかどうかを確認します。シリコンプローブ用のシャトルを準備するには、シャープなはさみを使用してPEEKの2つの5mmの長さをカットし、シャトルの両側にチューブを整列します。エポキシでシャトルにチューブを接着し、ガイドポストにシリコンオイルの少量を適用します。エポキシが乾燥したら、マイクロドライブアレイ本体のガイドポストの上にシャトルを置き、品質を確認します。シャトルは過度の摩擦なしにスムーズに動く必要があります。オプトロードを準備するには、ルビカッターを使用して光ファイバーの一部を長さ21mmに切断し、繊維先端が平らで光沢のあるものになるまで粉砕します。先端の準備ができたら、電極部位の上部の上にシリコンプローブ200〜300マイクロメートルの前面に光ファイバを静かに置き、透明テープで一時的に光ファイバをシリコンプローブのベースに接着し、エポキシを少量でシリコンプローブのベースに接着し、エポキシを5時間硬化させます。シャトルをシリコンプローブに取り付けるには、シリコンプローブベースの背面に少量のエポキシを塗布し、シャトルとシリコンプローブベースの間のギャップの形成を避けるために、シャトルの底部をシリコンプローブベースに対して2〜3分間静かに保持します。エポキシが完全に硬化したら、細かいピンセットでシャトルの溝を保持し、慎重に本体のガイドポストにシャトルチューブを配置するために顕微鏡を使用しています。ネジを回してマイクロドライブのネジをねじ穴に挿入し、L字型チューブの先端をシャトルヘッドの溝に挿入して、シリコンプローブとマイクロドライブネジを固定します。次に、2本の番号0のネジを3.5mmのネジ長さにカットし、チップを研削してバリを取り除きます。プローブコネクタホルダーをアレイ本体に置き、シリコンプローブの電気コネクタをホルダーに差し込みます。数 0 のネジを挿入して、プローブコネクタホルダーを保持します。エポキシを使用して、プローブをマイクロドライブアレイ本体に接着しないように注意してホルダー内のシリコンプローブコネクタを固定します。フェルールホルダーをオプトシリコンプローブとマイクロドライブアレイ本体に取り付けるには、2本の番号0のネジを6mmのねじ長さに切り、先端を研ぎ込みます。2.5~3mmの外径の小さな六重ナットを作り、ナンバー0のネジをホルダーの部品Aに挿入するために、2つの番号0マシンスクリューナットの外側を粉砕します。ネジヘッドにエポキシを接着します。部品AとBに少量のシリコングリースを塗布して、本体との摩擦を低減します。逆ピンセットを使用してコンポーネントAを一時的にボディに挿入し、コンポーネントAのネジにコンポーネントBを配置します。繊維フェルールは、ホルダーから4〜5mmを突き出していることを注意して、繊維フェルールホルダーの溝に入れ.フェルールとホルダー溝の間に少量のエポキシを塗布します。エポキシが硬化したら、ナットを緩め、マイクロドライブねじを回してシャトルとフェルールホルダをスムーズな動きをチェックし、フェルールホルダーが上部の位置にあり、シャトルチューブがまだガイドポストに関連付けられているときにプローブチップが完全に体内に引き込まれるかどうかを確認します。シールドコーンを取り付けるには、コーンの外側から2本の3.5mm番号0ネジを固定してマイクロドライブを所定の位置に固定します。マイクロドライブアレイは、テーブルに示されているタイムラインに従って構築が完了した場合、5日以内に設定できます。テトロード調整の後の動作の性能は線形トラックおよび開いた分野でテストすることができる。どちらの実験でもマウスは約30分間自由に探索し、電気生理学的信号は記録セッション中に激しい動きに関連するノイズなしで記録されます。光刺激は、海馬のCA1サブフィールドに投影する内側内皮質層3ニューロンを刺激するために内側内皮質で行うことができる。自発的なスパイク活動と局所的な電位は、マウスが眠っているときにテトロデスとシリコンプローブから記録されます。この代表的な実験では、テトロデスに記録された左の電位は、すべてのテトロデがCA1ピラミッド型細胞層の近傍に位置していることを示唆する大きなリップル活動を示した。このアッセイにおける光誘発応答性活動は、最初に内側内皮質で観察され、CA1内の活動が13〜18ミリ秒の遅延で観察された。静電環境でマイクロドライブ本体にオプトシリコンプローブを挿入するように注意してください。シールドコーンは、紙やテープなどの材料に置き換えることができます。これにより、マイクロドライブの速度が最大20%減少します私たちのマイクロドライブ設計は、複数の脳領域を測定および操作し、異なる脳構造のダイナミクスと相互作用を調査するために、記録電極の効果的な組み合わせのための柔軟な選択肢を提供します。

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