Name: 排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶリンパ球の体外移行評価法。マウス組織からリンパ球を分離し、トランスウェルシステムでケモカイン応答性移動を定量化する。免疫応答メカニズムの解明と治療薬スクリーニングに有用な実験手法です。

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この作品は、米国肺協会(K.J.W.)、T.A.W.とK.J.W.に授与されたメモリアルユージーン・ケニー基金、ユタ大学からの寛大なスタートアップ支援、およびT.A.W.(VA I01BX0035)に対する退役軍人省賞によって資金提供されました。T.A.W.は退役軍人省から研究キャリアサイエンティスト賞(IK6 BX003781)を受賞しています。著者たちは、リサ・チュドメルカ氏の編集支援を認めたいと考えています。著者らは、この原稿のために生成されたフローサイトメトリーデータを収集する上での彼らのサポートのためのUNMCフローサイトメトリーコアに感謝します。

ここに記載されているすべての方法は、ネブラスカ大学医療センター(UNMC)とユタ大学の施設動物ケアおよび使用委員会によってレビューされ、承認されました。
1. 試薬のセットアップと準備
<ol><li>
完全なRPMI(ロズウェルパーク記念研究所)メディアを準備します。
	<ol>
<li>RPMIの90 mLに熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)の10 mLを追加します。</li>
		<li>100xペニシリン連鎖筋筋ミン-グルタミンの1mLを100mLの100mLに10%FBS RPMIの追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ILC2 拡張メディアを準備します。
	<ol>
<li>IL-2およびIL-33(各サイトカイン20ng/mL)を完全なRPMIの10 mLに加える。</li>
		<li>ストックサイトカインが10 μg/mLの場合、完全なRPMI培中の10 mLを含む15 mLチューブにIL-2およびIL-33のピペット20 μLを含む。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
肺解離培地を調剤する。
	<ol>
<li>1型コラゲナーゼの50mgを250mLの未補充RPMIに加える。</li>
		<li>ステップ1.3.1のメディアの250 mLに100倍ペニシリン連鎖筋菌-グルタミンの2.5 mLを追加します。</li>
		<li>メディアを穏やかに混ぜて、1型のコラゲナセが使用前に完全に溶解していることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
血清フリーRPMIを準備します。
	<ol>
<li>RPMIの200mLで凍結乾燥牛血清アルブミン(BSA)の1gを希釈する。</li>
		<li>100倍ペニシリン連鎖筋菌-グルタミンの2 mLを追加します。</li>
		<li>BSAが使用前にメディアに完全に溶解していることを確認するために、メディアを穏やかに混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CCL17 を使用して移行メディアを準備します。
	<ol>
<li>無血清RPMIの10 mLを取得し、CCL17[50 ng/mL]を追加します。<ol>
<li>ストックCCL17が10 μg/mLの場合は、50 μLのCCL17ストックを10mLの無血清RPMI培地に加えます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CCL22 を使用して移行メディアを準備します。
	<ol>
<li>無血清RPMIの10 mLを取得し、CCL22[50 ng/mL]を追加します。</li>
		<li>ストック CCL22 が 10 μg/mL の場合は、50 μL の CCL22 ストックを 10 mL の無血清 RPMI メディアに追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CCR4抗体染色カクテルを調調します。
	<ol>
<li>合計10回の試験について、抗マウスCCR4、CD19、CD11b、CD45、ST2、ICOSの各抗体を5 mLチューブに加えます。 注:10サンプルに対する抗体カクテルの作る方法の例:各抗体の0.5 μL x 10サンプル=1.7.1に記載されている各抗体の5μL。</li>
		<li>合計10回の試験について、ステップ1.7.1から抗体カクテルに以下の抗体の2.5 μLを加えます:抗マウスCD3、CD11c、およびNK1.1。 注:10サンプルの抗体カクテルを完成させる例:0.25 μL x 10サンプル= CD3、CD11cおよびNK1.1抗体の2.5 μL。</li>
		<li>CCR4抗体染色カクテルを4°Cで保存し、サンプルに添加する準備が整いました。使用しない場合は、1週間後に抗体カクテルを廃棄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1x安定化固定を準備します。
	<ol>
<li>脱イオン蒸留水の10 mLを3倍安定化固定濃縮物の5mLに加える</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. アレルゲンチャレンジBALB/cマウスの調製
注:雄および雌のBALB/cマウスは、生後6~8週でチャールズ川(UNMC)またはジャクソン研究所(ユタ大学)から購入した。
<ol><li>
順応後(1週間)、すべての動物をOVAに感せます。
	<ol>
<li>5 mLポリスチレンチューブで水酸化アルミニウム(20mg/mL)に吸着した100 μg/mL OVAを組み合わせます。</li>
		<li>チューブを混合し、すぐに1 mL、28 Gシリンジ(インスリンシリンジ)にOVA-アラム懸濁液の500 μLを引き出します。</li>
		<li>イソフランを含むベル瓶にマウスを入れます(偽の床の下に1~2mL、動物がイソフランに直接立たないように)。マウスが約1〜2分間、または呼吸数が低下するまで麻酔下に入るようにします。</li>
		<li>背中と肩の毛皮でマウスを素早く拾い、マウス21,22につき腹腔内にOVA-alumの100 μLを注入する。</li>
		<li>マウスをケージに戻し、モビリティを回復させるのを確認します。これは 2 ~ 5 分以内に発生するはずです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
感作後7日目、全ての動物を鼻腔内(i.n.)1.5%OVAをネブ化室(データサイエンスインターナショナル)で無菌生理食動物で20分間希釈した。
	<ol>
<li>ケージからマウスを取り出し、動物の噴霧室に入れ。チャンバーの蓋を閉じます。</li>
		<li>噴霧チャンバの入力スパウトにネブライゼーションホースを取り付けます。</li>
		<li>ネブライザーのネブライゼーションカップに無菌生理食塩で希釈した1.5%OVAの30 mLを追加します。</li>
		<li>ネブライザーをオンにし、チャンバーが20分間霧で満たされます。</li>
		<li>ネブライザーをオフにし、霧を落ち着かせてください。</li>
		<li>動物をケージに戻す。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ2.2を5日間連続5回繰り返し、アレルギー性炎症を誘発する。</li>
</ol>3. OVAチャレンジマウスの脾臓および肺からのCD4+T細胞の単離
<ol><li>承認されたIACUCプロトコルに従ってCO2窒息によってすべてのOVA処理された雄および雌動物を人道的に安楽死させ、実験ごとに1群あたり2〜3匹の動物を使用する。</li>
	<li>動物からの肺および脾臓を物品切除し、動物23の組織タイプおよび性別に基づいて別々の解離管に組織を置く。</li>
	<li>「肺」プロトコルを用いて自動組織解離器で500μLの肺解離培養剤(25ΜL;コラゲナーゼ、タイプ1)で肺組織を解離する。
	<ol>
<li>3.2 と 3.3 を合計 2 回繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>自動組織解離体の「脾臓」プロトコルを使用して、完全なRPMI培地の500 μLで脾臓組織を解離する。 注:残りのステップは、無菌技術を使用して生物学的安全キャビネットで実行する必要があります。</li>
	<li>肺と脾臓を含む解離管を、5 mLの追加肺解離培地または完全RPMIでそれぞれすすいでください。</li>
	<li>40 μmの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液をフィルターし、50 mL円錐形の管に集める。</li>
	<li>肺均質化を37°Cインキュベーターで15~30分間均質化し、5%CO2でさらに肺組織を解離します。</li>
	<li>肺と脾臓の均質化に完全なRPMIの5 mLを追加し、遠心分離を使用して50 mLチューブの底部に細胞をペレット;室温(RT)で378×g、5分間</li>
	<li>脾細胞と肺細胞を単一の50 mL円錐管に結合し、自動化された細胞カウンターを使用して総細胞数を決定する。</li>
	<li>分離バッファー内の 1 x 108セル/mL に男性および雌細胞懸濁液を調整し、5 mL ポリスチレンチューブに追加します。 注:エンリッチメントプロトコルは、脾臓および肺からより多くの細胞が獲得されたときに、最大14 mLポリスチレンチューブを調整することができます。このプロトコルは、グループあたり2-3マウスからの組織のために設計されました。したがって、5 mLチューブで十分です。</li>
	<li>ILC2エンリッチメントプロトコルに従ってILC2分離のために、全セルの約3分の2を使用します。
	<ol>
<li>細胞懸濁液に抗体カクテル(50μL/mL)を加え、RTで5分間インキュベートします。</li>
		<li>30sの渦の急速な球および細胞懸濁液の75 μL/mLの率でサンプルに加える。RTで5分間静かに混合し、インキュベートします。</li>
		<li>分離バッファーと3 mLまでの総容積まで管を上にし、8チャンバーの容易な分離磁石に置く。RTで3分間インキュベートします。</li>
		<li>磁石を前方に(チューブの背面に付着した球体抗体細胞複合体から離れて)先端を傾け、細胞懸濁液をきれいな5 mLチューブにピペットを外します。</li>
		<li>チューブに1.5 mLの完全なRPMIを追加し、RTで5分間378 x gで遠心分離機を追加します。</li>
		<li>セルペレットから培体を注ぎ、ML当たり1 x 107セルでILC2を再中断します。</li>
		<li>Uボトム、96ウェルプレートに100 μLのオスとメスのILC2をウェル当てに入れ、各ウェルにILC2拡張培地の100 μLを加えます。</li>
		<li>細胞を4~5日間インキュベートしてILC2を膨張させる。</li>
		<li>ILC2を5 mLチューブに集め、無血清RPMIを最大4.5mL加算します。RTで5分間378 x gで細胞を遠心分離します。</li>
		<li>血清フリーRPMIで血清計を用いて細胞を数え、血清フリーRPMIでmL当たり1 x 107 ILC2で再中断する。</li>
	</ol></li>
	<li>残りのセルは、マウス CD4+ T 細胞分離プロトコルに従って行われる CD4+ T 細胞分離手順に使用します。
	<ol>
<li>ラット血清(50 μL/mL)をCD4 T細胞濃縮懸濁液に添加する。</li>
		<li>サンプルに絶縁カクテル(50 μL/mL)を加え、RTで10分間インキュベートします。</li>
		<li>30sの渦の急速な球および75 μL/mLの率でサンプルに加える。</li>
		<li>細胞懸濁液を穏やかに混合し、2.5分とRTのインキュベート</li>
		<li>サンプルを3 mLまで上げ、5 mLチューブを8チャンバーの容易な分離磁石に入れ、RTで5分間インキュベートします。</li>
		<li>磁石を前方に傾け、セルサスペンションをきれいな5 mLチューブにピペットします。</li>
		<li>RTで5分間378 x gでチューブと遠心分離機に1.5 mLの無血清RPMIを追加します。</li>
		<li>細胞ペレットから培剤を注ぎ、血清フリーRPMIで1mL当たり1 x 107細胞でCD4+T細胞を再中断します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 流れ細胞メトリーによるOVAチャレンジ動物からのCD4+T細胞およびグループ2先天性リンパ球細胞(ILC2)におけるCCR4発現の決定
注:以下のステップは、非滅菌技術であるオープンベンチトップ上で行うことができます。
<ol><li>
ステップ 3.11.10 および 1-2.5 x 106 CD4+ T セルから、ステップ 3.12.8 から約 1-2.5 x 105 ILC2セルを別々の 5 mL チューブで取得します。
	<ol>
<li>少なくとも5.0 x 104 CD4+T細胞の追加チューブを染色されていないコントロールとして保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACSバッファーの100-200 μLで細胞を中断し、すべてのチューブにFcブロックの1 μLを追加し、氷(または4°Cの冷蔵庫)で10分間インキュベートします。</li>
	<li>すべてのチューブにFACSバッファの1-2 mLを追加し、RTで5分間378 x gで遠心分離機を追加します。</li>
	<li>上清を注ぎ、FACSバッファーの100~200μLで細胞を再中断します。</li>
	<li>CCR4抗体染色カクテルの37.5 μLを、「染色されていない」細胞を含むチューブを除くすべてのチューブの細胞懸濁液に添加します。</li>
	<li>チューブを氷の上または4°Cの冷蔵庫で20~30分間インキュベートします。</li>
	<li>すべてのチューブにFACSバッファの1-2 mLを追加し、RTで5分間378 x gで遠心分離機を追加します。</li>
	<li>上清を注ぎます。</li>
	<li>手順 4.7 と 4.8 を繰り返します。</li>
	<li>すべてのチューブに250~300μLの1倍安定化固定(材料の表を参照)を追加します。</li>
	<li>
補正ビーズを提供するプロトコルに従ってCCR4抗体カクテル内の各抗体に対して単色ビーズコントロールを調製する。
	<ol>
<li>補正ビーズの渦。</li>
		<li>各単色のコントロールチューブにビーズを1滴追加します。</li>
		<li>CCR4抗体カクテル中の各抗体の1 μLを独自の標識チューブに添加する。</li>
		<li>4°Cの冷蔵庫または氷の上で10分間、穏やかに混合し、インキュベートします。</li>
		<li>すべてのチューブと遠心分離機に 1-2 mL の FACS バッファーを RT で 5 分間 378 x gで追加します。</li>
		<li>上清を注ぎ、200 μLのFACSバッファーでビーズを再中断します。</li>
		<li>すべてのサンプルが染色され、フローサイトメーターで分析する準備が整うまで、単色のコントロールを冷蔵します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>固定の24時間以内に、染色されていない細胞、単色のコントロール、およびフローサイトメーター上の実験サンプルを分析します。</li>
</ol>5. 元ビボ移民手続き
注:彼らは無菌技術を必要とするので、次の手順は、生物学的安全キャビネットで実行する必要があります。
<ol><li>ステップ 3.11.10 および CD4 T セルから ILC2 をステップ 3.12.8 から取得し、実験に必要なトランスウェル挿入の数を決定します。 注:例: ステップ 3.12.8 からの濃縮 CD4 T 細胞の 1.2 mL の場合、1.2 x 1,000 μL = 1,200 μL を乗算します。次に、1,200 uL を 100 μL = 12 で除算し、CD4 T 移行に必要な挿入物の数を割ります。</li>
	<li>24ウェルプレートの中央の行から3 μmトランスウェルインサートをゆっくりと動かします。</li>
	<li>CCL17を使用したマイグレーションメディアの500 μLをウェルの約3分の1に追加します。</li>
	<li>CCL22を使用して500 μLのマイグレーションメディアをウェルの3分の1に追加します。</li>
	<li>ウェルの最後の3分の1にケモカインを含まない無血清RPMIの500 μLを追加します。</li>
	<li>プレートの蓋に、下部の井戸に適切な移行媒体を貼り付けます。</li>
	<li>トランスウェルインサートを様々な治療法を含む井戸に戻します。</li>
	<li>各インサートの上部ウェルに100 μLのCD4 T細胞またはILC2を静かに加えます。これは実験の結果を混乱させる可能性があるため、トランスウェルでセル懸濁液を上下に混合またはピペットしないでください。</li>
	<li>各井戸に配置されたセルタイプでプレートの蓋を明確にラベル付けし、細胞を追加した日時を書きます。</li>
	<li>すべてのセルがメディアを使用してトランスウェルインサートに配置されるまで、手順 5.2 ~ 5.9 を繰り返します。</li>
	<li>プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、5%CO2を48時間にわたって静かに置き、インキュベーション期間中のプレートとの接触を最小限に抑えます。</li>
</ol>6. 排外移住の定量化
<ol><li>インキュベーターからプレートをそっと取り出し、中央の行から真上または下の空の井戸にすべてのトランスウェルインサートを取り外します。</li>
	<li>トランスウェルの下部および上部ウェルから、セルタイプの CCL17、CCL22、またはメディアで、および反復数 (実験ごとに少なくとも 3 回) で、TOP または BOTTOM でラベル付けされたチューブにセルを集みます。</li>
	<li>1x PBSの500 μLで底部ウェルをすすいで、対応するチューブにこのすすを集えます。</li>
	<li>1x PBSの250 μLでトップウェルをすすいで、対応するチューブにこのすすを集えます。</li>
	<li>RTで5分間378 x gで遠心分離によって細胞をペレットする。</li>
	<li>細胞ペレットからすべての上清をそっとピペット。</li>
	<li>T細胞とILC2を1x PBSの50 μLに再中断します。</li>
	<li>セル懸濁液の10 μLを取り、0.4%トリパンブルーの90 μLに加えます。</li>
	<li>
自動セル カウンタ上のセルをカウントします。
	<ol>
<li>%の実行可能性を記録します。</li>
		<li>各サンプルの mL あたりのセル数を記録します。</li>
		<li>上部および下部チャンバ内の治療ごとの細胞の総数を決定します。セル数を記録します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は、開示する財務情報や利益相反を持っていません。

本明細書では、排生体移行システムにおけるケモカイン誘発リンパ球の移行を評価するための確立された方法を提示する。プロトコルにはいくつかの重要なステップがあり、そのうちの1つは実験中の免疫細胞上の正しいケモカイン受容体の発現を検証することである。私たちの手の中で、我々はアレルギー性炎症におけるTh2ヘルパーT細胞上のCCR4の重要性を強調する文献の体のためですCCR4を選びました。オブアルブミン誘発性炎症は、以前に少なくとも2つのCCR4アンタゴニスト24、25によって制限されることが示された。しかしながら、これは、グループ2自然リンパ球細胞(ILC2)26、27の発見前であった。我々は、ILC2細胞がCD4+T細胞よりも高いCCR4を発現することを示す新しいデータを生成し、これらの細胞がCCL22に一貫して応答していることを示した。
<p class="jove_content...

このオリジナルの移行方法は、実験医学1のジャーナルで1962年にスティーブン・ボイデンによって提示されました。ケモタキシスとケモキネティクスについて私たちが知っていることの多くは、ボイデン室の開発なしには不可能です。1977年に最初のケモカインが発見される前に、好中球1、2の細胞運動を増幅しながらマクロファージの細胞運動を停止させることができる血清因子について学ぶために、ex vivo移行システムが使用された。免疫細胞の移動に関する膨大な知識が開発され、現在までに47のケモカインが19の対応する受容体3、4で発見されています。さらに、これらのケモカイン経路の多数の阻害剤/増強剤は、治療目的5、6、7、8の開発を受けている。これらの化合物の多くは、与えられたケモカイン9に対する化合物と免疫細胞応答性との間の直接的な相互作用を理解するために同様の移行室で試験されている。
転移、または糖尿病は、炎症を起こした組織への、明確な感染10、11に対する健康的な炎症反応に不可欠なプロセスである。ボイデン室、移動システム、またはトランスウェル装置は、一般に多孔質膜1、12によって分離された2つのチャンバーから構成される。下部チャンバーは、最も頻繁に目的のケモカインを含む媒体を保持し、一方、白血病は上部のチャンバーに配置されます。膜中の細孔の大きさは、目的の細胞の大きさに基づいて選択することができる。このプロジェクトでは、リンパ球細胞の大きさが7~20μmの3μmの多孔質膜を細胞開発の段階に応じて選択しました。この細孔の大きさは、これらの細胞が受動的に細孔を通って落ちていないことを保証するが、彼らは積極的にケモカイン勾配に応答して移動していることを保証します。
このプロトコルの主な利点は、その費用対効果です。生体内移住では、動物の取り扱いや手術に関する広範な訓練が必要であり、研究者が常に利用できるわけではない高出力顕微鏡検査が必要な場合が多いため、移住は困難です。トランスマイグレーションを増強または阻害すると考えられる化合物の費用対効果の高いスクリーニングは、生体内イメージングの前に達成することができる。移行システムが厳密に制御されているので、細胞は最初にトランスウェル装置に加え、またはその逆に、ケモカイン阻害剤で最初に処理し、次いでトランスウェル装置に添加された細胞を治療してもよい。最後に、内皮細胞および/または地下膜タンパク質は、ケモキネティクスにおけるこれらのバリア細胞の関与を理解するために、トランスウェルインサートの1〜2日前にトランスウェルインサートの底部に添加することができる。繰り返しますが、システムのこれらの操作は、生体内研究のより複雑な前に、特定の化合物の有効性に関する重要な情報を決定する強力な手段を提供します。
転移室システムを利用することは、インビボおよびインビトロ条件12、13、14の様々な下でリンパ球移動性を評価する効果的な方法である。ここで、我々は、移民室内におけるケモカインに対する外生生リンパ球応答性を評価するための最適化された方法について説明する。この実験の例では、CD4+T細胞およびグループ2の自然リンパ球細胞(ILC2)を、雄および雌から単離し、BALB/cマウスをOVA-アレルゲン曝露後に分離した。アレルゲンチャレンジマウス由来のCCR4+CD45+リネージュ-(LIN-)ILC2がCCR4+CD4+Tヘルパー細胞よりもCCL17およびCCL22に向かってより効率的に移行するという仮説が生成された。 CCL17およびCCL22は、M2(アレルギー性)表現型の樹状細胞およびマクロファージによって一般的に産生されるケモカインであり、他の細胞の中でも、アレルギー15、16において。CCL17およびCCL22は、気道悪化16、17、18の間に肺で容易に検出されるので、アレルギー性炎症のバイオマーカーと考えることができる。重要なことに、CCR4発現は未処理の対照と比較して上昇し、ハウスダストダニ処理動物から単離されたILC2から生成されたバイオインフォマティクスデータ、および同様にIL-33でex vivoを処理したナイーブ動物からのILC2(IL-33()アレルゲン促進生殖細胞カイン)は、CCR419、20をアップレギュレートします。さらに、免疫ゲノムプロジェクトデータベース(www.immgen.org)におけるILC2のデータによれば、CCR4 mRNAはこれらの自然免疫細胞において高く発現される。現在までに、ILC2の組織への人身売買に関してはほとんど知られていないが、ILC2およびCD4+T細胞は、同様の転写因子および受容体を発現する化学タキシスおよびケモキチン学に類似したケモカインおよび受容体を使用する可能性が高い。そこで、ILC2とCD4+Tリンパ球のCCL17対CCL22応答性を、雄と雌の両方から、OVAチャレンジ動物と比較した。

<table><tbody><tr><td>0.4% トリパン ブルー</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>329424</td><td>U-100 シリンジ マイクロファイン 28 G 1/2" 1cc</td></tr><tr><td>100x ペニシリン-ストレプトマイシン、L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>RPMI 培地 15</td></tr><tr><td>mL コニカルチューブ</td><td>オリンパスプラスチック</td>ス <td>28-101</td><td>ポリプロピレンチューブ</td></tr><tr><td>3 &mu;m トランズウェルインサート</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>25-288</td><td>24ウェルプレート 12個のトランズウェルインサートを含む</td></tr><tr><td>3倍安定化固定剤</td><td>BD ファーミゲン338036</td><td></td><td>メーカーのプロトコルに従って1倍溶液を調製</td></tr><tr><td>5mLポリスチレンチューブ</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>50mLコニカルチューブ</td><td>オリンパスプラスチックス</td><td>28-106</td><td>ポリプロピレンチューブ</td></tr><tr><td>8チャンバー簡単分離磁石</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>18103</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Advanced cell strainer, 40 &mu;m</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>25-375</td><td>ナイロンメッシュ、40 &mu;mストレーナー</td></tr><tr><td>水酸化アルミニウム、試薬グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239186-25G</td><td>20 mg/mL</td></tr><tr><td>抗マウス CCR4;APC標識</td><td>バイオレジェンド</td><td>131211</td><td>0.5 &mu;g/test</td></tr><tr><td>抗マウス CD11b</td><td>BD Pharmigen</td><td>557396</td><td>0.5 &mu;g/test</td></tr><tr><td>抗マウスCD11c;PE eFluor 610</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>61-0114-82</td><td>0.25 &mu;g/test</td></tr><tr><td>抗マウス CD16/32, Fc ブロック</td><td>BD Pharmigen 553141</td><td></td><td>0.5 &mu;g/test</td></tr><tr><td>抗マウスCD19;APC-eFluor 780 コンジュゲート</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>47-0193-82</td><td>0.5 &mu;g/test</td></tr><tr><td>抗マウスCD3;PE Cy 7-共役</td><td>BD Pharmigen</td><td>552774</td><td>0.25 &mu;g/test</td></tr><tr><td>抗マウスCD45;PE共役BD</td><td>Pharmigen</td><td>56087</td><td>0.5 &mu;g/test</td></tr><tr><td>抗マウス ICOS (CD278)</td><td>BD Pharmigen</td><td>564070</td><td>0.5 &mu;g/test</td></tr><tr><td>抗マウスNK1.1(CD161);FITC 共役</td><td>BD Pharmigen 553164</td><td></td><td>0.25 &mu;g/</td></tr><tr><td>test抗マウスST2(IL-33R);PerCP Cy5.5</td>標識<td>バイオレジェンド</td><td>145311</td><td>0.5 &mu;g/test</td></tr><tr><td>全自動セルカウンター</td><td>BIORAD</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>全自動解離剤</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、凍結乾燥粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td>0.5% 無血清 RPMI</td></tr><tr><td>セルカウンター Clides</td><td>BIORAD</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>Chicken Egg オボアルブミン、グレード V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503-10G</td><td>500 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、1型、ろ過済み</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLSS-1、5 X 50 mg バイアル (LS004216)</td><td>25 U/mL の RPMI</td></tr><tr><td>コンペンセーションビーズ</td>として購入 <td>Affymetrix</td><td>01-1111-41</td><td>1 滴/コントールチューブ</td></tr><tr><td>解離チューブ</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-335</td><td></td></tr><tr><td>FACS バッファー</td><td>BD Pharmigen</td><td>554657</td><td>1x PBS + 2%FBS、アジ化ナトリウム付き;4°Cで保管。C</td></tr><tr><td>ヒート不活化-FBS</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>25-525H</td><td>10%完全RPMI&でILC2 増殖培地</td></tr><tr><td>マウス CCL17</td><td>GenScript</td><td>Z02954-20</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>マウス CCL22</td><td>GenScript</td><td>Z02856-20</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>マウス CD4+ T 細胞濃縮キット</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>マウス IL-2</td><td>GenScript</td><td>Z02764-20</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>マウス ILC2 濃縮キット</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>19842</td><td></td></tr><tr><td>マウス組換えIL-33</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>78044</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>22400071</td><td></td></tr><tr><td>Separation Buffer</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>20144</td><td>1x PBS + 2% FBS; 4 °C;C</td></tr><tr><td>小動物ネブライザーとチャンバー</td><td>データサイエンスインターナショナル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>バク</td><td>スター2F7124;NDC 0338-0048-04</td><td>0.9%塩化ナトリウム</td></tr></tbody></table>

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

本明細書では、基本的な実験室のスキルと材料を用いて、排外移動系におけるリンパ球ケモキネティック運動を評価する効率的な方法を提示する。グループ2自然リンパ球細胞(ILC2)およびCD4+Tヘルパー細胞を、鶏卵オブアルブミン(OVA)チャレンジBALB/cマウスの脾臓および肺から単離した。CD4+T細胞とILC2の両方でCCR4の発現を比較的確認した。CCL17 および CCL22 は CCR4 の既知のリガンドです。そこで、このex vivo移行法を用いて、CCCL17-およびCCL22誘発性CCR4+リンパ球の動きを調べた。ケモカイン勾配を確立するために、CCL17およびCCL22を移行システムの底室に配置した。その後、単離されたリンパ球を上のチャンバーに加え、48時間の期間にわたって、リンパ球は3μmの細孔を通って下部チャンバーのケモカインに向かって積極的に移行した。これは、リンパ球の化学化物を決定するための効果的なシステムですが、当然のことながら、生体内臓器微小環境に見られる複雑さを模倣しません。これは、研究中の臓器およびリンパ球のその中の画像化の添加によって克服することができる方法の1つの制限である。対照的に、この方法の利点は、ライブイメージングよりもはるかに費用対効果の高い速度でエントリーレベルの技術者によって行う場合です。治療化合物が移行を増強するために利用可能になるにつれて、腫瘍浸潤細胞細胞の場合のように、または移行を阻害するために、おそらく免疫病理学が懸念される自己免疫疾患の場合には、スクリーニングツール。一般に、この方法は、目的のケモカインが一貫してメディア制御よりも統計的に高いレベルでケモキネティクスを生成している場合に有効である。このような場合、所定の化合物による阻害/増強の程度も同様に決定することができる。

CD4+ T細胞およびILC2上のCCR4発現。
排生移行実験の成功のためには、リンパ球がCCR4を介してCCL17およびCCL22に応答するかどうかを決定することが不可欠である。そこで、流量細胞メトリーによりCD4+T細胞とILC2の両方でCCR4発現を決定した。OVA特異的CD4+ヘルパーT細胞がCCR4を発現することはよく知られているが、ILC2上のCCR4の発現についてはあまり知られていない。図1は、CCR4発現の代表的な結果を、比較的、CD4+T細胞(図1A,C)およびILC2(図1B,D)の雄および雌から、OVAチャレンジBALB/cマウスを示す。フローサイトメトリーは、アロフィコシアニン(APC)に結合したモノクローナル抗体を...

このプロトコルでは、リンパ球は、多孔質膜によって下部チャンバから分離された移行系の上部チャンバーに配置される。ケモカインは底室に添加され、ケモカイン勾配に沿って活発な移動を誘導する。48時間後、リンパ球は、移行を定量するために両方の部屋でカウントされます。

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

リンパ球トランスマイグレーションは、免疫応答の重要な特徴です。したがって、このプロトコルは、研究者が明確に定義されたin vitroシステムにおけるリンパ球の移動性を評価することを可能にするので重要である。この技術の主な利点は、グループ2の先天性リンパ球細胞、またはILC2のような最近定義された細胞における移行を誘発する効果を決定するために様々なケモカインを評価できることである。第二の利点は、特定のケモカイン経路を遮断することを目的とした阻害剤または生物学的療法が、動物でより高価な実験を行う前に、この方法によって試験され得る点である。まず、1群につき2~3匹の動物を使用して、安楽死した卵子処理の雄マウスおよび雌マウスから肺および脾臓を切除することから始める。切除した組織を、組織の種類と動物の性別に応じて分離解離チューブに入れる。肺組織を500マイクロリットルの肺解離培地に解離チューブに入れ、チューブを自動組織解離器に入れ、肺プロトコルを使用して解離する。合計 2 回、これらの手順を繰り返します。脾臓組織を解離するには、完全なRPMI培地を500マイクロリットルの解離器に入れ、脾臓プロトコルを使用します。今後、滅菌技術を用いた生体安全キャビネットで働き、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して各解離組織を濾過し、50ミリリットルの円錐管に集めます。肺の均質化物を含む解離チューブを5ミリリットルの追加の肺解離培地、脾臓ホモジナートを含むチューブを5ミリリットルの完全なRPMIでリンスし、対応する組織に使用されるフィルターを通して内容物をフィルタリングする。肺組織をさらに解離するために、肺均質化物を5%の二酸化炭素を含む摂氏37度インキュベーターで15〜30分間インキュベートする。その後、肺と脾臓の均質体、および遠心分離機の両方に完全なRPMIの5ミリリットルを追加します。上清を捨て、同性動物群の脾細胞と肺細胞を含むペレットを1つの50ミリリットル円錐形チューブに結合する。各チューブに完全なRPMIの10ミリリットルを加え、再中断します。自動セル カウンターを使用してセルの合計数を決定します。分離バッファー内の 1 ミリリットル当たり 1 億セルにオスおよびメスの細胞懸濁液を調整し、その後 5 ミリリットルポリスチレン チューブに追加します。2つの先天性リンパ球細胞を、原稿に記載されている全細胞の2/3から分離した後、残りの細胞をCD4陽性T細胞分離手順に使用する。CD4陽性T細胞の分離を開始するには、ラット血清をCD4 T細胞濃縮懸濁液に加える。その後、細胞サンプルに分離カクテルを加え、室温で10分間インキュベートします。渦急速な球を30秒間、細胞サンプルに加え、1ミリリットル当たり75マイクロリットルの希釈を達成する。穏やかに混ぜ、室温で2分1/2分間イ

assessment-of-lymphocyte-migration-in-an-ex-vivo-transmigration-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Tリンパ球遊走には、リンパ器官、血管系から出口へのホーミング中に発生し、末梢組織に入る。ここで、我々は、Tリンパ球の遊走を分析するために使用できるプロトコルを記述する...

移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

このプロトコルは、リンパ節のスライスに導入された画像蛍光T細胞への方法を説明します。技術は、従来の広視野蛍光または共焦点顕微鏡でのT細胞遊走のリアルタイム分析を可能にします。...

広視野と共焦点顕微鏡によるマウスリンパ節スライスにおけるT細胞のex vivoでのイメージング

このビデオは、血液脳関門(BBB)内皮モデルを介したリンパ球の移動の実験的調査を示しています。in...

微小血管内皮細胞単層におけるリンパ球トランスマイグレーションの研究

一次元閉じ込められた微小環境における細胞の自発的な遊走を研究するための定量的方法が記載されている。この方法は、微細加工されたチャネルを利用し、単一の実験では、異なる条件下で多数の細胞の遊走を研​​究するために使用することができる。...

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

ここでは、中枢神経系へのリンパ球の移行をin vitroで調査することを可能にするヒトの血液脳関門モデルについて説明します。...

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。...

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

ここでは、我々 は生体内の白血球、炎症、ナイーブから出口の定量化とマウス皮膚の悪性の方法を示します。我々 は 2 つのモデルの比較を実行: 経皮 FITC...

マウスの皮膚腫瘍からリンパ管を介して白血球出口の定量化

辺縁帯 B 細胞 (MZBs) は、流れを自分の移行パスを再定位せん断流の力に対応します。このプロトコルは、記録し、流体工学ユニット、ポンプ、顕微鏡イメージング システム、フリー...

生体外でマウス縁帯 B 細胞のせん断流動誘起移行の解析

このプロトコルは、一次マウスT細胞の単離および特定の環境条件下でのT細胞遊走のタイムラプス顕微鏡法を定量的分析とともに提供します。...

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

ここで、我々は、マウスの足蹠にホーミング白血球を研究する非侵襲的二光子（2P）顕微鏡のアプローチを説明します。私たちは、組織イメージングの準備の技術的側面を議論し、実行してデータ収集するための初期設定から典型的な実験を通してリーダーを歩く。...

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

学ぶリンパ球の体外移行評価法。マウス組織からリンパ球を分離し、トランスウェルシステムでケモカイン応答性移動を定量化する。免疫応答メカニズムの解明と治療薬スクリーニングに有用な実験手法です。

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

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