内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

この3D共培養スフェロイドシステムは、生理学的血管新生を模倣するように設計されています。これは、潜在的な血管新生モジュレーターを評価するために有効であり、インビボ研究の前に予測可能な情報を提供します.このシステムは、2つの血管前駆細胞によって形成された共培養スフェロイドを利用し、細胞相互作用、発芽、および生理学的血管新生の管状成熟を調べるために使用することができる。

患者細胞を用い、共培養スフェロイドを形成できれば、このシステムを用い、がんなどの異常な血管新生関連疾患に対する個別化された治療法を開発することができます。このアッセイシステムは血管新生および薬剤開発の研究の感受性および効率を高めることができる。05%トリプシン-EDTAを使用して、ECFCおよびMCを80〜90%コンフルエント細胞培養物をそれぞれ細胞培養インキュベーターで3〜5分間剥離することから始めます。

新鮮な完全なDMEM培地でトリプシンを不活性化し、ピペットを数回細胞にして単一の細胞懸濁液を生成する。遠心分離によって細胞を収集し、続いて無血清培地で2回のスケートを行う。2回目の洗浄後、ECFCを培地濃度当たり6細胞に3倍10倍、MSPを個々の2ミリリットルマイクロ遠心分離管中濃度の6ミリに2倍10倍に希釈する。

ペレットは遠心分離により細胞を、各細胞試料から最後の15〜25マイクロリットルの上清を除くすべてを慎重に吸引する。次に、各ペレットを蛍光色素キットから250マイクロリットルの希釈剤C中に再懸濁し、細胞懸濁液を穏やかにピペットして完全な分散を確保する。ECFCのチューブに、250マイクロリットルの新しく調製した20マイクロモルPKH67を加えます。

12マイクロモルPKH26の250マイクロリットルをMSCのチューブに加える。光から保護された揺れで室温で5分後、1管当たり0.5ミリリットルのFBSで1分間のインキュベーションで染色プロセスを停止します。

インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞を収集し、慎重に上清を除去し、続いて2ミリリットルの新鮮な完全な媒体を洗浄する。その後、各培地の細胞を15ミリリットルのチューブに懸濁させる。スフェロイド発生のために、第二の洗浄後、まず20%メチルセルロース溶液および5%ウシ胎児血清中濃度を添加した内皮細胞増殖培地MV2の適切な濃度で細胞懸濁液を希釈する。

次に、各セル懸濁液を殺菌ポリスチレン長方形の貯留槽に加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、約125マイクロリットルの細胞液滴を150ミリメートルの培養プレートのカバーに追加します。すべての細胞を添加したら、PBSの15ミリリットルを含む皿の底部にカバーを反転し、24時間細胞培養インキュベーターにプレートを入れる。

翌日、PBSの5ミリリットルで皿カバーを1皿あたり1つの50ミリリットルチューブに洗いす。残りのスフェロイドを収集するためにさらに5ミリリットルのPBSでカバーをリンスし、遠心分離によってスフェロイドをペレットにします。最後の100~200マイクロリットルの上清を除くすべてを慎重に捨て、残りの上澄みで回転楕円体が自由に吊り下げられたようにチューブの壁を軽くたたきます。

5%のウシ胎児血清と40%のメチルセルロース溶液を添加した内皮細胞増殖培地MV2の適切な量を各チューブに加え、培地濃度の1ミリリットル当たり100スフェロイドでスフェロイドを再懸濁する。直径3~5ミリメートルに切った1ミリリットルのピペットチップを使用して、スフェロイド懸濁液を穏やかに混ぜます。新しい広端、1ミリリットルのピペットを使用して、スフェロイド懸濁液を中和されたI型コラーゲンゲルと氷上で1対1の比率で混合します。

各スフェロイド懸濁コラーゲンゲル溶液の900マイクロリットルを、事前に温めた24ウェルプレートのウェルに加えます。懸濁液を細胞培養インキュベーターで30分間重合させ、スフェロイドを100マイクロリットルの内皮細胞増殖培地MV2で覆い、2.5%FBSおよび50ナノグラムのVEGFを1ミリリットル当たりECFCのみのスフェロイドに、培地のみをFBSとECFCプラスMSCスフィソイド培養液に補充する。次に、各プレートを細胞培養インキュベーターに設置したリアルタイムセルレコーダーに入れ、10倍の倍率で5~10個のスフェロイドにランダムに焦点を当て、各蛍光標識スフェロイドの発芽を1時間おきに24時間監視します。

スフェロイドの発芽を定量化するために、ImageJに画像ファイルをインポートし、実験群ごとに5つの無作為に選択されたスフェロイドから適切な蛍光シグナルを発現するスプラウトの数と長さを測定する。ECFCプラスMSCスフェロイドの場合、スプラウトと累積スプラウトの長さの数は、すべてのタイムポイントでECFCのみのスフェロイドのものと比較して有意に高くなります。MSCのみのスフェロイドは、スプラウトを形成しませんが、スフェロイドの外にMSCの個々の移行を示しています。

ECFCプラスMSCスフェロイドを生成するために組み合わせる前に、緑色蛍光色素とMSCと赤蛍光色素を用いたECFCの標識は、ECFC媒介性スプラウト構造がMSCで覆われていることを示し、2つの血管細胞間の関連によって芽の安定性と耐久性を高める。血管新生阻害剤で前処理されたECFCプラスMSCスフェロイドは、コントロールECFCプラスMSCスフェロイドと比較して、用量依存的に減少したスプラウト数および累積芽長を示す。並行実験では、阻害剤で前処理されたECFCのみのスフェロイドに続いてVEGFによる刺激を与え、用量依存的に成長因子誘導スプラウト数および累積芽長の減少を示す。

また、ECFC-plus-MSCスフェロイドを阻害するには、より高濃度の血管新生阻害剤が必要です。腫瘍増殖は、ヒト異種移植腫片腫瘍マウスモデルにおける対照処理動物および低用量血管新生阻害剤処理動物の両方と比較して、高用量血管新生阻害剤処理動物において有意に阻害される。高用量処理マウスにおけるベバシズマブの血漿濃度は、1ミリリットル当たり568プラスマイナス40.62マイクログラムであり、ECFC-プラスMSCスフェロイドではなくECFCプラスMSCスフェロイドの累積スプラウト長を阻害するためのベバシズマブのIC50値に近かった。

これは、ECFCプラスMSCの共培養スフェロイドシステムが、動物研究の前に効果的な血漿濃度を予測するのに適していることを示唆している。広い先端を使用して、1 mLピペットを使用して、氷上のコラーゲンゲルにいる間にスフェロイドを穏やかに混合することが、スフェロイドの完全性を保護するために重要です。このシステムを改変して、免疫細胞や他の細胞外マトリックスなどの他の細胞タイプを導入し、血管新生時の細胞マトリックスクロストークを調べることができます。