組織学的検査と免疫組織化学のための一体的な眼表面組織を得るための無傷の眼球の単離
2019年10月20日
このプロトコルは、比較的無傷の位置でまぶた、眼表面、前部および後部セグメントを用いてマウス眼球を単離する方法を説明する。
私たちの研究室では、眼の発達と病気に焦点を当てています。このプロトコルは、解剖されたマウスヘッドから頭蓋骨と軌道骨を順次除去する方法を記述する。まぶた、眼表面、レンズ、およびレチナを一体に残す。このプロトコルは、眼表面教訓に興味を持っている眼科医に利益をもたらす。私はディアンレル・グオです, 顔の骨を解剖しながら、眼球の損傷を避けようとするときに可能性の高い闘争で技術を伝えるために.この解剖問題の主な利点は、眼表面上皮シートの完全性が十分に保持されており、眼表面の異なる部分が1つのセクションで占体または免疫染色によって調べることができるということです。柔らかい組織のすべての小さな骨や破片を切断してください。理由は、それ以外の場合は、組織セクションに瘢痕マークを引き起こす。マウスを安楽死させた後、まっすぐハサミを使って頭を切り落とし、鼻に対して腹腔内骨から始まる矢状中線に沿って二分します。二分した頭の各半分をきれいなシャー皿に入れ、鋭いはさみを使って顎と舌を切り落とします。視神経を切断して、視神経を切断する前に、視神経を切断します。そして、頭蓋骨の壁に取り付けられている嗅球を含むすべての脳組織を取り除きます。今、残りの組織のすべては、眼球に関連付けられている頭蓋骨と軌道骨のすべてを持っている必要があります。残りの部分をPBSで洗い、血液や毛の破片を取り除きます。4%パラホルムアルデヒドを含む50ミリリットルチューブに入れ、室温で回転させることで、組織を事前に固定します。接頭辞が完了したら、PBSで解剖された頭部を3回素早く洗い、毛髪や固定剤をさらに除去します。ティッシュを10センチメートルのシャーレに入れ、図1のテキストプロトコルで示された平面に沿って頭蓋骨を3つの部分に切ります。眼球とソケットは、頭蓋骨の中央部に、エスモイド、前頭、上顎骨の下に隠されています。エスモイドの骨を剥がし、正面および上顎骨を完全に露出させるために、4つのストレート鉗子の2組を使用してください。その後、地理的に4つの領域に頭蓋骨の表面を分割します。湾曲した鉗子の先端を各領域に水平に挿入して、上顎骨と前頭骨を連続して除去します。この後、根底にある涙骨とジューガルの骨が露出します。2つの骨と関連する皮下の筋肉と眼球を取り巻く脂肪を取り除きます。取り付けられたまぶたと皮膚を小さな正方形のブロックにトリミングして、組織の体積を減らし、埋め込むときに組織の配向を容易にします。眼球と関連組織を4%パラホルムアルデヒドに戻し、4%で一晩固定し続ける
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概要
本プロトコルでは、眼瞼および眼表面を損なわずにマウスの眼球を摘出する方法に焦点を当て、解剖学的研究のためにその構造を保持させる手法について解説します。この技術は、繊細な組織を損傷させることなく眼表面を観察したい眼科医にとって特に有用です。
研究の主要構成要素
研究分野
- 眼の発達
- 眼疾患
- 組織学および免疫染色
背景
- 眼表面の完全性を維持することの重要性
- 損傷なくマウスの眼球を解剖する際の課題
- 眼科教育への応用
使用方法
- 頭蓋骨および眼窩骨の逐次的な除去
- マウスモデル
- 組織固定のためのパラホルムアルデヒドの使用
主な結果
- 本プロトコルでは、さらなる解析のために眼表面の上皮シートを保存します
- 組織学的解析または免疫染色解析が可能になります
- 眼球解剖における効果的な手法を提示します
結論
- 本研究では、付随構造を保持した状態でマウスの眼球を分離するための信頼性の高い手法を提示する
- 眼の健康および疾患に関する研究において重要である
よくある質問
産業界への応用と意義
眼表面上皮シートの完全性を維持することで、疾患モデルにおいて眼瞼結膜、球結膜、および角膜上皮を並行して評価することが可能になります。このアプローチは、相互に関連する組織全体の病原性変化を同時に評価できるため、メカニズムの検証によるリスク低減をサポートします。これにより、組織学的解析や免疫染色解析に完全な組織構造を必要とする前臨床研究において、予測の信頼性が向上します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：眼表面上皮シート内の空間的関係を維持することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：組織を無傷のまま調製し、疾患に関連する変化の並行的な組織学的検討を行うことで、生物学的なリスク低減を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：眼表面の構造を保持した検証済みの生物学的システムを調製し、その後の免疫染色および組織学的アッセイを可能にする。
- 運用上の価値：解剖中の組織の歪みを最小限に抑えることでアッセイの標準化を支援し、切片間の再現性を向上させる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：疾患に関連する系の完全性を維持し、連結した眼表面領域全体でトランスレーショナルなバイオマーカーの一致を可能にする。
- 運用の価値：組織形態を維持することで一貫した切片作成と解析を可能にし、発見段階から前臨床検証までの連続性を確保する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、仮説検証および経路の解明を裏付ける組織学的および免疫染色の解析に適した、完全な組織標本の作製を可能にすることで、探索生物学のワークフローに統合されます。
- 探索生物学：結膜領域と角膜領域の並行的な検討のために上皮シートの完全性を維持し、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：組織学的切片作成における変動を低減する再現性の高い組織分離により、アッセイの準備効率を高めます。
- 分析：完全な組織切片を用いた免疫染色および組織学的な解析により、従属変数の定量的な測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：眼表面の構造を維持して一貫した病理学的評価を行うことで、基礎研究から前臨床段階への継続性を確保します。
- エンタープライズ再利用：複数の疾患モデルやスクリーニングキャンペーンにわたって利用可能な、眼表面標本作製の汎用的な手法を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：組織構造を維持することで、眼表面の複数の区画を同時に解析することが可能となり、予測の信頼性が向上します。
- 運用上の価値：組織損傷と切片作成時のアーチファクトを最小限に抑える一貫した解剖プロトコルにより、標準化と再現性が確保されます。
- 戦略的価値：組織が維持された状態での評価を通じて、眼疾患モデルにおけるメカニズムの曖昧さを軽減し、go/no-go判定の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：完全な眼表面標本からの信頼性の高い組織学的および免疫染色データに基づいた、リスク調整後の優先順位付けが可能になります。
実施上の検討事項
- 骨除去時の組織損傷を避けるため、マイクロサージェリーによる解剖技術の専門知識が必要です。
- 頭蓋骨および眼窩骨を軟組織から正確に分離するため、鋭利な鋏と精密ピンセットへの依存度が高くなります。
- 切片作成時の組織整合性を維持するため、パラホルムアルデヒドを用いた標準的な固定プロトコルが必要です。
- 異なるモデルシステムや発生段階に適用する場合、条件の調整を検討する必要があります。
- 実用上の制限：切片作成時のアーティファクトを防ぐため、本手順の有効性は骨片の完全な除去に依存します。
