Name: コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶコネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクス摂動の手法。細胞間接着を破壊しながら牽引力と細胞間応力を測定し、創傷治癒やがん転移などの病態生理学的プロセスにおける細胞力学の役割を解明する。

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この研究は、セントラルフロリダ大学のスタートアップファンドと国立心臓、肺、および国立衛生研究所の賞K25HL132098の下で血液研究所によってサポートされました。

1. ポリアクリルアミド(PA)ゲルの製造
<ol><li>
ペトリ皿の調製
	<ol>
<li>200 mLの超純水を80μL酢酸と50μLの3-(トリメトキシシル)プロピルメタクリレートと混合して結合シラン溶液を調製する。バインドシランは、ヒドロゲル取り付け用のガラス底ペトリ皿表面を機能させるために使用される溶液である。</li>
		<li>少なくとも1時間攪拌プレート上のバインドシラン溶液をかき混ぜます。</li>
		<li>45分間、バインドシラン溶液でペトリ皿の中心をよく扱います。</li>
		<li>バインドシラン溶液を除去し、超純粋な水2x-3xでペトリ皿をすすいでください。</li>
		<li>ペトリ皿表面を乾燥させ、将来の使用のために室温で保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ヒドロゲル溶液の調製
	<ol>
<li>表1に従って、15 mL遠心管に超純水、40%アクリルアミド、および2%ビスアクリルアミドを混合する。</li>
		<li>ヒドロゲル溶液に80μLの蛍光ビーズを添加します。</li>
		<li>チューブをそっと振り、ビーズとゲル溶液を混ぜます。</li>
		<li>遠心管のチューブキャップを軽く締め、真空チャンバに入れます。</li>
		<li>真空チャンバで少なくとも45分間ゲル溶液を脱気する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ヒドロゲル重合
	<ol>
<li>まず、10%のツル酸アンモニウム(超純水に溶解)の75 μLを加え、8 μLのTEMED(N、N'、N'、N'-テトラメチルタン-1,2-ジアミン)をヒドロゲル溶液に加えます。</li>
		<li>ペトリ皿の中心に24 μLのヒドロゲル溶液を置きます(表2参照)。</li>
		<li>ヒドロゲルを平らにするには、18 mm のカバースリップを使用します。これは〜100 μmの高さを与える。</li>
		<li>ゲル重合のために少なくとも30-40分待ちます。</li>
		<li>ゲル脱水を防ぐために、超純水に重合されたヒドロゲルを浸します。</li>
		<li>ペトリ皿をアルミホイルで覆い、蛍光ビーズの光漂白を防ぎ、4°Cに保管してください。 注:ヒドロゲルは、最大3ヶ月の期間を保存することができますが、最良の結果を得るために製造後1週間以内にこれらのゲルを使用することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞培養
<ol><li>細胞培養培地200におけるヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を37°Cおよび5%CO2で0.1%ゼラチン被覆フラスコに1%ペニシリン-ストレプトマイシンで補成した。 </li>
</ol>3. マイクロパターンステンシル製剤
<ol><li>シリコーンベースとシリコーン硬化剤を20:1の比で混合して100mmペトリ皿にポリジメチルシロキサン(PDMS)の薄層を硬化させる(ベース:硬化剤)。 注:硬化剤比(例:10:1または30:1)に他の塩基を使用することが可能です。ただし、硬化剤比に対するベースが低いほど硬いパターンが得られ、硬化剤比に対するベースが高いほど柔らかいパターンが生成されます。</li>
	<li>20:1(ベース:硬化剤)PDMS溶液を準備し、50 mL遠心管で慎重に混ぜます。チューブを逆さまに反転し、PDMS溶液の適切な混合を確実にするために、複数回激しく振ると、不均一な混合は不完全な重合をもたらす。</li>
	<li>190 x gで1分間PDMS溶液を遠心分離することにより、上記のステップから導入された気泡を除去します。</li>
	<li>100 mm ペトリ皿の中央に 5-6 mL の PDMS 溶液を注ぎ、PDMS 溶液がペトリ皿表面全体を覆うまで皿を攪拌します。</li>
	<li>50-60 °Cで一晩PDMS溶液を硬化します。PDMSは室温で硬化することもできる。</li>
	<li>穴パンチャーで円形の直径16mmのPDMSステンシルを取り外します。</li>
	<li>生検パンチを使用して、PDMSステンシルに小さな穴を作ります。このプロトコルは1.25のmmの直径の生検のパンチを使用する。</li>
	<li>PDMSステンシルを最初に70%エタノールに2~3分間浸し、余分なエタノールを吸引し、次に5分間UV光の下に置くことによって殺菌する。</li>
</ol>4. コラーゲン-Iヒドロゲルコーティング
<ol><li>ヒドロゲルからカバースリップを取り外し、余分な液体を吸引します。</li>
	<li>PDMSステンシルをヒドロゲル表面に置きます。 注:ピンセットは、PDMSステンシルとヒドロゲル表面の間の水密シールを確保するために、PDMSステンシルに光圧を適用するために使用することができます。私たちのPDMSステンシルは水密であるため、ゲル上面とPDMSステンシル底面との間の水アクセスを防ぎます。また、ヒドロゲル剛性は、PDMS剛性に対して調整する必要はありません。</li>
	<li>ヒドロゲル表面をスルホスクシニミジル-6-(4-azido-2-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート(スルホ-SANPAH)で0.1M HEPES(4-(2-ヒドロキシチル)-1-ピペラジネエタンスルホン酸)緩衝液を1の濃度で1:10の濃度で覆うランプ(電源36 W)を8分間使用します。</li>
	<li>過剰なスルフォ-SANPAHおよびHEPES溶液を吸引し、0.1 M HEPESでヒドロゲルを2回すすいで、その後、超純水でさらに2回のすすが続きます。</li>
	<li>余分な超純水を吸引し、0.1 mg/mLコラーゲン-Iを4°Cで一晩使用します。</li>
	<li>皿を覆い、蛍光ビーズを光漂白から守ります。 注: PDMS ステンシルは、マイクロパターン化された単層を作成するために使用されます。マイクロパターン化された単層は、各実験中に同じ形状と寸法の複数の単層を同時に観察できるように利用されます。ただし、マイクロパターンが望ましくない場合は、ステップ 4.2 を除き、上記の手順に従うことができます。</li>
</ol>5. ヒドロゲル上にHUVEC単層を作成する
<ol><li>1xトリプシンを使用して、インキュベーターで3〜5分間組織培養フラスコから細胞を切り離します。</li>
	<li>トリプシン化後、トリプシン溶液に細胞培養培養培養培養培養液を加え、15 mL遠心管に添加する。</li>
	<li>1710 x gで3分間の細胞溶液を遠心分離する。細胞の小さな白いペレットは遠心管の底部に見えるべきである。</li>
	<li>上清を吸引し、培中の細胞を50 x 104細胞/mLの濃度に再中断する。</li>
	<li>ヒドロゲルからコラーゲン-Iを取り出し、PBSで1xをすすいで下します。</li>
	<li>PDMSステンシルの上部に75 x 103セルを追加し、37°Cおよび5%CO2のインキュベーターで少なくとも1時間ヒドロゲル表面に細胞を付着させます。</li>
	<li>PDMSステンシルを取り外し、ペトリ皿に少なくとも2 mLのメディアを追加します。PDMSステンシルを10倍トリプシンに沈め、付属の細胞を除去し、70%のエタノールで噴霧し、5分間UV光の下に置くことによって殺菌します。</li>
	<li>ペトリ皿をインキュベーターに入れ、少なくとも36時間またはコンフルエント単層が観察されるまで待ちます。</li>
</ol>6. Cx43破壊に対する2,5ジヒドロキシカルゾン処理
<ol><li>ジメチルスルホキシド(DMSO)に2,5ジヒドロキシカルゾン(カルコン)を溶解し、0.1875 mg/mLストック溶液を作ります。</li>
	<li>細胞培養培地でストック溶液を希釈し、低カルコーン濃度(0.2 μg/mL)のアリコートと高いカルコーン濃度(2μg/mL)のアリコートを作ります。</li>
</ol>7. データ取得
<ol><li>顕微鏡で細胞島を探す。</li>
	<li>相コントラストとビーズ画像を画像細胞形態およびヒドロゲル変位にそれぞれ取得する。 注: このプロトコルは、データ取得に 10 倍の目的を使用しました。</li>
	<li>実験の最後に、10倍トリプシンで細胞を剥離し、細胞を使わずにゲル表面の画像を取得する(参考画像)。</li>
</ol>8. 免疫染色
<ol><li>4%ホルムアルデヒドで単層を固定し、37°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>4%ホルムアルデヒドを除去し、細胞を透過させるために37°Cで5分間0.2%トリトンX-100を追加します。</li>
	<li>0.2%のトリトンX-100を取り外し、PBS 2x-3xで単層をすすいで下します。</li>
	<li>2%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液で単層を37°Cで45分間覆う。</li>
	<li>2%のBSA溶液を取り出し、PBS 2x-3xで単層をすすいで下します。</li>
	<li>1:400の濃度で一次Cx43抗体を試料に添加し、4°Cで一晩インキュベートする。</li>
	<li>一次抗体を除去し、PBS 2x-3xでサンプルをすすいで下します。</li>
	<li>3:200の濃度で二次抗体を追加し、37°Cで2時間インキュベートします。 注:サンプルは、光漂白を防ぐためにカバーする必要があります。</li>
	<li>二次抗体を取り除き、PBS 2x-3xですすいで下します。</li>
	<li>取り付け媒体(Fluromount-G DAPI)と18 mmカバースリップでシールしてサンプルをカバーします。</li>
</ol>9. トラクション力顕微鏡(TFM)及び単層ストレス顕微鏡(MSM)の実施
<ol><li>
ヒドロゲル変形計算 注: MATLAB を使用したステップバイステップの変位計算手順を以下に示します。<ol>
<li>MATLAB でメイントラクション.mファイルを開きます(すべての MATLAB ルーチンについては、補足資料を参照してください)。 注: MATLAB ディレクトリを設定するには、コードに記載されている指示に従ってください。</li>
		<li>画像フォーマット、ピクセル対ミクロン変換、ヤング率、ポアソン比、顕微鏡の目的:次の変数を定義します。</li>
		<li>OpenFilesサブルーチンを使用して、ビード、トリプシン イメージ、およびフェーズ イメージを見つけます。 注: 大きなデータ・セットの場合は、ファイルに順番に名前を付けることをお知りください。たとえば、ファイルの名前は "filename1.tif" "filename2.tif" などです。</li>
		<li>セル単一層の周囲に正方形の ROI (対象領域) を定義し、cell_cropperサブルーチンを実行して元のイメージをトリミングします。</li>
		<li>変位を計算するには、変位_finderサブルーチンを実行します。</li>
		<li>Dedriftサブルーチンを実行して、顕微鏡ステージドリフトに起因する可能性のある追加の非細胞変位を除去します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
トラクションの計算 注: ここでは、制約のないトラクションは、カスタム記述された MATLAB ルーチンを使用して計算されます。前述の MATLAB ルーチンを使用したステップ バイ ステップ トラクション計算を以下に示します。<ol>
<li>トラクション.mルーチン内で次の変数を定義します: 境界条件、ゲルの厚さ、ゲルの高さ、およびドリフト解除。</li>
		<li>トラクションを計算し、トラクションをプロットするためにplot_tractionサブルーチンを実行するために、トラクションを実行します。X 方向 (Tx) と Y 方向 (Ty) のすべてのトラクションと対応するピクセル位置は、コードによって生成される traction.dat ファイルにあります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞間応力の計算 注: 前述の MATLAB ルーチンを使用した細胞間ストレス計算のステップバイステップの指示を以下に示します。<ol>
<li>mark_circular_domainサブルーチンを実行して、単層境界を指定します。このルーチンは、ユーザーがモノレイヤーの周りに手動で境界を描画するように、すべてのトリミングされたフェーズ イメージを順番に求める。コマンド ウィンドウで生成された nXPts をメモし、FEM 解析用の X 軸と Y 軸の両方のグリッド パラメータとして後で使用します (ステップ 9.3.2 を参照)。</li>
		<li>Run_StressCodeを実行して、細胞間応力を計算します。このサブルーチンは、"model.in" ファイルからパラメーターを直接読み取り、FEM 分析を実行するために "island.exe" を実行します。このルーチンを実行する前に、model.inファイル内のすべてのパラメータ、すなわちXとYのグリッドパラメータ、ピクセルからミクロン変換、ゲルのヤングの係数、ポアソンの比率、単層の高さ、および単層パターン(ストリップまたは穴)が編集されていることを確認してください。正しく。</li>
		<li>plot_FEM_resultsサブルーチンを使用して、すべての FEM 結果をプロットします。 注: 生成されたすべての結果は、MATLAB ディレクトリの結果フォルダーに自動的に保存されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

我々のグループは、他のグループと同様に、TFMおよびMSMを使用して、インビトロ7、15、18、27における様々な病理学的および生理学的細胞プロセスにおける細胞接合部の影響を調べている。.例えば、Hardinらは、細胞間ストレス伝達が内皮細胞における準細胞間ギャップ形成を示唆する非常に洞察に満ちた研究を提示した15。ここで報告するCx43関連の変化をHardinらによって報告された変化に関連づけることは可能ですが、このプロトコルにおける細胞間ギャップ形成には特に取り組みはありません。ここでは、ギャップ接点Cx43を具体的に標的とし、内皮バイオメカニクスに及ぼす影響を調べるための力学ベースのプロトコルを提示した。
このプロトコルを成功させるためには、克服しなければならない課題がいくつ...

細胞および組織の生理学および病理学に対する物理的な力および機械的特性の影響の研究を指す分野は、メカノバイオロジー1として知られている。メカノバイオロジーで利用されているいくつかの有用な技術は、単層ストレス顕微鏡と牽引力顕微鏡です。トラクション力顕微鏡は、細胞基板界面で生成されたトラクションの計算を可能にする一方、単層応力顕微鏡は、単層2内の隣接する細胞間で発生する細胞間ストレスの計算を可能にする。 ,3,4,5,6.以前の方法から得られた結果は、細胞由来の機械的ストレスが細胞プロセス3、4、5のホストの運命を決定する上で重要な役割を果たしていることを示唆している。例えば、外部の機械的力にさらされると、集団として移動する細胞のグループは、その形態を変更し、その形状を偏光させ、加えた力の方向に沿って整列し、移動することができ、部分的には、牽引を発生させる7、 8.トラクションは、細胞収縮性を評価するために使用できるメトリックを提供し、牽引力顕微鏡(TFM)を使用して計算されます。トラクション力顕微鏡(TFM)は、細胞誘発基板変形の決定から始まり、数学的に厳格な力学ベースの計算アプローチを用いて牽引場の計算を行います。トラクションを計算する能力はかなり長い間あるので、研究者はTFMを利用して、がん9、創傷治癒10、工学的心臓の評価を含む多くのプロセスに対するトラクションの影響を明らかにしました。ティッシュ11.
TFMとMSMの実装は、次の順序で実行する必要がある3つの重要なステップに分けることができます:最初に、細胞によって生成されるヒドロゲル変形が決定されます。第二に、トラクションはヒドロゲル変形から回収されます。第三に、有限要素アプローチは、単層全体の中で正常およびせん断間のストレスを計算するために使用されます。ゲル変位を計算するために、細胞を用いた蛍光ビーズ画像を、カスタム書き込み粒子画像ベロシメトリー(PIV)ルーチンを用いて参照ビーズ画像(細胞なし)と比較した。PIV解析の交差相関ウィンドウサイズとオーバーラップは、それぞれ32 x 32ピクセルと0.5ピクセルに選択されました。このとき、ピクセルシフトを、ピクセルからミクロンへの変換係数を乗算してミクロンに変換し(顕微鏡の場合、この変換係数は0.65)、平面内変位を得た。平面外の変位を無視に関連するエラーは、ごくわずか12,13です。ゲル変位の計算後、利用できるトラクション測定には、拘束されたトラクションと非拘束トラクション8、14の2種類があります。拘束されていないトラクションは、視野全体(セルの有無にかかわらず)のトラクションフィールドを提供し、拘束された牽引はセル14を含む領域に対してのみ牽引フィールドを提供します。次に、細胞間ストレスは、牽引力顕微鏡の延長である単層応力顕微鏡(MSM)を用いて計算される。MSMの実装は、ニュートンの法則7で要求されているように、細胞界面で細胞間で伝達される機械的力によって、細胞の単層によって発揮される局所的な牽引力のバランスをとらなければならないという仮定に基づいている7 、12、13.ここでの重要な仮定は、単層における牽引分布が知られており、力のバランスが細胞材料特性に依存しないため、セル単層を薄い弾性シートとして扱うことができるということです。もう一つの重要な仮定は、牽引力が光学視野内(単層内)内の局所細胞間応力によってバランスされ、この力バランスの影響は遠位領域(単層の外側)13において最小限である。したがって、細胞間応力、変位、または単層境界における両方の組み合わせによって定義される境界条件は、MSM13を実行するために重要である。上記の情報を考慮して、MSMを使用して有限要素解析(FEM)を実行し、最大主応力(σmax)と最小主応力(σ分力)を回復し、単層。これらの主応力は、その後、2D平均法線間間応力[(σmax + σmin)/2]および2D最大せん断間応力[(σmax - σmin)/2]を単層全体で計算するために使用されます。12、13.この手順については、Tambe et al.12,13 によって詳細に説明されています。
単層ストレス顕微鏡(MSM)は、単層6、7、8、12、13内で生成される細胞細胞間ストレスの計算を可能にする。これらの細胞間ストレスは、組織の成長および修復、創傷治癒、および癌転移12、15、16、17にとって重要であることが示唆されている。また、細胞間ストレスは、内皮細胞移動および内皮バリア機能17,18においても重要であることが示唆されている。タイトジャンクションや接着接合部などの細胞間接合部は、細胞間ストレスの生成と伝達において重要な役割を果たすることが示唆されているが、ギャップ接合部の役割は依然として不明である。ギャップ接合部は、隣接する細胞を物理的に接続し、隣接する細胞19、20、21の間を通過する電流および分子(<1 KDa)の経路を提供する。内皮細胞はCx37、Cx40、およびCx43ギャップ接合部19、22、Cx43を発現するが、間違いなく疾患進行23の点で最も重要である。Cx43の重要性の証拠は、マウスにおけるCx43の遺伝的欠失が低血圧24を生じ、血管新生25に悪影響を及ぼすという事実で見出されうる。さらに、Cx43は、細胞の移動および増殖およびアテローム性動脈硬化症の進行において重要であることが文書化されている18、22、23、24、25.
このプロトコルでは、TFMとMSMを用いて、コンフルエント内のトラクションおよび細胞間ストレス発生が、内皮単層が内皮ギャップ接合部Cx43の破壊によって影響を受けるかどうかを調べた。我々は、2,5−ジヒドロキシカルゾン(カルコーン)でCx43を破壊し、Cx43発現26を阻害する分子である。カルコーンは、Cx43式26を破壊するために以前にLeeらによって報告されているように、siRNAの代わりにCx43を破壊するために使用された。また、様々な血管の予防と治療に使用できる抗炎症および抗血小板化合物であることが報告されているため、カルコンが内皮に与える影響に特に関心を持っていました。病理26.カルコーン処理は実験開始の1時間後に行い、カルコーン処理単層を合計6時間画像化し、画像処理をカスタム書き込みMATLABコードで行い、トラクションを決定し、その後細胞間を決定した。応力。我々の結果は、トラクションと細胞間ストレスの全体的な減少を示し、Cx43が内皮バイオメカニクスにおいて重要な役割を果たすことを示唆した。

<table><tbody><tr><td>18 mm カバーガラス</td><td>ThermoFisher</td><td>18CIR-1</td><td>ポリアクリルアミドゲルを平らにするために必須</td></tr><tr><td>2% ビスアクリルアミド</td><td>BIO-RAD</td><td>1610143</td><td>ポリアクリルアミドゲルの成分</td></tr><tr><td>2&prime;,5&prime;-ジヒドロキシカルコン</td><td>SIGMA</td><td>IDF00046</td><td>Cx43 構造を破壊するには</td></tr><tr><td>3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート</td><td>SIGMA</td><td>2530-85-0</td><td>酢酸と超純水でシラン混合物を結合するためのストック溶液</td></tr><tr><td>40% アクリルアミド</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>ポリアクリルアミドゲルの成分</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャー・シーンティフィ</td>ック <td>64-19-7</td><td>結合生理食塩水を作るために必須</td></tr><tr><td>アレクサ・フルーロ 488 ヤギ 抗マウス IgG;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>カタログ#A-11001</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>BIO-RAD</td><td>1610700</td><td>ポリアクリルアミドゲル重合剤</td></tr>ウ<tr><td>シ血清アルブミン(BSA)</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td>ブロッキング<td>溶液を作るために</td></tr>ウ<tr><td>シI型アテロコラーゲン溶液、3mg / mL、100mL</td>アドバンス<td>バイオマトリックス</td><td>5005-100ML</td>細胞<td>外マトリックス</td></tr><tr><td>として使用しますCorning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>21040CV</td><td>Buffer 生理食塩水 細胞培養に必要な生理食塩水</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド、Fisher BioReagents</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>67-68-5</td><td>カルコンを溶解してストック溶液を作るには</td></tr><tr><td>Fluoromount-G with DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4959-52</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>の染色に使用する免疫染色用封入剤蛍光マイクロスフェア カルボン酸修飾ビーズ</td><td>ThermoFisher</td><td>F8812</td><td>0.5ミクロン カルボン酸修飾ビーズ (赤)、2% 固形分</td></tr><tr><td>HEPES 緩衝液 1 M</td><td>SIGMA</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>LVES</td><td>ThermoFisher</td><td>A1460801</td><td>Essential HUEVC 培地 200 サプリメント</td></tr><tr><td>Medium 200</td><td>ThermoFisher</td><td>M200500</td><td>HUVEC 細胞培養</td></tr><tr><td>用培地マウスモノクローナルCx43抗体 (CX - 1B1)</td><td>ThermoFisher</td><td>Catalog #13-8300</td><td>Cx43</td></tr><tr><td>ペトリディッシュ用一次抗体 (直径35 mm)</td><td>CellVis</td><td>D35-20-1.5H</td><td>35 mm シャーレ、20 mmセンターウェル</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH架橋剤 100 mg</td><td>Proteochem</td><td>102568-43-4</td><td>ポリアクリルアミドゲル表面の官能基化に必須</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>DOW コーニング</td><td>2646340</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>1610801ポリアクリルアミドゲル重合剤</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td>を作るための硬化剤付きシリコンエラストマー <td>SIGMA</td><td>9002-93-1</td><td>細胞を透過化するために</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25300054</td><td>細胞を剥離するために使用されます</td></tr></tbody></table>

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

内皮細胞は細胞間ストレスやトラクションを生成するために確立されているが、内皮細胞間ストレスおよびトラクション生成におけるギャップ接合が果たす役割は現在知られていない。そこで、我々は、公知のCx43阻害剤2,5−ジヒドロキシカルボン(カルコン)にコンフルエント内皮単層を露出することにより、ギャップ接合コネクシン43(Cx43)が内皮バイオメカニクスに及ぼす影響を調べるための力学ベースのプロトコルを提示する。この阻害剤がトラクションおよび細胞間ストレスに与える影響を測定する。我々は、対照と比較した場合、高いカルコーン投与量(2 μg/mL)の下でトラクションと細胞間ストレスの両方の減少を示す代表的な結果を提示する。このプロトコルは、Cx43だけでなく、適切な阻害剤が使用されると仮定して、他のギャップジャンクションにも適用できます。このプロトコルは、心臓血管およびメカノバイオロジー研究の分野で有用であると考えています。

対照の相コントラスト画像は、0.2 μg/mL、および2μg/mLカルコーン処理単層を、カルコーン処理の30分前(図1A-C)およびカルコーン処理後2時間後に撮影した(図1D-F)。細胞誘導ビーズ変位(μm)は、HUVEC単層を対照した場合に低用量カルコーンおよび高用量カルコーン条件の両方で減少することが観察された(図2E,F)。カルコーン処理の前に、rmsトラクションは、すべての条件について約51±8 Pa(図3A-C)であった。カルモン処理後、低用量カルコーン処理単層(<strong class="xfig...

ここでは、ギャップ接合コネクシン43を破壊する力学ベースのプロトコルを提示し、トラクションと細胞間応力の観察を通じて内皮バイオメカニクスに及ぼすその後の影響を測定する。

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

このプロトコルは、例えば創傷治癒や癌転移などの多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて細胞力が果たす役割の解明を可能にするので重要である。この力学ベースの技術の主な利点は、同時に細胞と細胞の接合を中断し、細胞生成力、主に牽引力と細胞間ストレッサーへの影響を測定する能力です。私たちのプロトコルは、例えば癌転移、アテローム性動脈硬化症、高血圧などの広範な病態生理学的プロセスに適用可能である。当社の方法は、臓器オンチップモデル、バイオエンジニアリング組織構築物、インビトロドラッグデリバリーシステム、および組織共培養システムを使用して、生化学的およびバイオメカニカル分析を実行するために統合することができます。私たちのプロトコルは、実行するかなり簡単です。しかし、私たちは、このプロトコルを初めて行う人は忍耐を持ち、このプロトコルのステップを急いでいないことをお勧めします。私たちのプロトコルには、初めてのユーザーには明らかではないユニークなステップがあります。したがって、ユーザーは、私たちの書面によるステップバイステップの手順に従い、目視デモンストレーションをガイダンスとして使用することをお勧めします。まず、200ミリリットルの超純水と80マイクロリットルの酢酸と50マイクロリットルのシランメタクリレートを混合して、ブラインドシラン溶液を調製します。ビンスシラン溶液を攪拌プレートで少なくとも1時間撹拌します。ペトリ皿の中央をよく、バインドシラン溶液で45分間処理します。バインドシラン溶液を取り除き、ペトリ皿を超純水で2~3回洗い流します。ペトリ皿表面を乾かして、将来の使用のために室温で保管してください。ヒドロゲル溶液を調製するには、12.49ミリリットルの超純水を2.062ミリリットルの40%アクリルアミド、375マイクロリットルの2%ビサクリアミドを15ミリリットルの遠心チューブに混ぜます。80マイクロリットルの蛍光ビーズをヒドロゲル溶液に加えます。チューブを軽く振って、ビーズとゲル溶液を混ぜます。キャップを遠心管に緩めておき、真空チャンバーに入れます。ゲル溶液を真空チャンバ内で少なくとも45分間脱ガスする。ヒドロゲルを重合するには、まず10%の過硫酸アンモニウムの75マイクロリットルを加え、次に8マイクロリットルのTEMEDをヒドロゲル溶液に加えます。ペトリ皿の中央にヒドロゲル溶液の24マイクロリットルを置きます。18ミリメートルのカバースリップでヒドロゲルを押してヒドロゲルを平らにし、約100マイクロメートルの高さを作ります。ゲル重合のために少なくとも30〜40分待ちます。ゲル脱水を防止するために、超純水に重合ヒドロゲルを沈下します。ペトリ皿にアルミホイルを覆い、蛍光ビーズの光の吹き出しを防ぎ、摂氏4度で保存します。まず、50ミリリットルの遠心管に20対1の比率で、PDMSシリコーンベースをシリコーン硬化剤と混合します。チューブを逆さまに反転し、PDMS溶液の適切な混合を確実にするために何度も激しく振ります。PDMS溶液中の気泡を190回G.Pourで1分間1分間遠心して取り除き、PDMS溶液を100ミリメートルペトリ皿の中央に5~6ミリリットル流し、PDMS溶液がペトリ皿表面全体を覆うまで攪拌します。PDMS溶液を摂氏50~60度で一晩硬化させます。次に、穴パンチャー付きの直径16ミリメートルの円形PDMSステンシルを取り外します。PDMS ステンシルに小さな穴を作成するには、直径 1.25 ミリメートルの生検パンチを使用します。PDMSステンシルを70%エタノールに2〜3分間浸し、余分なエタノールを吸い取り、5分間UV光の下に置いて殺菌します。余分な液体を吸引し、ヒドロゲルからカバースリップを取り除きます。PDMS ステンシルをハイドロゲル表面に配置し、ピンセットを使用して PDMS ステンシルに光圧を適用し、PDMS ステンシルとハイドロゲル表面の間に水密シールを確保します。ハイドロゲルの表面を、1~1,000の濃度で0.1モルHEPESバッファー溶液に溶解し、8分間36ワットの電力を持つUVランプの下にヒドロゲルを置きます。余分なスルフォ-SAMPAとHEPES溶液を吸引し、ヒドロゲルを0.1モルHEPESで2回リンスし、続いて超純水でさらに2リンスを加えます。余分な超純水を吸引し、200マイクロリットルのピペットを使用して、コラーゲン-1の1ミリリットル当たり0.1ミリグラムでヒドロゲルをコーティングします。蛍光ビーズを光漂白から保護するために皿を覆い、ハイドロゲルを摂氏4度で一晩保管します。次に、フラスコに1Xトリプシンを3ミリリットル加え、37°Cのインキュベーターに3〜5分間置き、組織培養フラスコから細胞を取り外します。トリプシン化後、フラスコに3ミリリットルの細胞培養培地を加え、渦巻いて混合し、混合物を15ミリリットルの遠心分離管に移します。細胞溶液を1、710倍のG.吸上術で3分間遠心し、培地中の細胞を1ミリリットル当たり4個の細胞に50倍の濃度に再懸濁する。冷蔵庫からヒドロゲル皿を取り出します。コラーゲン-1をヒドロゲルから取り出し、PBSで1回リンスします。PDMSステンシルの上部に3番目のセルに75倍の10を加え、37°Cと5%の二酸化炭素でインキュベーターで少なくとも1時間ヒドロゲル表面に細胞を取り付けることができます。PDMS ステンシルを削除し、10X トリプシンの PDMS ステンシルを 10 ~ 15 秒間水没させ、接続されているセルを削除します。ペトリ皿に少なくとも2ミリリットルの培地を加え、70%エタノールを噴霧してステンシルを殺菌し、UV光の下に5分間置きます。ペトリ皿をインキュベーターに少なくとも36時間置くか、またはコンフルエント単層が観察されるまで置く。カルコン処理の30分前及びカルコン処理の2時間後の位相コントラスト画像を比較した。細胞誘導ビーズ変位は、コントロールHUVEC単層と比較した場合、低用量カルコンおよび高用量カルコン条件の両方で減少することが観察された。カルコン処理の前に、RMSの牽引は、すべての条件のための約51パスカルでした。カルコン処理後、低用量カルコン処理単層では59パスカルへのRMSトラクションがわずかな増加し、制御と比較して高用量カルコン処理単層では18パスカルにRMSトラクションがほぼ2倍減少した。カルコン治療は、低用量で平均正常な正常な細胞間ストレスの大きさを増加させたが、対照と比較して高用量で平均正常な細胞間ストレスの大きさを有意に減少させた。カルコン治療はまた、コントロールと比較して低および高カルコン濃度の両方で最大の完全な細胞間ストレスを減少させる。カルコン処理の影響は、T検定と単因子ANOVA試験の両方に基づいて統計的に有意です。PDMS ステンシルをゲルの上に置きながら、ゲルが十分に乾燥して PDMS ステンシルとゲルの間に水密シールが付くようにしてください。このプロトコルは、細胞-細胞接合、細胞骨格タンパク質、細胞マトリックス接着分子、または細胞外分子の生体力学的寄与を生画像化でプローブするためにも適用することができる。このin vitroプロトコルを使用すると、研究者は、動物モデルのない組織修復、創傷治癒、または癌転移中の生化学的特性だけでなく、生体機械のホストを調査することに成功しました。これらの薬物の吸入は有害であると報告されているので、我々は、我々は、カルコンとDMSOを扱っている間、非常に注意するように視聴者に助言します。

perturbing-endothelial-biomechanics-via-connexin-43-structural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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