Name: 小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2-O-メチルRNAの検出の改善 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶ小型RNA-seqプロトコルによるバイアス低減と2'-O-メチルRNA検出感度向上の手法。自作試薬または市販キットを使用し、植物微小RNAなど多様なRNAタイプの正確な解析を実現します。

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この研究は、国立科学研究センター(CNRS)、フランス代替エネルギー・原子力委員会(CEA)、パリ・スード大学によって支援されました。本研究のための全ての図書館準備、イルミナシーケンシングおよびバイオインフォマティクス分析は、I2BC次世代シーケンシング(NGS)施設で行われました。I2BC NGS施設のメンバーは、原稿の批判的な読み取りと有用な提案のために認められている。

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</ol>

著者は何も開示していない。

小さなRNAライブラリーの準備は、主にアダプタライゲーションステップ中に導入されるバイアスのために困難なままです。植物miRNA、昆虫、線虫および哺乳類のpiRNA、昆虫および植物における小さな干渉RNA(siRNA)のような3'末端に2'-OMe修飾を伴うRNAは、2'-OMe修飾が3'アダプターリゲーションを阻害するので、特に研究が困難である。sRNAライブラリー調製プロトコルを改善するために多くの解決策が文献に提案されているが、市販されているキットのほとんどは依然として、深刻なバイアスを有する古典的なTSプロトコルに基づいている。しかし、ライゲーション反応にランダム化されたアダプターとPEGを備えたNfキットを含むいくつかの「低バイアス」キットが存在し、アダプタライゲーションを完全に回避するいくつかのキットが最近登場しました12。我々は以前、Nfが標準的なTSプロトコルよりも異なるmiRNAを検出することを報告したが、プロトコル'S'(アダプタライゲーションなし)は、副産物12の有意な形成のために比較的不十分に行われた。驚くべきことに、...

小さなRNA(sRNA)は、生物学的プロセス1の多様性の制御に関与している。真核生物調節sRNAは、通常、サイズが20〜30 ntの間です。主な3つのタイプは、マイクロRNA(miRNA)、ピウィ相互作用RNA(piRNA)、小干渉RNA(siRNA)です。異常なmiRNA発現レベルは、様々な疾患2に関与している。これは、健康と病気におけるmiRNAの重要性と、sRNA全般を検出するための正確で定量的な研究ツールの要件を強調しています。
次世代シーケンシング(NGS)は、sRNAを研究するために広く使用されている方法です。定量的PCRやマイクロアレイ技術(qPCR)などの他のアプローチと比較したNGSの主な利点は、sRNA配列の事前知識を必要としないため、新しいRNAを発見するために使用できることであり、さらに、より少ないバックグラウンド信号と彩度効果。さらに、単一ヌクレオチドの違いを検出でき、マイクロアレイよりも高いスループットを有する。ただし、NGS にはいくつかの欠点もあります。シーケンス実行のコストは比較的高く、サンプルをシーケンス用ライブラリに変換するために必要なマルチステップ プロセスによってバイアスが発生する可能性があります。典型的なsRNAライブラリー調製プロセスでは、3'アダプターは、ATPが存在しない場合に、RNAリガーゼ2(RNL2)の切り捨てられたバージョンと予備の3'アダプター(図1)を使用してsRNA(多くの場合、全RNAからゲル精製)にライゲーションされます。これにより、sRNAアダプタライゲーションの効率が向上し、sRNAの循環化や連結などの副反応の形成が減少します。続いて、5'アダプターをRNAリガーゼ1(RNL1)によってライゲーションし、続いて逆転転写(RT)およびPCR増幅を行う。これらのステップはすべて、バイアス3,4を導入する可能性があります。したがって、読み取り数は、人工的な、方法依存性発現パターンにつながる実際のsRNA発現レベルを反映しない場合があります。特定の sRNA は、ライブラリ内で過剰または過小表現され、厳密に表現されていない sRNA が検出を逃れる可能性があります。この状況は、特に植物miRNA、昆虫および植物のsiRNA、および昆虫、線虫および哺乳動物におけるpiRNAで、3'末端ヌクレオチドが2'-O-メチル(2'-OMe)修飾1を有する。この修飾は、3'アダプタライゲーション5を強く阻害し、これらのタイプのRNAに対するライブラリー調製を困難な作業にする。
以前の研究は、アダプタライゲーションがRNA配列/構造効果6、7、8、9、10、11に起因する深刻なバイアスを導入することを実証しました。逆転写やPCRなどのアダプタライゲーションの下流のステップは、バイアス6、11、12に有意に寄与しない。ライゲーションバイアスは、特定の配列を有するアダプタ分子が反応混合物中のsRNA分子と相互作用して共折を形成し、ライゲーションに有利または好ましくない構成を引き起こす可能性があるという事実に起因する可能性が高い(図2)。Sorefan et al7のデータは、RNL1 が単一の孤立したコンテキストを好む一方、RNL2 がライゲーション用の二本鎖を好むことを示唆しています。アダプター/sRNA 共折構造が特定のアダプターと sRNA シーケンスによって決定されるという事実は、特定の sRNA が特定のアダプター・セットで過剰または過小表現される理由を説明します。また、一連の sRNA ライブラリー内で比較する場合は、同じアダプタシーケンスを使用する必要があることも重要です。実際、異なるバーコードシーケンスの導入によってアダプタを変更すると、シーケンスライブラリ9、13のmiRNAプロファイルが変更されることが以前に観察されています。
ライゲーションジャンクション付近のアダプタシーケンスのランダム化は、これらのバイアスを減らす可能性が高いです。Sorefanたちは、4つのランダムなヌクレオチドを持つアダプターを四肢に使用し、「高精細」(HD)アダプターと指定し、これらのアダプターを使用すると、真のsRNA発現レベルをよりよく反映するライブラリにつながることを示した。より最近の研究は、これらの観察を確認し、無作為化領域がライゲーション接合部11に隣接する必要がならないことを明らかにした。この新しいタイプのアダプターは"MidRand"アダプターと名付けられました。これらの結果を組み合わせることで、アダプターの設計が改善され、バイアスが軽減される可能性が示されています。
アダプターを変更する代わりに、反応条件の最適化によってバイアスを抑制できます。ポリエチレングリコール(PEG)は、ライゲーション効率14を高くすることが知られている高分子群集剤であり、バイアス15、16を有意に減少させることが示されている。これらの結果に基づいて、いくつかの「低バイアス」キットが市場に登場しました。これには、古典的なアダプターまたは HD アダプターと組み合わせて、ライゲーション反応に PEG を使用するキットが含まれます。他のキットは、ライゲーションを完全に回避し、それぞれ12'と5'アダプタの追加のための3'ポリアデニル化とテンプレート切り替えを使用します。さらに別の戦略では、3' アダプターライゲーションに続いて循環ステップが続き、5' アダプターライゲーション17を省略します。
前回の研究では、バイアスの可能な限り低いレベルと2'-OMe RNA12の最良の検出を持つsRNAライブラリー調製プロトコルを検索しました。上記の「低バイアス」キットのいくつかをテストし、標準プロトコル(TS)よりも2'-OMe RNAの検出が優れています。しかし、驚くべきことに、修正時(無作為化アダプターの使用、ライゲーション反応におけるPEG、精製による余分な3'アダプタの除去)は、後者が2'-OMe RNAの検出のための他のプロトコルを上回った。ここでは、2'-OMe RNA の全体的な検出が最も優れた TS プロトコル 'TS5' に基づくプロトコルについて詳しく説明します。プロトコルは、TSキットの試薬と'Nf'キットの試薬1つを使用して、または同等の性能を持つ自家製試薬を使用して、お金を節約することができます。また、総RNAからのsRNAの精製と、3'アダプターの準備のための詳細なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>2100バイオアナライザー機器&nbsp;</td><td>アジレント</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>酸フェノール:クロロホルム、pH 4.5 (IAA と、125:24:1)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸 (ATP)</td><td>Nex England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>バイオアナライザー 高感度 DNA キット</td><td>アジレント</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>バイオアナライザー スモール RNA キット</td><td>Agilent</td><td>5067-1548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X 遠心分離管フィルター</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8162-96EA</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader トランスイルミネーター</td><td>各種サプリメント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStart PCR Kit, with dNTPs</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-5132-05</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>Novex TBEゲル6%</td><td>ThermoFisher</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex TBE尿素ゲル15%</td><td>ThermoFisher</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>QIAquickヌクレオチド除去キット</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 定量スターターキット</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33227</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q10212</td><td></td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor, Murine&nbsp;</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 逆転写酵素</td><td>ThermoFisher</td><td>18090200</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0242S</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 50 bp DNAはしご</td><td>ThermoFisher</td><td>10488043</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012/24/36/48</td><td>オプション</td></tr><tr><td>UltraPure グリコーゲン</td><td>ThermoFisher</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>ZR small RNA ladder</td><td>Zymo Research</td><td>R1090<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">最後の2つの数字はインデックスのセットに対応しています</td></tr></tbody></table>

小型rna-seqの改善:バイアスの減少と2'-o-メチルrnaの検出の改善

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

次世代シーケンシング(NGS)による小型RNA(sRNA)の研究は、図書館準備中のバイアス問題に挑戦しています。植物マイクロRNA(miRNA)のようないくつかのタイプのsRNAは、3'末端ヌクレオチドで2'-O-メチル(2'-OMe)修飾を運ぶ。この変更は、3' アダプターのライゲーションを阻害するので、別の難しさを追加します。以前に、'TruSeq(TS)プロトコルの変更バージョンはバイアスが少なく、2'-OMe RNAの検出が改善されたことを実証しました。ここでは、最高の全体的なパフォーマンスを示したプロトコル'TS5'を詳細に説明します。TS5は、同等の性能を持つTSキットの自家製試薬または試薬を使用して従うことができます。

重要なステップは、開始総RNA材料(図3)および所望の最終ライブラリー産物(図4)の小さなRNA分率の単離である。両方のステップは、ポリアクリルアミドゲル精製を含みます;小さなRNAは15%TBE尿素ゲルから単離され、最終ライブラリーは6%天然TBEゲルから単離されます。ゲルから単離された小さなRNAは、小さなRNA毛細血管電気泳動チップ(材料の表;図 3B)これにより、ユーザーは回収された小さなRNAの量と調製中のmiRNAの割合を推定できるようになります。
最終ライブラリー産物のゲル精製は、所望のライブラリの近くに移行する多数の追加製品が形成されるにつれて微妙なステップである。これは、アダプタダイマーなどの他の種でライブラリを汚染するリスクを増加させるので、ゲルを過負荷にしないことが重要です。例として(<strong class="x...

我々は、標準的な方法よりもバイアスが少ない詳細な小さなRNAライブラリー修復プロトコルと2'-O-メチルRNAの感度の増加を提示する。このプロトコルは、コストを節約するために自家製試薬を使用するか、便宜上キットを使用して従うことができます。

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

小さなRNAは多くの生物学的プロセスを調節する。したがって、それらを検出するために敏感で公平な方法を開発することが重要です。プロトコルプロトコルは、この目標に向けて前進するステップを提供します。私たちのプロトコルは、古典的な小さなRNAライブラリの割り当て方法よりも少ないバイアスの問題に苦しんでおり、重要なことに、2つのプロングまたはメソRNAのより敏感な検出を可能にします。植物マイクロRNAなど。標準的なプロトコルに従って総RNAを抽出した後。15%TBE尿素ゲルを200ボルトで15分間プレランします。そして、200マイクロリットルチューブに同量のホルムアミドローディング染料を使用して、5〜15マイクロリットルのボリュームで、総RNAの5〜20マイクログラムを混合します。摂氏65度で5分後、加熱された蓋をしたサーモサイクラーで、チューブを氷の上に置き、後者を直接に入れ、後者をロードし、その間に少なくとも1車線のゲルをサンプルします。その後、ブロモフェノールがゲルの長さの約3分の2を移行するまで、ゲルを200ボルトで実行します。RNAをロードするには、まずヌクレアーゼの底を21ゲージ針で、ヌクレアーゼフリー0.5ミリリットルマイクロ遠心分離管で穿刺し、2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブをヌクレアーゼフリーラウンドボトムに入れる。次に、インキュベートし、インカリン酸ゲル染色を水に入れ、10~15分間、トランイルミニューエーターでゲルを見る前に行います。サンプルRNAを17~29ヌクレオチドラダーバンドの間で切り取り、ゲル片を穿刺チューブに移します。最高速度でマイクロ遠心分離機でゲルを2分間回転させ、空にするはずの0.5ミリリットルチューブを取り除きます。砕いたゲルに300マイクロリットルのヌクレアーゼフリー0.3モル塩化ナトリウムを加え、室温で少なくとも2時間回転子にチューブを置きます。インキュベーションの終わりに、粉砕したゲル片をスピンカラムに、遠心分離機をマイクロ遠心分離機で最高速度で2分間転送します。非合せの3つのプライムアダプター除去のために、抽出されたRNAサンプルと10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を十分に混合し、3つのモル酢酸ナトリウムの6マイクロリットルを混合して混合する。40マイクロリットルの磁気精製ビーズを加え、60マイクロリットルのイソプロパノールをサンプルに完全に混合します。そして、室温で5分間懸濁液をインキュベートします。インキュベーションの最後に、溶液が明らかになるまで、サンプルを磁気ラックの上に置きます。透明な上清を取り除き、180マイクロリットルの作りたての80%エタノールをビーズに加えます。30秒後、エタノールを取り除き、チューブを短時間回転させます。チューブの底部に回収した残留液を取り除き、ビーズを2分間乾燥させてから、サンプルを22マイクロリットルの10ミリモルトリスで再懸濁させます。2分後に溶液が透明になるまでサンプルを磁化します。次に、20マイクロリットルの透明上清を新しいチューブに3マイクロリットルの酢酸モルナトリウム6マイクロリットルと混合し、40マイクロリットルの磁気ビーズと60マイクロリットルの100%イソプロパノールを加えます。室温で5分後、上清を取り除く前に、溶液が透明になるまでサンプルを磁化します。180マイクロリットルの新しく調製した80%エタノールを30秒間処理してから、エタノールを取り除き、サンプルの底部に溜まった残留液を除去します。ビーズを2分間乾燥させた後、溶液が明らかになるまでサンプルを磁化する前に、10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で再懸濁します。次に、9マイクロリットルの上清を新しいチューブに移し、T4 RNAリガーゼバッファーのマイクロリットルを1マイクロリットル、水の1つをサンプルに加えます。ゲル精製の場合、約1時間、ネイティブ 6%TBE ゲルで PCR 産物を 5、10、および 20 マイクロリットルずつ実行します。完成したゲルを水中の核酸ゲル染色で10~15分間インキュベートし、150塩基対ライブラリーバンドの抽出を可能にするトランイルミエーターでゲルを見る。それらを表す150ベースペアバンドを分離することは困難であるため、これらは私たちのライブラリであり、密接に移行する副産物の存在のために、ゲルを非常に慎重に切断する必要があります。次に、ちょうど実証したようにRNAを分離します。生シーケンスファイルの変更については、シーケンス実行中に生成された fastq シーケンスファイルをダウンロードし、必要に応じて bcl2fastq2 を使用してプレフォームデマルチプレアフィクスを行います。cutodapt を使用してアダプタシーケンスを削除し、デモンストレーションに示すようにコマンドを使用します。配列読み取り中の末端ランダムヌクレオチドを除去するために指示されたseqtkを使用する。次に、指示されたとおりにawkコマンドを使用して、10ヌクレオチドより短い配列を廃棄する。トリミングされたシーケンスをマップするには、miRBaseを開き、成熟したfaファイルをダウンロードします。U残基をT残基に置き換えるコマンドを使用して、様々な生物から発生するデータベース内のすべてのマイクロRNAの完全なリストを生成する。目的の生物のマイクロRNA配列を、指示に示されたコマンドで選択し、bowtie2を使用して読み取りをファイルにマッピングし、不一致を許さない。このツールを使用してシーケンス読み取りをデータベースに位置合わせし、読み取りはデータベースのマイクロRNAに完全にマップし、不一致を示すとおりにマッピングする必要があります。次に、このコマンドを使用して、整列しなかった読み取りを破棄します。PCR増幅ライブラリの量を増加させた後、示されているように、期待サイズに対応する製品を抽出することができます。溶出後、精製されたライブラリーは毛細管ゲル電気泳動チップ上で確認することができる。期待される150塩基対産物に加えて、アダプターダイマーに対応する130塩基対種の割合を増加させ、典型的にはPCR産物の増加量がロードされるように観察される。同様の結果は、合成小RNAの混合物からライブラリーをキット、または他の供給からの試薬を使用して調製されたときに得られる。比較のために、同じ小さなRNAミックスに対して以前に公表された結果が示される。ここで、非修飾ヒトと2つの素数O-methal改変植物マイクロRNAの検出のための標準TSプロトコルを用いたプロトコルTS5の性能の比較が示されている。ヒト試料中の2つの素数O-メタール改変piRNAの検出も試験した。観察されたTS5としては、2つの素数のO-methal RNAの検出に対してTSよりもかなり優れたが、未改変RNAについては得られなかった。各サンプルの複製ライブラリを異なる日付で準備します。通常、同時に作成された複製の間にほとんどばらつきがないか、異なる日付に準備されたライブラリ間で大きなばらつきが生じ得る。

improving-small-rna-seq-less-bias-better-detection-2-o-methyl

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。...

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化キイロショウジョウバエ

MicroRNA(miRNA)は、広く保存された調節分子のクラスです。ここでは、2つの強力なライゲーションステップとそれに続くハイスループットシーケンシングに依存するmiRNAクローニング法について説明します。私たちの方法は、miRNAの正確なゲノムワイド定量を可能にします。...

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

インデックス化されたcDNAライブラリの調製、カスタムプローブによるハイブリダイゼーションとキャプチャ、および遺伝子発現、突然変異、および遺伝子融合のための選択された転写物を調べるためのデータ解析を含む、標的RNAシーケンシングベースの方法について説明します。Targeted...

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々...

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

このプロトコルは、複数のモデル生物における転写の忠実度を監視する新しいツールと研究者を提供します。...

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

ここでは、RNAのDNAzyme依存性切断に関するプロトコルを提示する。これにより、RNA...

rRNA 2'-O-メチル化のDNAzyme依存性分析

ここでは、小型RNAを分離し、マイクロRNAを強化し、ハイスループットシーケンス用のサンプルを準備するためのステップバイステップの戦略について説明します。次に、オープン ソース ツールを使用して、シーケンスの読み取りを処理し、マイクロRNA...

MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

ここでは、cDNA中間体を使用せずに短いRNA(ランあたり&lt;35...

2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法

ゲノム規模でのRNA編集イベントの迅速な検出と信頼性の高い定量化は依然として困難であり、現在は直接RNAシーケンシング法に依存しています。ここで説明するプロトコルは、RNA編集を検出するための簡単で迅速でポータブルな方法として、微小温度勾配ゲル電気泳動(μTGGE)を使用しています。...

RNA編集の迅速な検出のためのノンシーケンシングアプローチ

Absolute quantification RNA Sequencing (AQRNA-seq) は、生物学的混合物中のすべての低分子 RNA の状況を定量するために開発された技術です。ここでは、AQRNA-seqのライブラリー調製とデータ処理の両方のステップを実証し、飢餓誘発性休眠中の Mycobacterium bovis...

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

このプロトコルにより、バイオインフォマティクスの経験が限られているウェットラボ生物学者のためのRNA-seq実験の初期品質管理が可能になります。...

Rup(RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - 真核生物におけるバルクRNA-seq実験の品質管理

学ぶ小型RNA-seqプロトコルによるバイアス低減と2'-O-メチルRNA検出感度向上の手法。自作試薬または市販キットを使用し、植物微小RNAなど多様なRNAタイプの正確な解析を実現します。

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

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