Name: 移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学ぶ骨髄移植プラットフォームを用いて、樹状細胞が移植片対宿主病および移植片対白血病応答を調節するメカニズムを解明する方法。この技術は免疫細胞の役割を研究する上で重要なツールとなる。

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この研究は、セントラルフロリダ大学医学部のスタートアップ助成金(HN)、ピッツバーグ大学医療センターヒルマンがんセンターのスタートアップ助成金(HL)、米国NIHグラント#1P20CA210300-01、ベトナム保健省の助成#4694/QD-BYT(PTH)によってサポートされています。研究のための資料を提供してくれたサウスカロライナ医科大学の徐中宇博士に感謝します。

実験手順は、セントラルフロリダ大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました.
1. GVHD誘導
注:同種骨髄(BM)細胞移植(ステップ1.2)は、照射後24時間以内に行われる。以下に説明するすべての手順は、無菌環境で行われます。組織培養フードで手順を実行し、濾過試薬を使用します。
<ol><li>0 日目: 受け取ったマウスを準備します。<ol>
<li>バルB/cバックグラウンド(CD45.2+ H2kd+)上の雌の野生型(WT)マウスを使用し、10-12週齢をレシピエントとして使用します。</li>
		<li>TBI の前に、受取人の耳札と重み付け。次に、照射チャンバーに最大11匹のマウスを入れ、照射器に保管します。10-15分間、700 cGyの単回投与で照射します。</li>
		<li>照射された動物をケージに戻し、移植前に病原体のない施設に収容してください。 注:レシピエントの最小体重は約20 gである必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>1日目:ドナーマウスからT細胞枯渇骨髄(TCD-BM)を調製する。<ol>
<li>CD45.1/Ly5.1 C57BL/6マウスをCO2窒息で安楽死させ、意識不明になるまで2-3分待ちます。必要に応じて二次安楽死として子宮頸部脱臼を行う。</li>
		<li>各マウスをクリーンな作業盤に置きます。70%イソプロパノールで毛皮と皮膚を消毒します。</li>
		<li>鉗子とはさみを使用して両足から脛骨と大腿骨を収集します。50 mL円錐管に1%のFCSと100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンと2 mM L-グルタミン(1%RPMI)を含む氷冷RPMIに入れてください。鉗子とはさみを使ってすべての筋肉組織を取り除くことによって、大腿骨と脛骨を徹底的にきれいにします。大腿骨と脛骨を50 mL円錐形チューブから1%RPMIを含む直径92mmのペトリ皿に移します。</li>
		<li>はさみを使用して、大腿骨または脛骨の端を切ります。50 mL チューブに 25 mL の 1% RPMI 1640 培地を充填します。これを使用して、26G針に取り付けられた3mLのシリンジに3mLの1%RPMIを充填します。この注射器を骨に挿入し、プランジャーを押して、1%RPMI(〜3 mL/bone)で採取管に骨髄(BM)を空洞から洗い流します。</li>
		<li>他のドナーマウスの残りのすべての脛骨および大腿骨に対してステップ1.2.4を繰り返します。すべてのコレクションチューブを氷の上に保管してください。</li>
		<li>骨髄片を75μmメッシュセルストレーナーで洗い流して、単一細胞懸濁液を作ります。50 mLチューブにシングルセルサスペンションを回収します。</li>
		<li>遠心管は800xgで5°Cで5分間。 g吸引し、上清を捨てる。0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSバッファー内のペレットを20 x 106細胞/mLに再懸濁する。純度染色用に2 x 106細胞のアリコートを保存します。</li>
		<li>1個の抗体を0.05 μg/106細胞14で加え、4°Cで30分間インキュベートします。25 mLの氷冷PBSで1回洗います。0.5% BSA/10% 若いウサギ補数/2% DNase (滅菌H2Oで10,000 U/mL) で20 x 106/mLで再中断します。37°Cで45分間インキュベートし、前の2倍洗います。 注:T細胞は、Thy1に特異的なmAb(すべてのT細胞によって発現されるタンパク質)を使用して枯渇しますが、他の白血球では使用されません。</li>
		<li>0.5%BSAを含むPBSバッファーの20 mLで細胞を再懸濁します。血球計を用いて1%酢酸の骨髄細胞を数える。細胞精製後のフローサイトメトリーによる純度チェックのために2 x 106細胞のアリコートを保管してください。 注:1つのドナーマウスは通常約25 x 10 6 TCD-BMを生成する。</li>
		<li>フローサイトメトリーを使用して、T細胞の枯渇が成功したことを確認します。染色1 x 106細胞は、ステップ1.2.7(T細胞枯渇前)および1.2.9(T細胞枯渇後のTCD-BM)(T細胞枯渇後のTCD-BM)を以下の抗体で保存する:α-CD3(17A2)、α-CD4(GK1.5)、およびα-CD8α(53-6.7)。</li>
	</ol></li>
	<li>1日目:ドナーマウスからT細胞を準備する<ol>
<li>T細胞のドナーとしてCD45.2+ H2kb+ C57BL/6野生型(WT)マウスを使用してください。</li>
		<li>1.2.1に記載の二酸化炭素(CO2)窒息によりC57BL/6マウスを安楽死させる。</li>
		<li>70%エタノールでマウスの毛皮と皮膚を十分に洗浄してください。脾臓およびリンパ節を物品切りし、注射器プランジャーと40 μmメッシュストレーナーを使用して脾細胞の単一細胞懸濁液に分離します。ストレーナーとシリンジプランジャーを1%RPMI(RPMI培地を含む1%FBS)で洗浄し、すべての脾細胞を採取します。</li>
		<li>細胞懸濁液を800xgで4°Cで5分間遠心分離する。 g上清を捨てた後、ACKライジングバッファ(1 mM Na2EDTA、10 mM KHCO 3、144 mM NH4Cl、pH 7.2)を5 mL加えます。3細胞懸濁液を室温で5分間インキュベートします。 注:ACKライシスバッファーは、赤血球をライシングするために使用されます。</li>
		<li>5 mLの1%RPMIを加えると、リシスを止める。遠心分離機を800xgで5分間4°Cでg上清を捨てます。</li>
		<li>氷冷磁界活性化セル選別(MACS)バッファ(0.5%BSA、PBSで2 mM EDTA、pH 7.2)を準備します。使用前にバッファを脱ガスします。5 mL の MACS バッファにセルペレットを再懸濁します。</li>
		<li>脾細胞を数え、血球計と1%のトリパンブルーを使用して生細胞と死んだ細胞をチェックします。フローサイトメトリー分析で精製収率を評価するために2 x 106細胞のアリコートを保存します。</li>
		<li>MACS バッファ内の 200 x 106/mL の濃度で脾細胞を再中断します。0.03 μLのビオチン抗マウステル-119、0.03 μLのビオチン抗マウスCD11b、0.03 μLのビオチン抗マウスCD45R、ビオチン抗マウスDX5/106細胞あたり0.03 μLを加えます。64°Cで15分間インキュベートします。 注:ビオチン抗マウスTer-119、ビオチン抗マウスCD11b、ビオチン抗マウスCD45R、ビオチン抗マウスDX5をそれぞれエリスロイド、顆粒球、B細胞、およびNK細胞と反応させるために使用した。したがって、これらのセルサブセットは、ステップ15の後で枯渇します。</li>
		<li>細胞懸濁液に10mLの氷冷MACSバッファーを加えます。遠心分離機を800xgで5分間4°Cでg上清を捨てます。</li>
		<li>100 x 106/mL の濃度で MACS バッファー内のセルペレットを再懸濁します。脾細胞懸濁液に抗ビオチンマイクロビーズ(0.22 μL/106細胞)を加えます。よく混ぜて、4°Cでさらに15分間インキュベートします。10 mLの氷冷MACSバッファーで細胞懸濁液を1回洗います。4°Cで5分間800xgで遠心分離機を出し、上清を捨てます。 g</li>
		<li>磁界に磁気分離カラムを入れます。3 mL の MACS バッファでカラムをリンスします。セルのサスペンションを列にドロップします。新しい15 mL円錐形チューブに、束縛されていない富化T細胞からなるフロースルーを収集します。MS カラムを 3 mL の氷冷 MACS バッファで洗浄します。 メモ:洗浄手順を実行する前に、列が空であることを確認してください。</li>
		<li>細胞懸濁液を800xgで4°Cで5分間遠心分離する。 g5 mLのMACSバッファーに細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>ヘモサイトメーターを使用して1%トリパンブルーの細胞を数えます。フローサイトメトリーによる純度チェックのために2 x 106細胞のアリコートを保存します。 注:この方法で分離された脾臓T細胞の平均収率は、マウスあたり〜20〜25 x 106細胞です。</li>
		<li>フローサイトメトリーによるT細胞濃縮の歩留まりを確認します。1 x 106細胞を染色し、ステップ1.3.7(T細胞枯渇前)および1.3.13(T細胞枯渇後のTCD-BM)、α-CD3(17A2)、α-CD4(GK1.5)、α-CD8α(53-6.7)の抗体を用いて保存する。</li>
	</ol></li>
	<li>1日目:照射したマウスにドナーT細胞およびTCD-BMを注入する。<ol>
<li>TCD-BMおよびT細胞2xをPBS(800 x g 4°Cで5分間)で洗浄します。注射のために氷冷PBSの細胞を再懸濁します。TCD BM の場合は 20 x 106/mL、T 細胞の場合は 4 x 106/mL にセル濃度を調整します。</li>
		<li>加熱ランプを使用して動物を加熱し、両側尾静脈の視認性を高めます。必要に応じて、マウスを拘束剤に配置します。</li>
		<li>70%イソプロパノールを使用して尾の表面をきれいにします。TCD-BM(5 x 106細胞/マウス)をT細胞の有無にかかわらず(0.75 x 106細胞/マウス)注入する。注射器に空気を入れないように注意してください。</li>
		<li>針を取り外し、注射部位に直接消毒綿棒を5-10 s塗布して、出血を止めます。</li>
	</ol></li>
	<li>2-80日にGVHDを評価します。<ol>
<li>動物の生存を追跡します。Cook et al.16によって以前に確立されたスコアリングシステムから適応したGVHDの臨床徴候を監視し、1週間に2倍のレシピエントマウスの体重を記録する。体重の減量を計算する TBI の前に決定した体重を使用します。.</li>
		<li>各マウスの重さを個別に測定します。次のように減量をスコア: グレード 0 = 10% 未満;グレード1 = 10%-20%;2級=20%以上。</li>
		<li>受信者の姿勢サインをスコア付けする:グレード0 = ノー予感;グレード0.5 =わずかな予感が、歩くときにまっすぐに。グレード1 =動物は歩くときに抱いたままです。グレード1.5 =動物はまっすぐにしません。グレード2.0 = 動物は後部つま先に立ちます。</li>
		<li>受信者のモビリティサインをスコア付けします: グレード 0 = 非常にアクティブです。グレード0.5 = ナイーブマウスよりも遅い。グレード1.0 = 突いた場合にのみ移動します。グレード1.5 = 突くとわずかに動きます。2.0 = 突いても動かない。</li>
		<li>レシピエントの皮膚をスコア付けする:グレード0 = 摩擦、病変、またはスケーリングなし。グレード0.5 = 1つの特定の領域の赤み;グレード1 =1つの領域で摩耗または2つの領域で軽度の摩耗;グレード1.5 =2つ以上の領域で深刻な擦過傷。グレード2.0=重度の擦り傷、ひび割れ皮膚、乾燥した血液。</li>
		<li>受信者の毛皮を得点:グレード0 =異常な兆候はありません。グレード0.5=首の腹やうなじの側面に乗って、グレード1.0=腹と首の横または横に乗り散る。グレード1.5=アンケンプトマットとラフファー。グレード2.0=腹と背中にひどくマットファー。</li>
		<li>受信者の下痢をスコア: グレード 0 = 下痢なし;グレード0.5 =わずかな柔らかい便。グレード1.0 = 軽度(黄色の便);グレード1.5 =中程度(少し血を伴う黄色い便);グレード2=重度(薄黄色と血まみれの便、「乾燥ケーキ便」が肛門領域に現れます)。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 共同移植モデル
<ol><li>骨髄由来樹状細胞(BM-DC)を生成します。<ol>
<li>ステップ 1.2.3-1.2.4 で説明されているように、B6 バックグラウンド上の WT または因子 B (fB)の大腿骨および脛骨から骨髄を分離します。800 x gで細胞を 5 分間回転させます。</li>
		<li>赤血球のリシスのためのACKのlysing緩衝液の5 mLのペレットを再懸濁させる。細胞懸濁液を氷上で5分間インキュベートします。細胞懸濁液に1%RPMIの10mLを加え、4°Cで5分間800xgでgリシスと遠心分離機を停止します。上清を捨てます。</li>
		<li>細胞ペレットを10mLの培養培地(10%FBS、100 U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM l-グルタミン、50 mM β-メルカプトエタノールを含むRPMI 1460)で再懸濁し、2 x 106セル/mLの最終濃度に合わせて体積を調整します。</li>
		<li>細胞懸濁液に20ng/mL顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を加えます。骨髄細胞を100 x 15mmペトリ皿で5%CO2で6日間培養し、37°Cで培養した。</li>
		<li>3日目に、現在進行中の培養培地の半分(約5 mL)を40 ng/mL GM-CSFを含む新鮮な培地に置き換えます。</li>
		<li>37°Cの水浴で培養培地を予熱する。骨髄培養皿から約5mLの培地を収集。遠心分離機を800xgで5分間4°Cでg上清を捨てます。40 ng/mL GM-CSFを含む5mL培養培地中の細胞ペレットを再懸濁する。</li>
		<li>培養6日目に培地に25μg/mLリポ多糖(LPS)を加え、BM-DCを成熟させる。6</li>
		<li>成熟したBM-DCを収集する:セルリフターを使用して、ペトリ皿からDCを柔らかく削ります。50 mLの円錐形の管の全ての細胞懸濁液を集める。遠心分離機は800xgで、4°Cで5分間。 g上清を捨てます。50 mLの氷冷PBSで細胞ペレット3倍を洗浄します。フローサイトメトリーによる免疫表現型解析のために約2 x 106 BM-DCを節約します。</li>
	</ol></li>
	<li>BMT(DC共移植BMT)の樹状細胞共移植を行う。 注: T 細胞および BM 細胞のドナーとして FVB (H2kq)マウスを使用してください。B6 Ly5.1レシピエントマウスを1,100cGy(2回、3時間間隔)の用量で照射する。ステップ 1.1 の詳細を参照してください。<ol>
<li>FVBドナーマウスの大腿骨および脛骨からBMを分離する。手順 1.2.3- 1.2.10 の詳細を参照してください。 注: このモデルでは、TCD-BM の代わりに全く単離された骨髄を使用してください。</li>
		<li>FVBドナーマウスの脾臓およびリンパ節からT細胞を精製する。手順 1.3.1~1.3.13 の詳細を参照してください。</li>
		<li>実験コース0日目にBM(5 x 106/マウス)、T細胞(0.5 x 106/マウス)をBM-DC(2 x 106/マウス)で注入します。</li>
		<li>移植後3日目に、フローサイトメトリーによるドナーDC再構成を調べる。<ol>
<li>受取人の目から血液を収集します。</li>
			<li>CD45.1/Ly5.1 B6マウスを3%のイオブルラン吸入で麻酔します。つま先ピンチへの応答の欠如によって麻酔の深さを確認してください。</li>
			<li>無菌ガラスピペットチューブを、鼻の平面から30-45°の角度で指示された眼の内側カンサスに置きます。管を穏やかに回転させながら圧力をかける。</li>
			<li>血液を10μLヘパリン含有滅菌1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに落とします。50 μL の血液を 5 mL のガラスフローチューブに移します。</li>
			<li>ACKライジングバッファを2 mL追加します。水浴中の37°Cで45分間インキュベートし、2 mLのFACS染色バッファーを追加します。遠心分離機を800xgで5分間4°Cでg上清を捨てます。</li>
			<li>適切な流れの染色抗体を含むFACSバッファーの200 μLで細胞ペレットを再懸濁します (生/死黄, α-H-2Kb,α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c, α-MHCII).暗闇の中で4°Cで15分間インキュベートします。1 mL FACS バッファで 2x を洗浄します。FACSバッファーの200 μLで細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによる分析を行います。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. BMTのGVHD/GVLモデル
<ol><li>GVHD/GVL誘導を行います。<ol>
<li>ルシファーゼをRPMI培養培地でA20B細胞リンパ腫に導入培養する。</li>
		<li>BALB/cバックグラウンドWTまたはLy5.1レシピエントを700cGy(単回投与量)で照射する。ステップ 1.1 の詳細を参照してください。</li>
		<li>B6の大腿骨および脛骨からTCD-BMを分離する。Ly5.1ドナーマウス。手順 1.2.1- 1.2.10 の詳細を参照してください。</li>
		<li>C57BL/6ドナーマウスの脾臓およびリンパ節からT細胞を精製する。手順 1.3.1- 1.3.15 の詳細を参照してください。</li>
		<li>25 mLのPBSでA20リンパ腫2xを洗浄します。細胞ペレットを10 mLの氷冷PBSで再懸濁する。細胞懸濁液アリコート(10μL)を取り、1%トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。細胞濃度を20,000細胞/mLに調整します。</li>
		<li>TCD-BM(5 x 106/マウス)をT細胞(0.75 x 106/マウス)およびA20リンパ腫(5,000細胞/マウス)の有無にかかわらず注入する。</li>
		<li>レシピエントの生存、GVHD臨床徴候、および実験コース中の体重減少をフォローアップする。ステップ 1.5 の詳細を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>生物発光イメージングを行います。<ol>
<li>4mgのD-ルシフェリンをレシピエントマウスに注入することにより、移植されたレシピエントの腫瘍の成長をモニターする。ルシフェリンがルシファーゼと反応することを確実にするために5分間インキュベートする。</li>
		<li>生物発光イメージャーのチャンバーに3%イ蛍光器を使用してマウスを麻酔し、被検者をフィールドDで5分間、露光時間1分間画像化します。</li>
		<li>画像解析ソフトウェアを使用してデータを分析します。最良の結果を得るには、疑似カラー画像のスケールを変更します。 注: すべての画像は、実験全体で同じスケールでなければなりません。</li>
		<li>画像解析ソフトウェアを使用して、対象領域を決定し、対象領域ごとに放出されるフラックス(光子/s)を計算して信号密度を定量化します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者には利益相反はありません。

特定の個体に適した幹細胞の使用は、進行癌および耐性癌18を治療するための効果的なアプローチである。しかし、低分子医薬品は、長い間、パーソナライズされたがん治療の主な焦点であり続けています。一方、細胞療法では、ドナーと宿主との間の多数の相互作用が、BMT1後のGVHDの発達など、治療結果に決定的に影響を1与えることができる。
BMTの主要なMHCミスマッチマウスモデルは、GVHDの生物学を理解し、その治療における薬物の有効性をテストする上で貴重なツールです。その中で、C57BL/6(H2b)からBALB/c(H2d)およびFVB(H2 q)→C57BL/6(H2qb)は、確立されたモデル5,77である。5これらのモデルは、単回投与(BALB/c)または分画線(C57BL/6)として骨髄化...

同種造血幹細胞移植(BMT)は、移植片対白血病(GVL)効果3を介して血球悪性腫瘍11、22を治療するための有効な治療法である。しかし、ドナーリンパ球は常にレシピエント組織に対して望ましくない免疫学的攻撃を仕掛け、移植片対宿主病(GVHD)4と呼ばれるプロセスである。4
GVHDのマウスモデルはGVHDの生物学とGVL応答5を研究するための効果的なツールです。マウスは費用対効果の高い研究動物モデルです。彼らは小さく、効率的に開発の初期段階で分子や生物学的製剤を使用しています 6.マウスは遺伝的に適切に定義されているため、遺伝子操作研究に理想的な研究動物であり、生物学的経路およびメカニズム6を研究するのに理想的である。GVHDのいくつかのマウス主要組織適合性複合体 (MHC) MHC 不一致モデルは、C57BL/6 (H2b)から BALB/c (H2d)および FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,,7など、十分に確立されている。これらは、GVHDに影響を与える個々の細胞タイプ、遺伝子、および因子の役割を決定するための特に貴重なモデルです。C57/BL/6(H2b)から、MHC I(B6.C-H2bm1)および/またはMHC II(B6.C-H2bm12)の突然変異を有するレシピエントへの親ドナーからの移植は、MHCクラスIおよびクラスIIの両方の不一致が急性GVHDの発症にとって重要な要件であることを明らかにした。これは、疾患の発症77,88にCD4+およびCD8+T細胞の両方が必要であることを示唆している。GVHDは「炎症性サイトカイン嵐」9として知られている炎症性カスケードにも関与しています。マウスモデルにおける最も一般的なコンディショニング法は、X線または137Csによる全身照射(TBI)である。これはレシピエントの骨髄切除につながり、ドナー幹細胞の生着を可能にし、移植片の拒絶反応を防ぐ。これは、ドナー細胞に応答してレシピエントT細胞の増殖を制限することによって行われる。さらに、遺伝的格差は疾患誘導において重要な役割を果たすが、これはマイナーなMHCミスマッチ10にも依存する。したがって、骨髄性照射線量は、異なるマウス株(例えば、BALB/c→C57BL/6)で変化する。
抗原提示細胞(APC)によるドナーT細胞の活性化は、GVHDの開発に不可欠である。APCの中でも樹状細胞(DC)が最も強力です。彼らは、優れた抗原取り込み、T細胞共刺激分子の発現、およびT細胞を病原性サブセットに偏光する炎症促進サイトカインの産生により、GVHDを誘導することができる継承可能である。レシピエントDCは、移植後のT細胞プライミングおよびGVHD誘導を促進するために重要である11,,12.従って、DCはGVHD12の治療において興味深いターゲットとなっている。
TBIはドナー細胞の生着を増強するために必要とされる。TBI効果により、レシピエントDCは活性化され、移植後短時間生存する12.生物発光や蛍光の使用が大きく進歩しているにもかかわらず、GVHDにおけるレシピエントDCの役割を研究するための効果的なモデルの確立は依然として困難です。
ドナーT細胞はGVL活性の原動力であるため、ステロイドなどの免疫抑制薬を用いた治療戦略は、しばしば腫瘍再発または感染13を引き起こす。したがって、ターゲットの受信者のDCは、GVL効果を維持し、感染を避けながら、GVHDを治療するための代替アプローチを提供することができます。
簡単に言えば、現在の研究は、受信側DCの異なるタイプのシグナリングが、BMT後のGVHD開発とGVL効果をどのように調節するかを理解するためのプラットフォームを提供する。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td>MACS バッファー</td></tr><tr><td>10X PBS Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP3994</td><td>MACS バッファー</td></tr><tr><td>A20 B 細胞リンパ腫</td><td>セントラルフロリダ大学</td><td>社内</td><td>GVL 実験</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl</td><td>Jackson Lab</td><td>30954</td><td>GVL 実験</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl CD4cre</td><td>セントラルフロリダ大学</td><td></td><td>GVL実験</td></tr><tr><td>抗ビオチンマイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>T細胞濃縮</td></tr><tr><td>抗ヒト/マウスCD45R (B220)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-0452-85</td><td>T細胞濃縮</td></tr><tr><td>抗マウス B220 FITC</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10452-85</td><td>フローサイトメトリー解析</td></tr><tr><td>抗マウスCD11c- AF700</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>117319</td><td>フローサイトメトリー解析</td></tr><tr><td>抗マウスCD25 PE</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-0251-82</td><td>流動染色</td></tr><tr><td>抗マウスCD4 ビオチン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-0041-86</td><td>T細胞濃縮</td></tr><tr><td>抗マウスCD4 eFluor&reg; 450 (Pacific Blue&reg; replacement)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>48-0042-82</td><td>流動染色</td></tr><tr><td>抗マウスCD45.1 PE</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12-0900-83</td><td>フローサイトメトリー解析</td></tr><tr><td>抗マウスCD8a APC</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17-0081-83</td><td>フローサイトメトリー解析</td></tr><tr><td>抗マウスH-2Kb PerCP-Fluor 710</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>46-5958-82</td><td>フローサイトメトリー解析</td></tr><tr><td>アンチマウスMHCクラスII抗体 APC</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17-5320-82</td><td>フローサイトメトリー解析</td></tr><tr><td>抗マウス TER-119 ビオチン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-5921-85</td><td>T細胞濃縮</td></tr><tr><td>抗Thy1.2</td><td>バイオエクセル</td><td>BE0066</td><td>BM世代</td></tr><tr><td>B6 fB-/- マウス</td><td>セントラルフロリダ大学</td><td>社内</td><td>受信者</td></tr><tr><td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) マウス</td><td>Charles River</td><td>564</td><td>ドナー</td></tr><tr><td>BALB/c マウス</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>移植レシピエント</td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>ドナー/レシピエント</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0112-85</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>CD25-biotin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-0251-82</td><td>T細胞の濃縮</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-82</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>CD49b モノクローナル抗体 (DX5)-biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5971-82</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>Cell strainer 40 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>Cell preparation</td></tr> Cell <tr><td>strainer 70 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>Cell preparation</td></tr><tr><td>D-ルシフェリン</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td>生きた動物イメージング</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Atlanta Bilogicals R&Dシステム</td><td>D17051</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>フローサイトメトリーチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>352008</td><td>フローサイトメトリー分析</td></tr><tr><td>FVB/NCrl</td><td>チャールズリバー</td><td>207</td><td>ドナー</td></tr><tr><td>リポポリサカライド (LPS)</td> <td>ミリポア シグマ</td><td>L4391-1MG</td><td>DC成熟</td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Mitenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>細胞調製</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>T細胞濃縮</td></tr><tr><td>ニューブランズウィックギャラクシー 170R インキュベーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>ギャラクシー 170 R</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ペニシリン+ストレプトマイシンペニシリン/ストレプトマイシン (10,000 ユニット ペニシリン / 10,000 mg/ml 連鎖球菌)</td> <td>GIBCO</td><td>15140</td><td>メディア</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>サーモフィッシャー サイエンクティフィック</td><td>11875-093</td><td>メディア</td></tr><tr><td>TER119</td><td>サーモフィッシャーScientific</td><td>13-5921-82</td><td>T細胞濃縮</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS-200</td><td>Perkin Elmer</td><td>Xenogen IVIS-200</td><td>生きた動物イメージング</td></tr><tr><td>X-RAD 320 生物学的照射器</td><td>精密X線</td><td>X-RAD 320</td><td>全身照射</td></tr></tbody></table>

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

同種骨髄移植(BMT)は、腫瘍を根絶するための移植片対白血病(GVL)効果による血球悪性腫瘍に対する効果的な治療法です。しかし、その適用は、移植片対宿主病(GVHD)、BMTの主要な合併症の開発によって制限される。GVHDは、ドナー移植片のT細胞がレシピエント細胞によって発現する認識allo抗原を誘発し、レシピエントの健康組織に対して望ましくない免疫学的攻撃を仕掛ける。したがって、従来の治療法は、ドナーT細胞のアロロ活性を抑制するように設計されている。しかし、これらのアプローチは、実質的に、レシピエントの生存が改善されないようにGVL効果を損なう。したがって、BMT、GVL、およびGVHDに対する治療アプローチの効果を理解することが不可欠です。ドナーT細胞を刺激する抗原提示およびサイトカイン分泌能力のために、レシピエント樹状細胞(DC)はGVHDの誘導において重要な役割を果たす。したがって、受信者 DC をターゲットにすることは、GVHD を制御するための潜在的なアプローチになります。この研究は、ホストDCが移植後のGVHおよびGVL応答をどのように調節するかを調査するための新しいBMTプラットフォームの説明を提供する。また、移植後のGVHDおよびGVLの生物学を研究するための効果的なBMTモデルも提示される。

主要なMHC不一致B6(H2kbb)-BALB/C(H2kd)モデルは、移植後のGVHDの発達に密接に対応した(図2)。Cookeららによって以前に確立された6つのGVHD臨床徴候はすべて、WT-B6 T細胞を移植したレシピでは起こったが、Bm単独で移植されたレシピエント(ステップ1.5)では起こらなかった、GVHD陰性基を表す。GVHD の開発には、このモデルの 2 つのフェーズがあります。まず、重症度のピークは移植後約11日、続いて臨床スコアおよび体重回復の16日までの減少である。この段階では、照射誘発性炎症および生着症候群などのいくつかのメカニズムが病原性およびGVHDを駆動する。レシピエントは移植後約30〜40日でGVHDに均一に屈する。
BMの少なくとも85%がDCに分化した(<strong ...

移植片対宿主病は、同種骨髄移植後の主要な合併症である。樹状細胞は、移植片対宿主病の病因において重要な役割を果たす。現在の記事では、移植片対宿主病の発症における樹状細胞の役割と移植片対白血病効果を調査するための新しい骨髄移植プラットフォームについて説明しています。

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

この新しい骨髄移植プロトコルは、宿主樹状細胞が移植後の移植片対宿主および移植片対白血病応答をどのように調節するかを調べるのに使用することができる。Ex vivo細胞再生は、このプロトコルを単に培養条件を変更することによってマクロファージおよび好中球のような他の免疫細胞集団の役割をテストするために適応することを可能にする。私と一緒に手順を実証することは、ラボマネージャーのクリスタル・ホサックと学部生のサンジーブ・グルシャニーです。ドナーT細胞枯渇C57BL/6骨髄製剤の場合、安楽死させたドナーマウスから標準プロトコルに従って大腿骨および脛骨を収穫し、1%RPMI培地を含む直径92ミリメートルのペトリ皿に骨を移す。はさみを使用して、各骨から端を取り出し、新鮮な1%RPMI培地で26ゲージ針を装備した3ミリリットルのシリンジを充填します。針を1つの骨の一端に挿入し、プランジャーを押して骨髄を空洞から洗い流し、採取細胞ストレーナーに入れられます。骨髄のすべてが収集されたら、骨髄片を75マイクロメートルのメッシュフィルターでひずみ、単一細胞懸濁液を新しい50ミリリットルチューブに移します。遠心分離によって細胞を沈め、0.5%BSAを補充したPBS中の1ミリリットル当たり6細胞に20倍10倍のペレットを再懸濁する。次に、摂氏4度で30分間インキュベーションするために、6つの細胞に10回10回0.05マイクログラムのTHI1抗体を加えます。インキュベーションの終わりに、氷冷PBSの10ミリリットルで細胞を2回洗浄し、ペレットを1ミリリットル当たり7細胞に2倍10回再懸濁し、0.5%BSAに10%若いウサギ補体と2%のDNAsを37°Cで45分間培養します。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき新鮮なPBSの15ミリリットルで細胞を2回洗浄し、0.5%BSAを含むPBSの20ミリリットルでペレットを再懸濁します。リンパ節と脾臓を40マイクロメートルの細孔ストレーナーにプールし、注射器プランジャーを使用してフィルターを介して組織を浸食して細胞を放出する。1%FBSを補充したRPMI培地でストレーナーとプランジャーを洗浄し、遠心分離によって細胞を全て採取し、細胞を沈めます。細胞ペレットにACKライシスバッファーを5ミリリットル加えます。室温で5分後、1%FBSを添加した培地5ミリリットルで反応を停止し、遠心分離によって白血球をペレットにする。カウント用に5ミリリットルのMACSバッファーでペレットを再懸濁し、新鮮なMACSバッファーで1ミリリットル当たり8個の細胞に2倍の濃度10の濃度に細胞を希釈します。抗赤芽球、抗顆粒球、抗B細胞、抗NK細胞の抗体を10回10回加え、摂氏4度で15分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、10ミリリットルの氷冷MACSバッファーで細胞を洗浄し、新鮮なMACSバッファーで1ミリリットル濃度当たり8細胞に10倍の10でペレットを再懸濁します。次に、抗ビオチンマイクロビーズを10回10回0.22マイクロリットルを加え、摂氏4度で15分間インキュベーションを混合します。インキュベーションの最後に、10ミリリットルの氷冷MACSバッファーで細胞を洗浄し、標準的なビーズ分離プロトコルに従ってMACSxpressセパレータを使用して磁気ビーズ分離によって結合されていない濃縮T細胞を収集します。分離の終わりに、遠心分離によってT細胞を沈下し、カウント用に新鮮なMACSバッファーの5ミリリットルでペレットを再懸濁する。骨髄由来樹状細胞を生成するには、野生型または因子Bノックアウトマウスの大腿骨から骨髄を分離し、ACKライシス緩衝液の5ミリリットルで赤血球を分解し、5分後に1%FBSで補ったRPMIの10ミリリットルで反応を停止する。遠心分離によって全血球を採取した後、ペレットを10ミリリットルの培養培地で10ミリリットルから1ミリリットル当たり6番目の細胞の2倍に再懸濁し、GM-CSFの1ミリリットル当たり20ナノグラムを細胞に加えて、10ミリリットルの細胞を37°C×15ミリメートルのペトリ皿に37°C、5%の二酸化炭素で6%の炭素で37度で個々の100ミリのペトリ皿に播種する。6日目に、プレートあたりLPSのミリリットル当たり25マイクログラムで骨髄由来樹状細胞培養を活性化する。培養した骨髄細胞の少なくとも85%が樹状細胞に分化する。磁気ビーズ濃縮後のT細胞純度は90%であり、主要なMHC不一致C57BL/6 BALB/cモデルは、移植後のGVHDの発達に密接に対応しています。重症度のピークは、細胞転移の約11日後に起こり、その後、16日目までの臨床スコアおよび体重回復の減少が続く。レシピエントは移植後30〜40日までにGVHDに均一に屈した。興味深いことに、因子Bノックアウト樹状細胞による移植は、レシピエント生存率およびGVHD臨床スコアを改善する。ルシファーゼ導入A20 B細胞リンパ腫は、生きている動物の腫瘍増殖のモニタリングを可能にする。本代表的な実験では、骨髄単独とA20を受けた野生型BALB/cレシピエントのすべてが腫瘍再発で死亡した。骨髄由来ACC1枯渇ドナーT細胞を移植した野生型BALB/cレシピエントはGVHDで死亡した。さらに、ドナー骨髄およびACC1枯渇T細胞を受けた動物は、GVHDおよび腫瘍再発の両方で死亡した。十分な骨髄細胞を生成するには、骨髄の補正前に、採取した脛骨および大腿骨に筋肉組織が完全に含まれていなければなりません。ビオチラーゼ抗CD3および抗ビオチンマイクロビーズを用いた骨髄細胞の陰性精製も、骨髄からリンパ球を枯渇させるために行われる。

bone-marrow-transplantation-platform-to-investigate-role-dendritic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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