マウスにおける肝細胞核プロイドの推定に対するSitu法におけるハイスループット
2020年4月19日
フローサイトメトリーを必要としない固定/凍結保存組織サンプル内で、肝細胞数および核プロイドの変化を測定するための堅牢で費用対効果の高い柔軟な方法を提示します。私たちのアプローチは、肝臓の損傷や病気の進行を追跡するのに理想的な肝臓細胞学の強力なサンプル全体の署名を提供します。
この方法により、肝臓の発達、再生、慢性疾患の研究のために、2D組織のセクションから肝細胞核DNA含有量のプロファイルを生成することができます。この自動化されたハイスループットアプローチは、すべての2D肝組織切片に適用することができ、すべての単純な円形肝細胞核に対して核プロイドの内部較正された読み出しを提供する。肝細胞核プロイドの変化は、老化、慢性肝疾患、および癌に関連している。
この技術は、固定または凍結保存された肝臓標本における核プロイドをプロファイルする簡単な手段を提供する。彼らは組織分離や新鮮な材料へのアクセスを必要としないとして、その現場で策略プロファイリング方法は、肝臓病の進行を追跡するための研究や臨床ツールとしてかなりの可能性を持っています.マウス肝組織サンプルを採取した後、肝臓の小葉を最適な切断温度媒体に埋め込み、すぐにドライアイスに鋳型を置き、急速な凍結を確実にします。
凍結した肝臓の小葉サンプルのスライスを得るために、サンプルを6マイクロメートルの厚さに切り取り、各サンプルの上に5秒間コーティングされた標識ポリアミドを置き、各サンプルをスライドに貼り付ける。すべてのスライスが収集されたら、サンプルを室温で3〜5分間平衡させてから免疫標識します。平衡の終わりに、室温で10分間PBSで4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルでヒュームフードに組織切片を固定します。
固定の最後に、PBSで3分間の3分間のスケで、穏やかな攪拌でスライドをすすいだ。最後の洗浄後、各組織の部分の周りの領域を乾燥させ、疎水性ペンを使用して各サンプルの周りに円を描きます。サンプルを透過させるため、PBSで0.5%非イオン界面活性剤を室温で15分間処理します。
インキュベーションの終わりに、PBSで1%のウシ血清アルブミン、5%馬血清、および0.2%の非イオン性界面活性剤のフィルター溶液で非特異的結合を遮断する前に示すように、PBSで2分間サンプルを穏やかな攪拌で洗浄し、室温で少なくとも1時間は非イオン性界面活性剤を洗浄する。次に、HHF4-α抗体を、光から保護された湿気の多い染色チャンバーで摂氏4度で一晩ブロッキングバッファーに希釈してスライドをインキュベートします。翌朝、PBSでスライドを緩やかな攪拌でPBSで4回洗浄し、適切な蛍光共役二次抗体と、フィルター処理された1%ウシ血清アルブミンおよび0.2%非イオン性界面活性剤をPBSで希釈し、湿気の多い染色チャンバーで室温で2時間洗浄する。
インキュベーションの終わりに、スライドを実証したように4回洗浄し、続いて穏やかな攪拌で二重蒸留水で2回の3分間の洗浄を行います。最後の洗浄後、カバースリップに2滴の蛍光実装媒体を使用してサンプルを取り付け、必要に応じて穏やかな圧力をかけて気泡を除去します。次に、従来の蛍光顕微鏡を使用してスライドを確認し、良好な固定および免疫標識を確保します。
蛍光画像取得の場合、高含有画像化プラットフォーム上でパラメータを設定し、使用する蛍光色素に適した励起を用いて蛍光画像を取得します。次にサンプルをスキャンして十分な画像を取得し、組織セクションの完全なカバレッジを得る。スキャンの最後に、核が最適に分離されるようにソフトウェアの核セグメンテーションパラメータを調整し、HNF4-α陽性肝細胞およびHNF4-α陰性非パレンキマル細胞の最適なゲーティングを確実にするために閾値強度を変更します。
核定量では、重心に基づいて、Hoechst染色、主核のホークスト強度、核伸長率、平均核丸度指数、HNF4-αステータス、および核X、Y座標に基づいて、核面積を平方メートルに設定する。肝細胞核プロイド解析を実行するには、まず、プロイド定量分析プログラムをダウンロードしてインストールします。MATLAB で、ツール ストリップの [アプリ] タブに移動し、[アプリのインストール] をクリックします。
プロイディアプリケーションMLアプリケーションのインストールプログラムを開きます。インストールが成功したことを確認するメッセージが表示されます。各データ分析ファイルには、示されたとおりに列に示された策略分析に必要なすべてのデータを含む「セルメジャー」という名前のシートが含まれます。
実験条件ごとに、2 ~4 個の N 核策略の内部制御を計算するために使用する制御データセットを提供します。生物学的複製の場合は、各スプレッドシートを専用のフォルダに格納し、フォルダプレフィックスの名前を段階的に付けます。次に、プロイディアプリケーションを起動します。
Ploidy アプリケーションのグラフィカル ユーザー インターフェイスが表示されます。[コントロール データへのパス] ボタンをクリックして、コントロール データが存在するフォルダーに移動します。このデータ パスは、インターフェイスに表示されます。
[フォルダ プレフィックス] に、出力ファイルに付ける名前を入力します。[他のデータへのパス] ボタンをクリックし、比較データが存在するフォルダーに移動します。このデータ パスは、インターフェイスに表示されます。
次に、[実行] をクリックします。分析が完了すると、ステータス バーに [解析の完了] が表示されます。免疫標識後、従来の蛍光顕微鏡で全てのスライドをチェックし、良好な品質の固定と染色が得られたことを確認することが重要です。
Hoechst色素の塗り傷またはぼかしは、固定前の不十分な固定またはサンプル劣化を示すことができます。核偏析およびHNF4-α閾値パラメータは、蛍光顕微鏡で観察される免疫染色の視覚パターンを広く反映するように、自動画像分析の前に慎重に最適化する必要があります。画像分析の後、データは、非パレンキマル細胞の増加数とDDC損傷を伴う肝臓内のHNF4-α陽性核数の減少を反映する必要があります。
健康なコントロール肝臓では、HNF4-α陽性核の約63%が単純な円形の穿動を示す。対照群とDDC処理群との間の相対的な核策略の比較は、2Cおよび4C肝細胞核の有意な喪失を、8C細胞より多い数の増加とともに傷害と共に反映すべきである。各プロイドサブグループの相対位置情報は、高内容画像解析ソフトウェア内の特定の肝細胞サブセットの2D位置を取得することによって問い合わせることができる。
Ki-67などの追加抗体による免疫標識は、細胞複製を評価するために行うことができるし、肝細胞核の病変データは、策略分析を補完するためにさらに尋問することができる。この方法によって生成される組織全体の策略プロファイルは、すべての円形肝細胞核の最小DNA含有量を記述するが、単核細胞と双核肝細胞を区別しない。この方法は、細胞周囲などのパラメータを考慮して、双核細胞の同定を容易にし、細胞策略の追加の読み出しを提供するように適応することができる。
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概要
この記事では、固定または凍結保存された肝組織サンプルにおける肝細胞数および核の多倍体数の変化を測定するための堅牢かつ柔軟な方法を提示します。このアプローチは、肝障害と疾患進行の追跡に不可欠な肝細胞学の強力な指標を提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 肝臓病理学
背景
- 肝細胞核の多倍体数は、肝臓の発達と疾患を理解する上で重要です。
- 核の多倍体数の変化は、加齢、慢性肝疾患、がんと関連しています。
- 従来の方法では、フローサイトメトリと新鮮な組織サンプルが必要です。
- この方法では、組織の解体なしにプロファイリングが可能です。
研究の目的
- 2D組織断面における肝細胞核DNA含有量のプロファイリング方法を開発すること。
- 様々な肝組織サンプルに適用可能な高スループットのアプローチを提供すること。
- 研究および臨床設定での肝疾患進行の追跡を容易にすること。
使用した方法
- 2D肝組織断面の自動化された高スループット分析。
- 円形の肝細胞核の核の多倍体の内部校正読み取り。
- 最適切片温度媒体を使用した肝サンプルの急速凍結。
- 新鮮な材料を必要としないインサイトプロファイリング。
主要な結果
- この方法は、肝細胞核の多倍体の信頼できるプロファイルを提供します。
- 固定または凍結保存された肝臓標本に適用できます。
- 肝疾患進行の追跡の可能性を示しています。
- 様々な状態に関連する核の多倍体数の変化を評価する簡単な手段を提供します。
結論
- この方法は肝臓病理学を研究する研究者にとって貴重なツールです。
- 時間の経過に伴う肝障害と疾患のモニタリング能力を向上させます。
- 将来の応用は臨床診断と治療モニタリングに拡張される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput, spatially resolved quantification of hepatocyte nuclear ploidy from fixed or cryopreserved liver tissue, supporting target validation in liver disease models. By preserving tissue architecture and avoiding disaggregation bias, it provides internally calibrated, reproducible readouts of polyploidization events linked to disease progression. The approach enhances predictive confidence in preclinical studies by linking nuclear DNA content changes to pathophysiological states without requiring fresh tissue or flow cytometry.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating hepatocyte nuclear ploidy shifts with liver injury, regeneration, and disease models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through internal calibration using control datasets, reducing variability in ploidy measurements across experiments.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying dose- or genotype-dependent increases in >8C hepatocyte nuclei as a biomarker of pathological polyploidization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-based readouts of nuclear area, Hoechst intensity, elongation, roundness, and HNF4-alpha status for high-content screening applications.
- Operational Value: Enables assay standardization via optimized nuclear segmentation and threshold gating parameters, improving reproducibility across users and sites.
- Scalability: Compatible with standard high-content imaging platforms, allowing scalable analysis of numerous tissue sections without specialized equipment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Preserves spatial information, enabling retrieval of 2D locations of specific ploidy subsets (e.g., 2C, 4C, >8C) within liver lobules for regional disease correlation.
- Preclinical Model Relevance: Detects significant loss of 2C/4C nuclei and increase in >8C cells following DDC injury, mirroring clinical observations in chronic liver disease and cancer.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides a mechanistic readout to support go/no-go decisions by quantifying polyploidization as a feature of maladaptive repair or neoplastic transformation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical profiling, offering a reusable platform for assessing liver cytology in disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in hepatocyte nuclear DNA content to pathway modulation in injury and cancer models.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs through automated image acquisition and segmentation, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Generates ploidy profiles based on Hoechst staining and HNF4-alpha status, providing quantitative comparisons between control and treated conditions.
- Translational Research: Maintains histological context, allowing correlation of ploidy shifts with fibrosis, inflammation, or tumorigenic regions in liver sections.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, transferable capability for ploidy profiling across multiple liver disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in hepatocyte ploidy changes during disease progression.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and imaging protocols compatible with frozen tissue archives.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, spatially resolved biomarkers of liver pathology, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate pathological polyploidization in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, fluorescence microscopy, and high-content image analysis software.
- Dependent on access to cryostat, fluorescence microscope or high-content imaging system, and MATLAB-based ploidy quantification tool.
- Necessitates cross-team standardization of nuclear segmentation and HNF4-alpha threshold settings to ensure consistent gating across datasets.
- Adaptation considerations include adjusting parameters for non-circular nuclei or binuclear hepatocytes to improve specificity in certain models.
- Practical limitations include inability to distinguish mononuclear from binuclear hepatocytes and reliance on optimal circular morphometry for accurate ploidy estimation.
