Name: 流出ポンプの阻害による造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の流れ細胞測定評価の精度向上 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶ 造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の正確な評価法。ベラパミルを用いて流出ポンプを阻害し、TMRM蛍光染料による流れ細胞測定の精度を向上させる手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、伊藤研究室、特に伊藤健・佐藤H、アインシュタイン幹細胞研究所のコメントとアインシュタイン流動細胞法および分析イメージングコア施設(国立がん研究所助成金P30 CA013330)の全メンバーに感謝します。実験を行うのを助ける。K.I.は、国立衛生研究所(R01DK98263、R01DK115577、R01DK100689)およびアインシュタイン単一細胞ゲノミクス/エピゲノミクス(C029154)のコアディレクターとしてニューヨーク州保健省からの助成金によってサポートされています。伊藤さんは白血病・リンパ腫学会の研究員です。

ここに記載されているすべての方法は、アルバート・アインシュタイン医科大学の機関動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. ソリューションの準備
<ol><li>染色バッファー(リン酸緩衝生理食塩基質(PBS)+2%胎児ウシ血清(FBS)):無菌PBS溶液の500mLにFBSの10 mLを追加します。 注:この溶液は、無菌状態で少なくとも1ヶ月間4°Cで保存することができる。次の手順を開始する前に、この溶液のアリコート(50 mL)を氷の上に置きます。</li>
	<li>ACK(塩化アンモニウム-カリウム)のライシングバッファー:手順を開始する前に、氷上にACKライシングバッファー(1 mL)のアリコートを置きます。 注:同じ非市販バッファーを調製するには、NH4Cl の 8.02 g、KhCO3の 1 g、および Na2EDTA の 37.2 mg を H2O の 1 L で溶解し、pH を 7.2-7.4 に調整します。室温で最大6ヶ月間保管してください。</li>
	<li>培養培地:造血細胞の培養および増殖のための無血清培地に50 ng/mL幹細胞因子(SCF)および50 ng/mLトロンボポエチン(TPO)を添加する(市販培地推奨材料表参照)。</li>
	<li>TMRMストック溶液:エタノールの10 mLにTMRM粉末の5 μgを溶解することにより、TMRM(1 μM)溶液を調出します。この溶液は、光から保護された-20 °Cで保存します。</li>
	<li>ベラパミルストック溶液:エタノールの1mLでベラパミルの24mgを希釈することにより、ベラパミル(50mM)溶液を調調します。この溶液を-20°Cに保存します。</li>
	<li>FCCPストック溶液:エタノールの1mLで254mgを溶解することにより、炭酸シアン化物p-トリフルロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)(1M)溶液を調製する。この溶液は、光から保護された-20 °Cで保存します。</li>
</ol>2. 骨髄分離
<ol><li>制度ガイドラインに従ってCO2吸入によりマウスを安楽死させ、70%エタノールでマウスにスプレーする。 注:このステップは実験結果を損なうことなく目的の細胞の汚染を防ぐ。</li>
	<li>鉗子と鋭いはさみを使用して、マウスの腹部の皮膚に小さなスニップを作り、皮膚を伸ばします。</li>
	<li>大腿骨と脛骨を抽出し、骨髄細胞を大量に含む大腿骨の頭部を外さないように注意してください。取り除いた骨を1.5 mLの染色バッファーで満たされた6ウェルプレートに入れます。 注:このプロシージャは生殖不能区域を要求しない。</li>
	<li>骨から筋肉を取り除き、骨の両端を切り取り、骨髄の出口を可能にする(図1A)。洗浄された骨を1.5mLの染色バッファーで新しい井戸に入れなさい。 注:筋肉や他の組織は、次のステップで注射器の詰まりを避けるために慎重に除去する必要があります。</li>
	<li>25Gの針で3 mL注射器を使用して骨髄を洗い流します。 注:骨が白くなるまで骨髄を洗い流し続けます(図1B)。</li>
	<li>1.5 mLチューブ内のすべての細胞を集め、180 x gで5分間遠心分離機を回収し、上清を廃棄する(図1C)。</li>
	<li>300μLの氷冷ACKライシングバッファーでペレットを再懸濁し、1mLの染色バッファーを添加して氷上に1分間置き、直ちに不活性なライシスを加える。180 x gで5分間遠心分離機。 注:細胞ペレットは白く見えます(図1D)。単離された細胞の総数は約2-4 x 107である。</li>
	<li>セルストレーナーキャップ(12 x 75 mm 2、5 mL)を用いて1mLの染色バッファーとフィルターでペレットを再ステージングし、35μmナイロンメッシュを組み込んで単核細胞を得た。ブロッキング後、サンプルを氷の上に保管します。</li>
</ol>3. HSC検出のための免疫染色
<ol><li>リネージュ(リン)カクテルを準備します。染色バッファーの400μLで、CD3eに対して以下のビオチニル化抗体の4μLを加え、CD4、CD8、B220、CD11b、Gr1、Ter19、CD19、Nk1.1、IgMおよびIl7Raを最終希釈1:100を得る。</li>
	<li>蛍煙素共役抗体(Abs)を調製する。染色バッファーの400μLで、以下のAbsの4μLを加えて最終希釈1:100を得る。ストレプトアビジンパシフィックブルー、Sca1-PE/Cy7、c-kit-APC/Cy7、CD48-APC、CD150-PerCP/Cy5.5およびCD34-FITC。光から守り、氷の中に入れなさい。</li>
	<li>180 x gで5分間サンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。</li>
	<li>細胞ペレットに400μLのリンカクテル溶液を添加する。CD135-ビオチニレートされたAb.Vortexの4 μLを素早く加え、氷の中で30分間混合し、インキュベートします。</li>
	<li>染色バッファーの3 mLを加えてサンプルを洗浄し、180 x gで5分間スピンダウンし、上清を廃棄します。</li>
	<li>Abs溶液の400 μLを追加します。渦は、氷の上で30分間混合し、インキュベートするために迅速に。</li>
	<li>3 mLの染色バッファーでサンプルを洗浄し、180 x gで5分間スピンダウンし、上清を廃棄します。</li>
</ol>4. TMRM染色
<ol><li>TMRM染色液を調出す。TMRMストック溶液の2.2 μLとベラパミルの1.1 μL(それぞれ最終濃度として2nMおよび50 μM)を、培養および血清細胞の膨張のための無血清培地の1.1 mLにTPOを加える(市販培地推奨材料表参照)と SCF。 注:これはプロトコルの最も重要な手順です。ベラパミル添加は、HSCで高度に発現し、TMRMを押し出すことができる流出ポンプをブロックするために必要です。</li>
	<li>TMRM染色溶液の1mLで骨髄を再中断し、ボルテックスを迅速に、37°Cで1時間インキュベートする。 注:TMRM染色は洗い流してはならない。PE専用補償制御もTMRM染色溶液の100μLで再懸濁し、迅速な渦後37°Cで1時間インキュベーションを行った。</li>
	<li>フローサイトメーターの目詰まりを避けるために組み込まれた35 μmナイロンメッシュを使用して、セルストレーナーキャップ(12 x 75 mm 2、5 mL)を使用してサンプルをフィルタリングします。 注:TMRM染色は、試料中の詰まり形成の可能性を増加させる。流れアッセイの直前のサンプルの濾過をお勧めします。</li>
	<li>4',6-ジアミド-2-フェニリンドール(DAPI)の1 μLを加え、フローサイトメトリーによって死細胞を排除する。</li>
</ol>5. フローサイトメーターによる取得
<ol><li>骨髄サンプルを実行し、少なくとも 1 x 106 イベントを取得します。</li>
	<li>
異なる人工集団を識別するためにゲーティング戦略を設定します (図2)。
	<ol>
<li>生きた骨髄単核細胞(BM-MNC)、DAPI−画分、CD135−リン−(Lin−)およびLin+画分を同定するための太平洋青色のプロットで表示する。 </li>
		<li>プロットリン- APC/Cy7(c-kit)対PE/Cy7(Sca-1)の分数をプロットし、多能性前駆子(MPP)画分をc-kit+およびSca-1+として識別する。</li>
		<li>APC (CD48) 対 PerCP/Cy5.5 (CD150) の MPP 分率をプロットして、HSC 分数を CD150+および CD48-として識別します。</li>
		<li>CD34-HSC と CD34+-HSC を分割するには、FITC (CD34) の HSC 分数を表示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各母集団で TMRM 強度(PE チャネル)を取得します。</li>
	<li>得後、1mMの最終濃度を得るためにFCCPのサンプル1 μLを加え、37°Cで5分間インキュベートし、1 x 106イベントを取得します。 注:FCCPは、Δを散逸するために使用されるミトコンドリアアンカプラーです。TMRM染色が正しく機能することを確認するための実験制御として使用されます。FCCPの投与後、TMRM強度を大幅に低下する必要があります(図3A)。</li>
	<li>すべての BM-MNC の PE の強度によって各母集団の PE の平均強度を正規化するデータを分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells%3A+origins%2C+phenotypes%2C+lineage+commitments%2C+and+transdifferentiations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li>
<li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell%3A+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li>
<li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+a+purified+Tie2%2B+hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+synthesis+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
<li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li>
<li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li>
<li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125(2016).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+and+cyclosporin+A-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ミトコンドリア膜電位測定は、細胞の代謝状態に重要なミトコンドリアの分析と評価の基礎である。ここでは、TMRM染色によるΔの分析のためのプロトコルについて説明する。TMRMは、Δに起因する活性ミトコンドリアに蓄積する細胞透過性蛍光色素であり、そのそれぞれのレベルは、細胞外、細胞質およびミトコンドリア区画10の間の平衡状態のままである。このプロトコルは、テトラメチルロダミン、エチルエステル(TMRE)およびJC-1を含む様々な染料に適合させることができる。適切な染色条件は、正確な結果を達成するために重要です。これらには、光暴露からの保護、適切なインキュベーション時間、一定温度(37°C)および細胞外濃度の維持が含まれます。TMRM色素レベルがまだ完全な平衡に達していない場合、フローサイトメトリープロセスにおけるデータ取得中に染色強度の予期しない変化を検出することができます。したがって、TMRMの推奨染色期間は30分ではなく1時間です(1つのTMRMメーカーのプロトコルで述べたように)。また、色素の安定性を比較するために、サンプルを5分以内に少なくとも2回取得する必要があることも示唆される。</...

造血幹細胞(HSC)は、自己更新、多能性、および血液1、2のすべての細胞を生み出すことができる。細胞代謝は、転写因子、固有シグナルおよび微小環境3、4、5と共に、HSC維持の主要な調節因子である。したがって、ミトコンドリアの機能と品質の適切な制御は、HSCメンテナンス6、7に不可欠です。
ミトコンドリア膜電位(Δ)は、ミトコンドリアの機能性を直接反映するミトコンドリアの評価において重要なパラメータであり、電子輸送鎖におけるプロトンポンプ活性の平衡とFを通るプロトン流量に由来する。1/FO ATP シンタゼス。これらはいずれも、ATP8,9に対するADPの酸素依存性リン酸化に対して(遺伝子発現および基質の利用可能性に応じて)必要である。ミトコンドリアコンパートメントの電子化を利用して、Δを測定するために様々なポテンショメトリック染料が開発されました。そのうちの一つは、テトラメチルロダミン過塩素酸メチルエステル(TMRM)であり、造血幹細胞および前駆細胞11を含む様々な細胞10におけるフローサイトメトリーによるΔμmの測定に広く用いられている。
ミトコンドリア染料は、しかし、これらの細胞の異種生体流出ポンプの高い活性が色素押出12をもたらす可能性があるため、HSCでいくつかの注意を払って使用する必要があります。実際、ローダミン123のようなミトコンドリア染料の押し出しは、研究者がHSC13を分離したり、染料のホエシュトブルーとホーチストレッド14の差動押出を利用してHSCの「側集団」を同定することを可能にしました。15.ATP結合カセットサブファミリーG部材2(ABCG2)トランスポーターの特定ブミグレジンCは、HSPC16におけるMitoTrackerの染色パターンに影響を与えないことも示されている。これらの結果の公表後、異種生物性流出ポンプ阻害剤が存在しない場合にミトコンドリア染料を用いて複数の研究を行い、HSCは低Δμm16のミトコンドリアの数が少ないという印象を広めました。,17歳,18.
しかし最近、流出ポンプの広いスペクトル阻害剤であるベラパミルが、ミトコンドリア染料MitoTracker Green19の染色パターンを有意に改変することが実証された。この不一致は、フミモルジンCがAbcg2に対して非常に選択的であるという事実に起因する可能性が高く、HSCはまた、Abcb1a(フミモルジンCに弱く敏感である)19などの他のトランスポーターを発現する。また、TMRM、ノニルアクリジンオレンジ、ミトトラッカーオレンジ(MTO)などの他のミトコンドリア染料は、ミトトラッカーグリーンと同じパターンを示しています。さらに重要なことは、HSPCの流れサイトメトリックパターンがミトコンドリア質量11に加えてΔを反映していることを観察した。
TMRM色素の摂取量は、ミトコンドリアの負電荷に厳密に依存するが、結果として生じる色素の蓄積は、流出ポンプ20によるその摂取量とクリアランスとの間で一定のバランスにある。HSCと成熟細胞集団との間の異性生物性流出ポンプ発現の違いは、このバランスに影響を与え、偏った結果につながる可能性があります。ベラパミルなどの専用阻害剤の使用は、強力な染料によるΔmの分析において考慮されるべきである。ここでは、専用阻害剤を用いて異種生物生トランスポーター活性を補正するTMRMベースのフローサイトメトリーによる正確なΔm測定のための改変プロトコルについて説明する。

<table><tbody><tr><td>ACK溶解バッファー</td><td>Life Technologies</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>B220-biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD3e-biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-0031-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-biotin</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>553309</td><td></td></tr><tr><td>CD19-ビオチン</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>CD48-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0481-82</td><td></td></tr><tr><td>CD135-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-PerCP/Cy5.5&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>115922</td><td></td></tr><tr><td>c-kit-APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>Cyclosporin H</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1575-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI溶液(1 mg/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gr1-ビオチン</td><td>バイオレジェンド</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>IgM-ビオチン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>13-5790-85</td><td></td></tr><tr><td>Il7R&α;-ビオチン</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td></td></tr><tr><td>Nk1.1-ビオチン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BDB553163</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>SCA-1-PE/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-81</td><td></td></tr><tr><td>SCF マウス</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03-10UG</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM medium</td><td>STEMCELL technologies</td><td>9605</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Pacific Blue</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553672</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5428-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>315-14-10UG</td><td></td></tr><tr><td>ベラパミル塩酸塩</td>ミリ<td>ポアシグマ</td><td>V4629-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

流出ポンプの阻害による造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の流れ細胞測定評価の精度向上

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

細胞代謝は造血幹細胞(HSC)自己再生の重要な調節剤であるため、造血恒常性恒常性におけるミトコンドリアが果たした様々な役割は、HSCの研究者によって広範囲に研究されている。ミトコンドリア活性レベルは、膜電位(Δμm)に反映され、TMRM(テトラメチルロダミン、メチルエステル)などの細胞透過性カチオン染料によって測定することができる。しかし、これらの染料を細胞から押し出す流出ポンプの能力は、その有用性を制限することができます。結果として得られる測定バイアスは、XCを評価する際に特に重要であり、異種生物輸送体は分化細胞よりもHSCにおいて高いレベルの発現および活性を示す。ここでは、流出ポンプ阻害剤であるベラパミルを利用して、複数の骨髄集団にわたってΔを正確に測定するプロトコルについて述べる。ポンプ活性の結果生じる阻害は、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるTMRM強度を増加させ、成熟分画では比較的変化しないままにすることが示されている。これは、Δm依存染料を使用する際に必要な色素流出活性に細心の注意を払っており、書き込みと視覚化に従って、このプロトコルを使用して、骨髄内の異なる集団または同じ集団を正確に比較するために使用できます。異なる実験モデル間で。

上記のプロトコルは、マウスモデルからBM-MNCを容易に分離することを可能にする。図1は、骨分離、骨髄の洗い流し、赤血球溶解、抗体染色、それに続くTMRM染色をまとめ、特定の血清集団におけるミトコンドリア膜電位を測定する。.
BM-MNC には、HSC を含む複数のセル母集団が含まれています。このプロトコルで使用される抗体カクテルは、HSC(CD34−およびCD34+)、多能性前駆細胞(MMP)、Lin−ならびにLin+細胞、それぞれ21の精製において十分に確立されている。 これらの分数を分離するためのゲーティング戦略を図 2に示します。
<strong cla...

ゼノバイオティック流出ポンプは造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)において非常に活性であり、ミトコンドリア膜電位蛍光色素であるTMRMの押し出しを引き起こす。ここでは、流出ポンプ阻害剤であるベラパミルの存在下でTMRMによるHSPCにおけるミトコンドリア膜電位を正確に測定するプロトコルを提示する。

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

ミトコンドリア機能は造血幹細胞の自己再生に重要です。ミトコンドリア活性は、ミトコンドリア膜電位の反射体であり、細胞蛍光性、細胞透過性カチオン色素であるTMRMによって測定することができる。異種性流出ポンプはHSCにおいて高活性であり、TMRM押出を引き起こす。このプロトコルの主な利点は、この効果の補正、エフラックスポンプの阻害剤であるベラパミルを利用することである。マウス大腿骨から骨髄を分離することから始めます。鉗子と鋭いはさみを使用して、2つの後足を切ります。その後、マウスの腹側の皮膚に小さな切り取りを行い、それを伸ばします。大腿骨と脛骨を抽出し、大腿骨の頭部を外さないで、骨を6ウェルプレートに入れ、1.5ミリリットルの染色バッファーで満たします。骨から筋肉を取り除き、骨の端を切り取り、骨髄を出ることができます。洗浄された骨を1.5ミリリットルの染色バッファーで、新しい井戸に入れます。次に、骨が白くなるまで、3ミリリットルの注射器と25ゲージの針で骨髄を洗い流す。1.5ミリリットルチューブ内のすべての細胞を収集し、180倍Gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。慎重に氷冷ACKライジングバッファーの300マイクロリットルにペレットを再中断し、1分間氷の上に細胞を置きます。その後、すぐに1ミリリットルの染色バッファーを添加することによって、ライシスを失活させる。180倍のG.180倍で5分間細胞を遠心分離し、白く見えるはずの細胞ペレットを1ミリリットルの染色バッファーに再懸濁させる。細胞ストレーナーキャップを用いて細胞をフィルターし、35マイクロメートルのナイロンメッシュで、単核細胞を得る。原稿の指示に従って、系統カクテル、およびフルオロフォア共役抗体を準備することから始めます。氷の上に抗体を保持し、光から保護します。次いで、試料をGの180倍で5分間遠心し、上清を捨てる。400マイクロリットルのリネージュカクテルを加え、4マイクロリットルのCD135ビオチン化抗体を細胞ペレットに加え、混合物をボルテックスします。その後、氷の上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、染色バッファーを3ミリリットル加えて、Gの180倍で5分間回転させて上清を捨ててサンプルを洗います。その後、400マイクロリットルの抗体溶液を加え、混合物をボルテックスする。さらに30分間氷の上でインキュベートし、染色バッファーで洗浄を繰り返します。TMRM染色液を調製するには、2.2マイクロリットルのTMRMストック溶液と1.1マイクロリットルのベラパミルを、血栓ポエチンおよび幹細胞因子を用いて1.1ミリリットルの無血清造血培地に添加する。TMRM染色液の1ミリリットルで骨髄を再懸濁し、素早く渦を、摂氏37度で1時間インキュベートする。35マイクロメートルのナイロンメッシュを使用して、フローサイトメーターを詰まらせないように、セルストレーナーキャップを使用してサンプルをフィルター処理します。次に、DAPIを1マイクロリットル加え、フローサイトメトリーを進めます。骨髄サンプルを実行し、少なくとも100万個のイベントを取得します。次に、生きた骨髄単核細胞を太平洋青色のプロットで表示し、CD135 Lin陰極およびLin-陽性画分を同定する。APC/Cy7 対 PE/Cy7 の Lin-負の分率をプロットして、多能性前駆子または MPP 分率を識別します。次に、造血幹細胞またはHSC画分を識別するために、APC対PerCP/Cy5.5のMPP分数をプロットします。FITC または CD34 の HSC 分数を表示して、CD34 マイナス HSC および CD34 正の HSC 分数に分割します。最後に、各集団のTMRM強度を取得します。TMRM染色が正しく機能したことを確認するには、1ミリモルの最終濃度のためにサンプルに1マイクロリットルのFCCPを加え、5分間摂氏37度でインキュベートします。その後、100万のイベントを取得します。FCCPの追加後、TMRM強度を大幅に増加する必要があります。このプロトコルは、TMRM色素を用いて、様々な細胞集団におけるミトコンドリア膜電位の定量化に成功しています。培養培地中のPBSおよびFBSの存在がTMRMシグナル強度に影響を及ぼすことが実証された。そのため、無血清膨張培地でTMRM染色を行うことが重要です。造血幹細胞は、TMRM色素を押し出す異種性流出ポンプの高い活性レベルを発現する。したがって、TMRMプロファイルは、ポンプをブロックするベラパミルまたはシクロスポリンHの存在においても異なります。TMRM染色の精度を検証するために、FCCPはミトコンドリアを脱分極し、TMRM強度を低下させることができる。このプロトコルは、TMREまたはJC-1を含む異なるミトコンドリア膜電位色素を用いてHSCを研究するために容易に適応することができる。ミトトラッカーやミトソックスなどの他のミトコンドリア色素と同様に。骨髄集団の流出ポンプの異なる活性によって受け継がれてきた重大な問題は、つい最近指摘された。したがって、このプロトコルは、以前の知見間の不一致を減らすことを目的としています。

improving-accuracy-flow-cytometric-assessment-mitochondrial-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、JC 1 染料を使用して保護エージェントの有無を低酸素/再酸素化にさらされた後細胞のミトコンドリア膜電位を評価するプロトコルを提案する.

低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ

急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

造血幹細胞(HSPC)は、血液形成中の代謝可塑性による静止状態から分化状態に移行します。ここでは、HSPCのミトコンドリア呼吸と糖状化を測定するための最適化された方法を提示する。...

造血幹細胞細胞代謝の解析

ここでは、生体内培養造血幹細胞およびT細胞におけるミトコンドリア質量および膜電位を測定する信頼性の高い方法について説明する。...

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

代謝適応は、分化、持続性、および細胞毒性を決定するため、T細胞にとって基本的である。ここでは、サイトカイン分化型ヒト初代T細胞の エクスビボ でミトコンドリア呼吸をモニタリングするための最適化されたプロトコールが提示される。...

サイトカイン分化型ヒト初代T細胞におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイムモニタリング

ここで提示された方法は、HSPCの細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)をリアルタイムで測定するために、細胞外フラックス分析装置を使用して、非付着性マウス造血幹および原始前駆細胞(HSPC)における細胞生体エネルギーを評価するための最適化されたプロトコルを要約する。...

細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

この研究では、フローサイトメトリーと2つの蛍光レポーターまたは抗体による二重染色に基づいて複数のミトコンドリア機能パラメーターを測定し、ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、ミトコンドリア呼吸鎖組成、およびミトコンドリアDNAの変化を検出する新しいアプローチを報告しています。...

ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。...

HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

免疫細胞の生理学的に関連する基質濃度の下でミトコンドリアの生体エネルギーを研究する方法は限られています。私たちは、高分解能蛍光肺活量測定法を使用して、ヒトT細胞、単球、および末梢単核細胞のエネルギー需要に対するミトコンドリア膜電位の応答の変化を評価する詳細なプロトコルを提供します。...

ヒト免疫細胞におけるミトコンドリア膜電位の動的変化を評価するための高分解能蛍光スパイロメトリー

学ぶ 造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の正確な評価法。ベラパミルを用いて流出ポンプを阻害し、TMRM蛍光染料による流れ細胞測定の精度を向上させる手法です。

流出ポンプの阻害による造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の流れ細胞測定評価の精度向上

さらに動画を探す