Name: 抗原ペプチドとFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートによる標的抗体遮断 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぼう、抗原ペプチドとFc-III模倣体の二重機能コンジュゲート（DCAF）の合成プロトコル。天然化学的結合反応を用いて有害抗体を選択的に中和し、デング熱や重症筋無力症などの抗体関連疾患治療への応用可能性を示します。

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この研究は清華大学ゲイツ財団の一部で支援されました(いいえ。OPP1021992)、中国国家自然科学財団(No.21502103、21877068および041301475)、および中国国家主要研究開発プログラム(No. 2017YFA0505103)。

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</ol>

著者は何も開示していない。

ここでのプロトコルは、図 1 に示す NCL アプローチを使用して DCAF1 の半合成と検出について説明します。簡単に言えば、DCAF1の2つの断片は、それぞれ化学的に合成され、組換え的に発現される。その後、全長DCAF1分子が組み立てられ、修飾され、精製される。ヒドラジン由来Fc-IIIフラグメント合成の場合、高容量はヒドラジン生成に悪影響を及ぼし、製品の収率が低くなるため、低容量の2-Cl樹脂を使用することは非常に重要です。リンカーと抗原部分は、2つの理由からSUMOタグで発現されます:まず、SUMOタグは融合タンパク質の溶解性を高めることができます。第二に、SUMOプロテアーゼは、さらなるライゲーション反応のためのCys残渣から始めることができる、立体構造認識プロテアーゼであり、放出された製品を開始することを可能にする。タンパク質発現および精製における最も重要なステップの1つは、SUMOプロテアーゼ切断である。SUMOタグ融合タンパク質の濃度は、適切な範囲に調整する必要があります。濃度が高すぎたり低すぎたりすると、消化後のさらなる精製にタンパク質凝集や難しさが生じかねな...

抗体は、病原性細菌およびウイルス1の中和のための体液性免疫応答において重要な役割を果たす。しかしながら、一部の抗体は、DENV感染時のADE効果における交差反応性抗体や、自己免疫疾患である重症筋無力症における過剰反応抗体など、生物に有害な影響を示す。ADE効果は、DENVとFc受容体提示細胞4、5を接続するためのブリッジを作るクロス反応性抗体によって媒介され、重症筋無力症はアセチルコリン受容体を攻撃する過剰な抗体によって引き起こされる筋肉組織6、7の細胞接合部間。これらの疾患を治療するために部分的に有効なアプローチが開発されているが、これらの有害な抗体の直接的な排除は間違いなく介入のために進歩するだろう。
近年、二重機能基を有するDCAF分子は、標的抗体ブロッキング10用に開発されている。DCAFは、3つの部分からなる長いペプチドです:1)コグネート抗体を特異的に認識できる抗原部、2)Fc-IIIまたはFc-III-4Cタグを抗体のFc領域に強く結合してFc受容体または補体成分タンパク質を阻害する、3)これら2つの機能基10を結合する長いαヘリカルリンカー。Moesin FERMドメインから設計されたリンカー部分は、DCAF分子の抗原部分とFc-III部分が同時にIgGのFabおよびFc領域に結合できることを保証するためにロセタソフトウェアによって最適化されました。4つのDCAF分子を4種類の抗体を標的に合成し、その中でもDCAF1を用いて4G2抗体を排除し、DENV感染時の交差反応抗体であるADE効果に寄与した。そしてDACF4は、重症筋症10におけるmab35抗体を遮断することによってアセチルコリン受容体の救助のために設計された。
本研究では、DCAF1を例にとり、DCAF分子の合成及びDCAFとその歯車抗体との相互作用の検出のためのプロトコルを示した。DCAF1は、NCLアプローチ11、12、13、14によって半合成され、Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体と発現リンカー抗原部分を一緒に結合する。NCLアプローチは、これらの方法の両方が低収率と高コストにつながるので、DCAF1合成のための完全な化学合成と完全に組換え発現よりも大きな利点があります。現在のアプローチは、フルレングス DCAF を取得する最も費用対効果の高い方法であるだけでなく、リンカー部分のコンフォメーションをネイティブフォームと同様に維持することもできます。異なるDCAF分子は抗原部分を除いて類似した配列を有するので、DCAF1合成とDCAF1と4G2抗体間の相互作用アッセイの方法は、他のDCAF分子に適用して、その歯車抗体を標的ブロックすることができます。

<table><tbody><tr><td>2-クロロトリチル樹脂</td><td>天津南開 HECHENG S&T</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ-[4,5-b]ピリジニウムヘキサフルオロリン酸 3-オキシド</td><td>GL Biochem</td><td>00703</td><td></td></tr><tr><td>2-(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロリン酸</td><td>GL Biochem</td><td>00706</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二塩酸塩</td><td>J&K Scientific</td><td>503236</td><td></td></tr><tr><td>4G2 抗体</td><td>Thermo</td><td>MA5-24387</td><td></td></tr><tr><td>4-mercaptophenylacic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>H27658</td><td></td></tr><tr><td>96-well microtiter plates</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A955</td><td>MS</td></tr><tr><td>Grade AgOAc</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>30164324</td><td></td></tr><tr><td>抗GST抗体</td><td>Abclonal</td><td>AE001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD spectrometer</td><td>Applied Photophysics Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透析バッグ</td><td>Sbjbio</td><td>SBJ132636</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>シノファーム化学試薬</td><td>80047360</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>シノファーム化学試薬</td><td>10009318</td><td></td></tr><tr><td>DNAゲル抽出キット</td><td>Beyotime</td><td>D0056</td><td></td></tr><tr><td>フュージョン Lumos質量分析計</td><td>サーモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSHセファロー</td><td>ス GE</td><td></td><td></td>ライフサイエンス</tr><tr><td>グアニジン塩酸塩</td><td>シノファーム化学試薬</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30095516ヒドラジン水和物</td><td>シノファーム化学試薬</td><td>80070418</td><td></td></tr><tr><td>塩酸シ</td><td>ノファーム化学試薬</td><td>10011018</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>シグマ</td><td>12399-100G</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル&β;-D-チオガラクトシド</td><td>シグマ</td><td>5502-5G</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>Beyotime</td><td>ST101</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A456</td><td>MS グレード</td></tr><tr><td>N、N-ジイソプロピルエチルアミン</td><td>GL 生化学</td><td>90600</td><td></td></tr><tr><td>N、N-ジメチルホルムアミド</td><td>シノファーム化学試薬</td><td>8100771933</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>サーモ</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>PBS バッファー</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td></td></tr><tr><td>ペプチド BEH C18 カラム</td><td>ウォーターズ</td><td>186003625</td><td></td></tr><tr><td>ピペリジン</td><td>Sinopharm化学試薬</td><td>80104216</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド抽出キット</td><td>Sangon Biotech</td><td>B611253-0002</td><td></td></tr><tr><td>QIAexpressキット</td><td>QIAGEN</td><td>32149</td><td></td></tr><tr><td>迅速なDNAライゲーションキット</td><td>Beyotime</td><td>D7002</td><td></td></tr>ナトリウム<tr><td>リン酸二水素二水和物</td><td>Sinopharm化学試薬</td><td>20040718</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sinopharm化学試薬</td><td>10019762</td><td></td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム</td><td>Sinopharm化学試薬</td><td>10020018</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム&nbsp;塩化物</td><td>シノファーム 化学試薬</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>標準 Fmoc保護アミノ酸</td><td>GL バイオケム</td><td></td><td></td></tr>滅菌<tr><td>ポット</td><td>タカラトミー</td><td>SX-700</td><td></td></tr><tr><td>SUMOプロテアーゼ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12588018</td><td></td></tr><tr><td>ストップソリューション</td><td>バイオレジェンド</td><td>SUMO</td>リンカー抗原を発現できる全遺伝子配列423001 <td></td></tr><tr><td></td><td>Taihe Biotechnology Compay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMB試薬</td><td>Biolegend</td><td>421101</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>SIGMA</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>GL Biochem</td><td>91100</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)ホスフィン塩酸塩</td><td>アラジン</td><td>T107252-5g</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Solarbio</td><td>T8220</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>サーモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>YUHUA</td><td>SHZ-95B</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>サーモ</td><td>IVGN0086</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

抗原ペプチドとfc-iii模倣体(dcaf)の二重機能コンジュゲートによる標的抗体遮断

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

生物からの有害な抗体の除去は、デング熱や自己免疫疾患などの抗体関連疾患の介入のための貴重なアプローチです。異なるエピトープを持つ何千もの抗体が血液中を循環しているため、抗原ペプチドとFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートを除いて、特異的な有害抗体を標的とする普遍的な方法は報告されなかった。DCAF分子の開発は、デングウイルス(DENV)感染モデルにおける抗体依存性増強(ADE)効果を排除し、アセチルコリンを高めることが実証された標的治療の進行に大きく寄与する。重症筋症モデルにおける受容体活性。ここでは、デングウイルス感染時にADE効果を減衰させるために4G2抗体を選択的に遮断できるDCAF分子(DCAF1)の合成に関するプロトコルを説明し、ELISAアッセイによるDCAF1~4G2抗体の結合を例示する。我々の方法では、DCAF1は、Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体と、天然化学ライゲーション(NCL)を介して抗原配列を有する長いαらせんを発現した組換えによって合成される。このプロトコルは、そのコグネイト抗体を標的とする他のDCAF分子と同様に、DCAF1にも適用されています。

この記事のネイティブ化学ライゲーションによる合成経路のフローチャートを図1に示します。図2-6は、Fc-IIIペプチドの化学合成ヒドラジン誘導体のクロマトグラム(A)および質量スペクトル(B)を示し、組換え発現リンカーおよび抗原部分、NCL反応から精製された生成物、精製された脱硫反応と精製最終製品DCAF1からの製品は、それぞれ。クロマトグラムは、すべての製品の精製が90%以上であることを示し、質量スペクトルは、各反応後の製品の分子量を示します。各製品の正確な分子量を反映した図3-6にも、重畳分子量を示しています。図7は、ELISAアッセイ(A)の原理と抗原ペプチドの結果を示し、Fc-IIIおよびDCAF1は4G2抗体結合を競合的に阻害する。抗原ペプチドおよびDCAF1はいずれも4G2結合を有意にブロックし、一方、Fc-IIIペプチドは抗原抗体相互作用に影響を与えない。
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抗原ペプチドおよびFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートの開発は、有害な抗体の排除のために新規である。ここでは、デングウイルス感染時に抗体依存性増強効果を排除するために4G2抗体を選択的にブロックできるDCAF1分子の合成に関する詳細なプロトコルについて説明する。

抗原ペプチドとFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートによる標的抗体遮断

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

これは、標的抗体中和を用いてDCAF分子を合成する方法に関する重要な質問に答えるのに役立つかもしれません。この手法は、DCAF分子を高い生産性で合成する最も簡単な方法を提供します。世界は、DCAF分子がデング熱や筋無力症などの疾患を扱う抗体に潜在的な介入を持っていると判断します。この方法は、異なるエピトープを有する他のDCAF分子に適用して、同結合抗体を標的とすることができる。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の上級技術者であるXue Baiです。2-塩素樹脂をヒドラジン由来の2-塩素樹脂に変換するには、ペプチド合成容器の上部から、2-塩素樹脂の0.25ミリモルにDMFを5ミリリットル加えます。キャップを元に戻し、容器を15秒間軽く振り、鉄のスタンドで水切りします。DMF洗浄をさらに2回繰り返します。その後、容器に5ミリリットルのDCMを加え、キャップを元に戻し、容器を15秒間静かに振り、鉄のスタンドで排水します。さらに2回DCM洗浄を繰り返し、DMF洗浄をさらに3回繰り返します。次に、DCM上のDMFの50%体積濃度の6ミリリットルを加えて、樹脂を30分間膨らましてから、水切りします。今度は、ヒドラジンとDMFの5%体積濃度の6ミリリットルを反応容器に移す。シェーカーの上に120 RPM、摂氏30度で30分間置き、真空ポンプで溶液を排出します。Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体を精製するために、HPLCシステムを使用して、1分間に1ミリリットルの流速で30分間の勾配の溶出によってペプチドを精製する。原稿によるタンパク質精製後、新しいチューブに、SUMOタグ付きタンパク質1ミリ1ミリグラム、SUMOプロテアーゼ1ミリリットル、10X SUMOプロテアーゼバッファーの1ミリリットル、および6ミリリットルの二重蒸留水を加えて反応液を調製する。混合物を摂氏4度で12〜16時間インキュベートする。その後、混合物を8つの1.5ミリリットルのエペンドルフ管にアリコートし、摂氏4度で10分間Gの15,000倍の遠心分離機を作る。ピペットを使用して下部の凝集体を捨て、10ミリリットルの清澄化した上清に、50ミリモルPBSで50%ニッケルNTAビーズスラリーの0.5ミリリットルを加えます。チューブをロータリーシェーカーに200 RPM、摂氏4度で置き、60分間軽く混ぜます。次に、リサデとニッケルNTA混合物を底出口キャップ付きのカラムに積み込みます。底部キャップを取り外し、流れを15ミリリットルの遠心管に保存します。HISタグ相撲タンパク質はカラム上で結合している。リンカー抗原部分は、天然の化学ライゲーション反応のためにCISで始まり、流れに入っています。現在、Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体を2ミリリットルのエペンドルフチューブに1.8ミリグラムの重量を量り、pH3で0.2モル一リン酸ナトリウム溶液に6モルグアニジニウムクロリドの0.8ミリリットルを加える。ボルテックスは粉末を溶解する。7でチューブを遠心した後、室温で1分間Gを200回Gに200回、上清を新しいチューブに移す。チューブに攪拌棒を加え、磁気スターラーの氷塩浴にチューブを入れ、溶液を15分間緩やかに攪拌します。その後、溶液に0.5モル亜硝酸ナトリウムの40マイクロリットルを加えて、ヒドラジン基を酸化する。氷塩浴でさらに15分間、溶液を軽く攪拌します。HPLCの精製および凍結乾燥リンカー抗原部分の11ミリグラム、氷塩浴中の反応管に13.6ミリグラムのMPAAを計量します。5分間かき混ぜ、6モル水酸化ナトリウムで温帯でpH値を6.8〜7.0に調整します。天然の化学ライゲーションの最も重要なステップは、pH値を慎重に調整してライゲーション反応を開始することです。氷塩浴で12時間後、0.1モルTCEP中性溶液の0.4ミリリットルを反応系に加え、20分間攪拌して反応を終了させた。遠心分離およびHPLC精製後、脱硫のためのコンジュゲートピークIIIを得る。0.2モルリン酸ナトリウム溶液中の6モルグアニジニウムクロリドの50マイクロリットルに溶解します。その後、1モルTCEPの50マイクロリットル、Tert-ブチルチオールの10マイクロリットル、および4つの溶液のための0.1モルVAOの5マイクロリットルを加えます。溶液の最終的なpHを6.9に調整し、約5時間シェーカーで37°Cに保ちます。遠心分離機と再び浄化します。調製したペプチドを32ミリモル酢酸の200マイクロリットルに溶解し、次いで反応混合物を室温で4時間撹拌する。ペプチド上の銀チオラ化を遊離チオールに変換するには、塩化グアニジニウム6モルに1モルDTTの3マイクロリットルを加え、pH7で0.2モル一ナトリウムリン酸ナトリウムを加える。質量分析計をフルスキャンモードで操作し、m/z範囲を300~2,000、解像度を60,000に設定します。質量スペクトルデータを開き、各ステップで生成物のピークを見つけ、化学反応が正常に行われているか確認します。DCAF1と4G2抗体の相互作用のELISAアッセイを実行するには、コーティングバッファーの100マイクロリットルに抗GST抗体の1ピコモールを用いた96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルをコーティングします。シーリングテープでプレートを密封し、シェーカーで一晩摂氏4度でインキュベートします。朝には1%BSAとPBSの200マイクロリットルで各井戸をブロックします。プレートを密封し、シェーカーで1時間温帯で部屋をインキュベートします。その後、0.05%Tween 20でPBSを使用して、それぞれを4回よく洗います。このプロトコルでは、天然の化学ライゲーション法をDCAF1分子の半合成に使用した。質量スペクトルは、最終的なDCAF1分子が11,053のデコンボリューション分子重さを有する。ELISAアッセイ中、抗原ペプチドFc-IIIおよびDCAF1は4G2抗体結合を競合的に阻害する。抗原ペプチドとDCAF1はいずれも4G2結合を有意に遮断したのに対し、Fc-IIIペプチドは抗原抗体相互作用に影響を与えなかった。この開発の後、この技術は有害な抗体関連疾患の介入への道を開いた。ペプチド合成および天然の化学結紮に使用される領域のロットは非常に有毒です。あなたの化学フードでこれらの実験を取ることを確認してください。

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