Name: マウスにおける肝細胞核プロイドの推定に対するSitu法におけるハイスループット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶ、マウス肝細胞核プロイドのハイスループットin situ推定法。固定・凍結肝組織切片から核DNA含量を自動解析し、肝疾患進行の追跡に有用な研究ツールを提供する。

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この作業は、スペインのMINECO政府がBFU2014-58686-P(LAN)とSAF-2017-84708-R(DJB)を付与することによって資金提供されました。LANは、全国のミネコ・ラモン・イ・カハル・フェローシップRYC-2012-11700とプランGenT賞(コンニタット・バレンシアナ、CDEI-05/20-C)、およびバレンシア・ジェネラリタットACIF/2016/020の地域ValI +D学生シップによってFMNによって支えられました。RPは、エワ・K・パルチ教授の資金調達を認めたいと考えています。INセルアナライザプラットフォームの支援を受けたアリシア・マルティネス・ロメロ博士(CIPFサイトメトリー・サービス)に感謝します。

<ol><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+in+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li>
<li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li>
<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+polyploidy%3A+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li>
<li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li>
<li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li>
<li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1%2F2+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238(2017).</li>
<li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin%2FAkt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li>
<li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death & Disease. 8 (5), e2805(2017).</li>
<li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li>
<li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li>
<li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li>
<li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+spectrum%3A+a+new+marker+in+HCC+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li>
<li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li>
<li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Cell+Polyploidization%3A+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li>
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<li>Manzano-Núñez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972(2019).</li>
<li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214(2015).</li>
<li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+of+normal+mouse+liver%3A+A+histological%2C+quantitative+immunocytochemical%2C+and+fine+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li>
<li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li>
<li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li>
<li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li>
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<li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+and+liver+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+and+Research+in+Hepatology+and+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li>
<li>Uhlén, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-based+map+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419(2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

マウス肝臓における肝細胞核プロイドの組織改修および推定の解析のための高含有、ハイスループットアプローチが記載されている。この手順に慣れると、ユーザーは3〜5日間で複数のサンプルを処理、画像化、分析し、肝臓の健康の詳細な署名を提供する大規模なテスト可能なデータセットを生成できます。サンプル調製方法のシンプルさを考えると、多数の細胞と組織領域が分析され(平均14mm2/sample)、結果2は堅牢で再現性が高い。画像のキャプチャと分析の自動化は、これらの重要なステップからユーザーのエラーと潜在的なバイアスを取り除きます。重要な技術革新は、サンプル内およびサンプル間の肝細胞核DNA含有量の相対的な評価を可能にする内部プロイドキャリブレーターとしてのNPCの使用です。したがって、HNF4αラベリングステップの組み込みは、以前に公開された2Dメソッド33、12、2212,22と比較して、このプロトコルに独自の技術的優位性を提供する鍵となりま...

哺乳類の肝臓の肝細胞は、双核細胞を産生するために失速したサイトカネシスを受け、DNA内在性を有して最大16NのDNA含量を含む多倍核を産生する。出生後の発達、老化、および多様な細胞ストレスへの応答における全体的な細胞および核の策略の増加1.多重化のプロセスは動的かつ可逆的である2、その正確な生物学的機能は不明のままであるが 3.増加したプロイディは、増殖能力の低下に関連付けられている 4 、 遺伝的多様性2、 慢性傷害5および癌保護への適応6.肝細胞の策略変化は、概日リズム7の変化の結果として起こり、8を引き上げ、最も顕著なのは、肝臓のプロイドプロファイルが傷害および疾患9によって変化し、そして説得力のある証拠は、≥8N核の増加または2N肝細胞の喪失などの特定の策略変化が、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)進行3、10、10またはウイルス感染の3差有差影響を追跡するための有用な署名を提供することを示唆している。
一般に、肝損傷および再生は、肝細胞サイズの増加および核領域12に関連しており、肝細胞の全体数が減少すると共に、特に2NDNA含量10、11,11を有するものである。肝臓における実質損傷はまた、多くの場合、間質筋線維芽細胞、炎症性細胞およびバイポテンシー肝前駆細胞を含む非実質細胞(NPC)の拡張を伴う。パンキマル細胞数と核策略の定量的細胞学的プロファイルを提供する高スループット法は、NPCの変化を考慮しながら、傷害および疾患時の肝臓の応答を追跡する研究および臨床ツールとしてかなりの可能性を秘めています。肝細胞癌のヒトサンプルにおけるプロイドスペクトルの最新の説得力のある分析は、核プロイドが腫瘍内で劇的に増加し、TP5313の分化および損失を伴うより積極的な腫瘍サブタイプにおいて特異的に増幅されることを示している。したがって、核策略の定量的評価における方法論的進歩が、肝臓癌の将来の予後プロファイリングに役立つ可能性が高い。
本プロトコルでは、マウス肝組織切片の比較分析のための柔軟なハイスループット方法論が記載されており、これは肝細胞数の詳細な細胞量プロファイリング、NPC応答および核プロイドを推定するための内部的に較正された方法を提供する(図1)。肝細胞は、核サイズおよび核施設の特性評価に先立って、肝細胞核因子4α(HNF4α)免疫標識によってNPCと区別される。平均Hoechst 33342強度(DNA密度のプロキシ)と補間された3次元(3D)核体積を統合することによって、すべての円形核マスクに対して「最小DNA含有量」が推定される。その後、最小DNA含有量を測定し、NPCを使用して評価し、核プロイドプロファイルを生成します。
画像取得、核セグメンテーション、画像解析は高内容イメージングを用いて行われ、数万個の細胞を含む2次元(2D)肝臓切片の広い領域をスクリーニングすることが可能です。カスタム作成プログラムは、すべての円形肝細胞核のサンプル全体のプロイドプロファイルを生成するために、高コンテンツ画像解析データの自動後処理のために提供されます。これは、自由にソフトウェアをダウンロードして、立体画像解析(SIA)10、11、14、15に基づいて核策略10,11,14を15計算するために実行されます。SIAの方法論は、循環核形態と核サイズとDNA含有量の単調な関係を仮定して、肝臓14における肝細胞核策略を推定するための正確で、骨の折れる方法としてフローサイトメトリーによって以前に検証されてきた。この議定書では、両方の核パラメータは、核施設とHoechst 33342ラベリングの評価によって測定される。各核マスクの「最小DNA含有量」の計算に続いて、既知の2-4N DNA含有量を有するNPCを用いた肝細胞核プロイドの較正が行われ、有用な内部制御として機能する。
従来のフローサイトメトリー法16と比較して、説明したアプローチは、肝細胞核プロイドをその際に評価することを可能にし、結果を偏らさせ得る新鮮な組織または分解方法へのアクセスを必要とせず、標準化することが困難である。すべての SIA ベースのアプローチと同様に、核の小数部 >2N は、赤道平面の外側の大きな核の断面化により、2D サンプリングによって過小評価されます。組織全体の策略プロファイルはまた、すべての円形肝細胞核マスクの最小DNA含有量を記述し、同じ策略の2つの離散(「非接触」)核を有する単核肝細胞と双核細胞を直接区別しない。しかし、このプロトコルの単純さは、細胞の策略のより詳細な評価を提供する双核細胞の同定を容易にする核間間隔または細胞周囲分析などの追加パラメータを考慮するように適応するためのかなりの範囲を可能にする。

<table><tbody><tr><td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td><td>TestDiet</td><td>1810704</td><td>Modified LabDiet マウスダイエット 5015 with 0.1% DDC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗ヤギ IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td>希釈 1:500</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット ライカ CM1850 UV</td><td>ライカバイオシステム</td><td>CM1850 UV</td><td>組織切片</td></tr><tr><td>蛍光封止剤</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Prism 8</td><td>データをグラフ化するための統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>最終濃度 5 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>IN Cell Analyzer 1000</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td><td></td><td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019a</td><td>核倍数性の自動解析用データ分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>顕微鏡カバースライド</td><td>VWR International</td><td>630-2864</td><td>サイズ 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Speadsheetソフトウェア</td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Pascual y Furi&oacute;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Panreac AppliChem</td><td>141451.121</td><td></td></tr><tr><td>免疫染色用ペン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td>5mm 先端幅</td></tr><tr><td>ポリサイン顕微鏡スライド</td><td>VWR International</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ ポリクローナル抗 HNF4&alpha;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PA5-79380</td>希釈<td>率1:250(代替)</td></tr><tr><td>ラビットポリクローナル抗HNF4&α;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6556</td><td>希釈率 1:200 (研究で使用した抗体)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける肝細胞核プロイドの推定に対するsitu法におけるハイスループット

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

肝臓が損傷すると、肝細胞数が減少し、細胞サイズ、核サイズ、策略が増加する。また、コリンギオサイト、筋線維芽細胞、前駆細胞、炎症細胞などの非実質細胞の拡張は、慢性肝障害、組織改変および疾患進行を示す。このプロトコルでは、傷害、慢性疾患および癌に関連する肝臓の細胞組成の変化を計算するための単純なハイスループットアプローチを説明する。我々は、2次元(2D)組織切片から抽出された情報を使用して、サンプル内の肝細胞核策略を定量化および較正し、ユーザーが肝臓内の特定のプロイドサブセットをその場で見つけることができる方法を示す。我々の方法は、固定/凍結された肝臓材料、基本的な免疫細胞化学試薬および任意の標準的な高含有画像化プラットフォームへのアクセスを必要とする。これは、新たに収集された組織の破壊、空間情報の損失および潜在的な崩壊バイアスを必要とする標準的なフローサイトメトリー技術に代わる強力な代替手段として機能します。

この方法は、0.1%3,5-ジエトキシカルボニル-1,4-ジヒドロコリジン(DDC)17を含む肝毒性食を有する動物に0−21日間供給することにより、成人マウス肝臓に対する胆閉障害の17影響を測定するために使用されてきた。慢性DDCの摂食は、肝細胞損傷の結果、NPCのプロイディおよびポータル間の拡大を増加させた。ユーザーは、マウス株と年齢依存性の違いが核策略に存在する可能性があり、すべての分析は12〜16週齢の成体雌C57BL/6マウスを使用して行われていることに注意する必要があります。
HNF4α免疫標識後(プロトコルセクション3)、従来の蛍光顕微鏡を用いてすべてのスライドをチェックし、良好な品質の固定と染色を確保することが重要である(図2A)。Hoechstの塗り傷またはぼかしは、固定前の不十分な固定またはサン...

フローサイトメトリーを必要としない固定/凍結保存組織サンプル内で、肝細胞数および核プロイドの変化を測定するための堅牢で費用対効果の高い柔軟な方法を提示します。私たちのアプローチは、肝臓の損傷や病気の進行を追跡するのに理想的な肝臓細胞学の強力なサンプル全体の署名を提供します。

マウスにおける肝細胞核プロイドの推定に対するSitu法におけるハイスループット

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

この方法により、肝臓の発達、再生、慢性疾患の研究のために、2D組織のセクションから肝細胞核DNA含有量のプロファイルを生成することができます。この自動化されたハイスループットアプローチは、すべての2D肝組織切片に適用することができ、すべての単純な円形肝細胞核に対して核プロイドの内部較正された読み出しを提供する。肝細胞核プロイドの変化は、老化、慢性肝疾患、および癌に関連している。この技術は、固定または凍結保存された肝臓標本における核プロイドをプロファイルする簡単な手段を提供する。彼らは組織分離や新鮮な材料へのアクセスを必要としないとして、その現場で策略プロファイリング方法は、肝臓病の進行を追跡するための研究や臨床ツールとしてかなりの可能性を持っています.マウス肝組織サンプルを採取した後、肝臓の小葉を最適な切断温度媒体に埋め込み、すぐにドライアイスに鋳型を置き、急速な凍結を確実にします。凍結した肝臓の小葉サンプルのスライスを得るために、サンプルを6マイクロメートルの厚さに切り取り、各サンプルの上に5秒間コーティングされた標識ポリアミドを置き、各サンプルをスライドに貼り付ける。すべてのスライスが収集されたら、サンプルを室温で3〜5分間平衡させてから免疫標識します。平衡の終わりに、室温で10分間PBSで4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルでヒュームフードに組織切片を固定します。固定の最後に、PBSで3分間の3分間のスケで、穏やかな攪拌でスライドをすすいだ。最後の洗浄後、各組織の部分の周りの領域を乾燥させ、疎水性ペンを使用して各サンプルの周りに円を描きます。サンプルを透過させるため、PBSで0.5%非イオン界面活性剤を室温で15分間処理します。インキュベーションの終わりに、PBSで1%のウシ血清アルブミン、5%馬血清、および0.2%の非イオン性界面活性剤のフィルター溶液で非特異的結合を遮断する前に示すように、PBSで2分間サンプルを穏やかな攪拌で洗浄し、室温で少なくとも1時間は非イオン性界面活性剤を洗浄する。次に、HHF4-α抗体を、光から保護された湿気の多い染色チャンバーで摂氏4度で一晩ブロッキングバッファーに希釈してスライドをインキュベートします。翌朝、PBSでスライドを緩やかな攪拌でPBSで4回洗浄し、適切な蛍光共役二次抗体と、フィルター処理された1%ウシ血清アルブミンおよび0.2%非イオン性界面活性剤をPBSで希釈し、湿気の多い染色チャンバーで室温で2時間洗浄する。インキュベーションの終わりに、スライドを実証したように4回洗浄し、続いて穏やかな攪拌で二重蒸留水で2回の3分間の洗浄を行います。最後の洗浄後、カバースリップに2滴の蛍光実装媒体を使用してサンプルを取り付け、必要に応じて穏やかな圧力をかけて気泡を除去します。次に、従来の蛍光顕微鏡を使用してスライドを確認し、良好な固定および免疫標識を確保します。蛍光画像取得の場合、高含有画像化プラットフォーム上でパラメータを設定し、使用する蛍光色素に適した励起を用いて蛍光画像を取得します。次にサンプルをスキャンして十分な画像を取得し、組織セクションの完全なカバレッジを得る。スキャンの最後に、核が最適に分離されるようにソフトウェアの核セグメンテーションパラメータを調整し、HNF4-α陽性肝細胞およびHNF4-α陰性非パレンキマル細胞の最適なゲーティングを確実にするために閾値強度を変更します。核定量では、重心に基づいて、Hoechst染色、主核のホークスト強度、核伸長率、平均核丸度指数、HNF4-αステータス、および核X、Y座標に基づいて、核面積を平方メートルに設定する。肝細胞核プロイド解析を実行するには、まず、プロイド定量分析プログラムをダウンロードしてインストールします。MATLAB で、ツール ストリップの [アプリ] タブに移動し、[アプリのインストール] をクリックします。プロイディアプリケーションMLアプリケーションのインストールプログラムを開きます。インストールが成功したことを確認するメッセージが表示されます。各データ分析ファイルには、示されたとおりに列に示された策略分析に必要なすべてのデータを含む「セルメジャー」という名前のシートが含まれます。実験条件ごとに、2 ~4 個の N 核策略の内部制御を計算するために使用する制御データセットを提供します。生物学的複製の場合は、各スプレッドシートを専用のフォルダに格納し、フォルダプレフィックスの名前を段階的に付けます。次に、プロイディアプリケーションを起動します。Ploidy アプリケーションのグラフィカル ユーザー インターフェイスが表示されます。[コントロール データへのパス] ボタンをクリックして、コントロール データが存在するフォルダーに移動します。このデータ パスは、インターフェイスに表示されます。[フォルダ プレフィックス] に、出力ファイルに付ける名前を入力します。[他のデータへのパス] ボタンをクリックし、比較データが存在するフォルダーに移動します。このデータ パスは、インターフェイスに表示されます。次に、[実行] をクリックします。分析が完了すると、ステータス バーに [解析の完了] が表示されます。免疫標識後、従来の蛍光顕微鏡で全てのスライドをチェックし、良好な品質の固定と染色が得られたことを確認することが重要です。Hoechst色素の塗り傷またはぼかしは、固定前の不十分な固定またはサンプル劣化を示すことができます。核偏析およびHNF4-α閾値パラメータは、蛍光顕微鏡で観察される免疫染色の視覚パターンを広く反映するように、自動画像分析の前に慎重に最適化する必要があります。画像分析の後、データは、非パレンキマル細胞の増加数とDDC損傷を伴う肝臓内のHNF4-α陽性核数の減少を反映する必要があります。健康なコントロール肝臓では、HNF4-α陽性核の約63%が単純な円形の穿動を示す。対照群とDDC処理群との間の相対的な核策略の比較は、2Cおよび4C肝細胞核の有意な喪失を、8C細胞より多い数の増加とともに傷害と共に反映すべきである。各プロイドサブグループの相対位置情報は、高内容画像解析ソフトウェア内の特定の肝細胞サブセットの2D位置を取得することによって問い合わせることができる。Ki-67などの追加抗体による免疫標識は、細胞複製を評価するために行うことができるし、肝細胞核の病変データは、策略分析を補完するためにさらに尋問することができる。この方法によって生成される組織全体の策略プロファイルは、すべての円形肝細胞核の最小DNA含有量を記述するが、単核細胞と双核肝細胞を区別しない。この方法は、細胞周囲などのパラメータを考慮して、双核細胞の同定を容易にし、細胞策略の追加の読み出しを提供するように適応することができる。

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学ぶ、マウス肝細胞核プロイドのハイスループットin situ推定法。固定・凍結肝組織切片から核DNA含量を自動解析し、肝疾患進行の追跡に有用な研究ツールを提供する。

マウスにおける肝細胞核プロイドの推定に対するSitu法におけるハイスループット

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