Name: クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶクライオスライシングBN-MS解析法による膜タンパク質複合体の高解像度プロファイリング。マイクロトームを用いて組織中のシグナル伝達に関わるタンパク質複合体の詳細な分析が可能になります。

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この研究は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(DFG、ドイツ研究財団)-プロジェクトID 403222702 – SFB 1381およびドイツのエクセレンス戦略CIBSS - EXC-2189 - プロジェクトID 390939984によってサポートされました。私たちは、技術支援のためにカジャザッペに感謝します。

1. 準備BN-PAGE
<ol><li>ゲル製剤<ol>
<li>中から大判の縦型ゲル電気泳動システム(>10 cmゲル分離距離、14 cm x 11 cm、1.5 mm スペーサー)を使用し、効果的な冷却を10°Cに設定します。</li>
		<li>ポンプによって駆動される攪拌2チャンバー勾配ミキサーを使用して、線形または双曲線細孔勾配ゲル(1.5〜3.0 mmスペーサー)を鋳造します(材料と試薬の表を参照)。提示された例(線形勾配ゲル1%-13%):<ol>
<li>13%のアクリルアミド(30%ストック溶液から、37.5:1.0アクリルアミド:ビサクリラム化物)、0.75Mアミノカプロン酸、50mMビストリス(pH= 7.0)、および10%のグリセロールからなる前部(混合)チャンバのための13 mL溶液を調製します。</li>
			<li>1%のアクリルアミド(30%のストック溶液から、37.5:1.0アクリルアミド:ビサクリラム化物)、0.75Mアミノカプロン酸、50 mMビストリス(pH =7.0)、および0.2%CL-47からなる貯留室のための10 mL溶液を調製します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>攪拌機を開始し、30マイクロリットルのAPS(ペルキソジスチル酸アンモニウム、10%ストック溶液)とTEMEDの2.5 μL(N,N',N',N'テトラメチルエチレンジアミアミン)とTEMEDの2.5マイクロリットルを前房の溶液に加えます。ポンプを開始し、フロントバルブを開きます(フローは10分で鋳造を完了するように調整する必要があります)。1分後、90 μLのAPSと5μLのTEMEDを貯留室の溶液に加え、チャンバ接続を開きます。</li>
		<li>ゲルをゆっくりと完全に重合させて、室温(RT)で少なくとも24時間、均質な細孔サイズの勾配を生成します。しっとりとした状態に保つと、重合ゲルを4°Cで直立して1週間保存できます。 注:意図的に、ゲルの上部は柔らかい/ぬるぬるした一貫性を持つことになります。これは後で除去されますが、ゲルへのタンパク質のスムーズな侵入を可能にし、それ以外の場合は遊離アーティファクト(すなわち、ストリーキングまたはタンパク質沈殿)につながる可能性のあるタンパク質沈殿のリスクを最小限に抑えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルの準備と積み込み<ol>
<li>0.5~2.0mgのタンパク質を分離するためのガラス板の間に適切なスペーサー(例えば、シリコンチューブ)を挿入してローディングスロットを準備します。スロットは、少なくとも3センチメートル幅(またはより良い、5〜6センチメートル幅)にする必要があります。</li>
		<li>1%(w/v)非脱進性洗剤(ComplexioLyte CL-47)を含む可溶化バッファーの2mLで2mLの膜(マウス腎臓エンドソーム濃縮製剤)を30分間氷上で〜2.5mg可照化する。超遠心分離機(堆積遮断=200S以下、ここでは130,000 x g/11分)を使用する。</li>
		<li>400,000 x gで1時間の超遠心分離によるスクロースステップ勾配を短い50%/20%(w/v、0.3 ml)に濃縮する。最終的なタンパク質収率は、少なくとも1 mgでなければなりません。</li>
		<li>0.05%(w/v)のクマシーG-250を可溶化物に加え、サンプルをゲルにロードします。タンパク質の負荷を 10-15 μg/mm2ゲルレーン断面に制限して、高分解能を得て、タンパク質沈殿に起因するアーティファクトを回避します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>BN-PAGE 実行条件<ol>
<li>実行バッファーの場合は、50 mM トリシン、15 mM ビストリス、および 0.01% Coomassie G-250 からなる標準陰極バッファーを準備します。50 mM Bis-Tris(pH = 7.0)で構成される標準アノードバッファを準備します。</li>
		<li>100Vで30分の平衡フェーズ、最大電圧(40-50V/cmゲル長)に遅い(40-50 V/cmゲル長)を使用して、10°Cで一晩で準備BN-PAGEを実行します。タンパク質のエンドポイントフォーカス。 注:移行前面がゲルの中央に達したときに電気泳動を一時停止し、Coomassie G250なしで新鮮なバッファとカソードバッファを交換することをお勧めします。これは、マトリックス細孔構造の局所的な崩壊に起因するゲル内の沈殿アーティファクトを回避するのに役立ちます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ゲルのサンプリングと消化
<ol><li>ゲルレーンの切除<ol>
<li>実行後、ガラス板の間に保ちながら、文書化のためにゲルをスキャンします。</li>
		<li>プレートを分解し、目的の車線セクションを切除します。</li>
		<li>2D BN/SDS-PAGEとタンパク質染色またはウェスタンブロッティング(図1Bに示すように)による分析のためにレーンのサンプルストリップを取り、対象領域、有効な複雑なサイズ分解能、およびタンパク質の豊富さを決定します。</li>
		<li>30%(v/v)エタノールと15%(v/v)酢酸で、選択したゲルレーンを少なくとも30分間2回固定します。</li>
		<li>サンプルを埋め込み媒体に移し、4°Cで少なくとも2時間浸漬し、平衡化しながら、軌道シェーカー上でゲルスラブをスローモーションに保ちます。 注: ゲルの分離は、全体的な分離品質と移行アーティファクトを慎重に検査する必要があります。支配的なタンパク質を表すゲルバンドは、歪みのない強度で均質でなければなりません。ゲル上の局所的なアーティファクトは、切除するか、分析から除外する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>埋め込みおよび凍結ミクロトームスライス 注:これは、8 cm11までのより広いゲルレーンの埋め込みとスライスを可能にする、以前に説明され、写真文書化された埋め込み手順の改良版です。<ol>
<li>まず、固定ゲルレーンをタンパク質移行フロント/バンドパターンと正確に平行なセクション(ここでは3cm)にカットします。取り扱いを容易にするために、同じ寸法のプラスチックフィルムサポートに各セクションを配置します。</li>
		<li>ストッパー付きの開いたチューブにレーンを転送します(底面に閉じ、上部に中央に穿通され、ゲルセクションの上下両端に正確に位置合わせ)。</li>
		<li>シリンダーを液体窒素に短時間浸し、固化を迅速に開始します。透明な埋め込み媒体は数秒以内に固化し、色が白くなります。</li>
		<li>埋め込み媒体で空洞を満たし、液体窒素に一時的に浸し、-20°Cで数時間凍結する。 注:液体窒素に浸すことによってシリンダーを急速に冷却することは、チューブ内のゲルスラブの変位を避けるのに役立ちます。次の MS 分析で高解像度を確保するには、歪みを避ける必要があります。</li>
		<li>分解後、プラスチックフィルムを取り外し、埋め込みゲル部でブロックを冷却し、直径が大きく、平らな支持面(ペトリ皿)に置き、シリンダーの外側に埋め込み媒体で密封する。シリンダーを埋め込み媒体で充填し、完全に凍結します。</li>
		<li>この手順をシリンダの反対側で繰り返し行い、同一平面を持つソリッド ブロックを取得します。</li>
		<li>シリンダーからブロックを取り出し、あらかじめ冷却された金属ホルダーに埋め込み媒体で接着し、ホルダーをクライオシングマシン(クライオトーム)に挿入します。ブロックの表面は、スライス平面に対して慎重に位置合わせする必要があります。スライスプロセスに最適な温度で平衡化します(ここでは、-15 °C)。 注:正しい位置を確保するために、埋め込まれたゲルセクションの表面に当たるまで、0.1 mmステップサイズのゆっくりと進行する手動スライスサイクルを使用してください。</li>
		<li>ゲルスライスを次々に収穫し、最終的に所望の厚さ0.25mmのステップサイズで、低タンパク質結合特性を有する反応管に個別に移す。 注:このセットアップでは、均一なゲルスライスは0.1ミリメートルと0.5ミリメートルの厚さで容易に得ることができます。</li>
	</ol></li>
	<li>トリプティック消化<ol>
<li>ゲルスライスの広範な洗浄後にゲル内消化を行う(少なくとも3回の洗浄の追加ラウンドは、埋め込み媒体のポリマー成分を除去することが推奨される)標準的な手順11に従って。</li>
		<li>真空乾燥溶出ペプチドと0.5%(v/v)トリフルオロ酢酸を37°C(10分)で振盪し、続いて浴日量(5分)と短い遠心分離を行います。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 質量分析
<ol><li>ナノHPLCとMSセットアップ<ol>
<li>消化されたサンプルをC18プレカラム(粒径=5μm;直径=300μm)にロードし、(スプリットフリー)ナノHPLCを高分解能の質量分析計に結合して0.05%(v/v)トリフルオロ酢酸を使用します。</li>
		<li>水性有機勾配(溶出性A)を用いて捕捉したペプチド(溶出性A):5分3%B、3%Bから30%Bまでの120分、30%Bから99%Bまで20分、5分99%B、5分から99%B、15分3%B(流量)。。 注:csBN-MSゲルスライスは、通常、低~中間ペプチドの豊富さと限られた程度の複雑さのサンプルをもたらす。したがって、nanoLC-MS/MS分析は、合理的な感度とシーケンシング速度、高質量分解能(>100,000)と最大ダイナミックレンジ(実質的に3〜4桁)を提供するセットアップで行う必要があります。ただし、長いカラム寸法や溶出グラデーションを 3 時間を超えて拡張する必要はありません。</li>
		<li>エミッタ内の別々の放出ペプチド(i.d. 75 μm; tip = 8 μm) を C18 材料で約 20 cm(粒度 = 3 μm)で手動で梱包します。質量分析計の加熱転写毛細血管(250°C)に2.3kV(正イオンモード)でサンプルをエレクトロスプレーします。</li>
		<li>次の計測器設定11: 最大 MS/MS 射出時間 = 400 ミリ秒で解析を実行します。除外期間 = 60 s;最小信号しきい値 = 5,000 カウント、フラグメント化された上位 10 個の前駆体。絶縁幅 = 1.0 m/z)。 注: 大量、保持時間、および多数のデータセットまたは測定におけるペプチド信号の割り当てを容易にするために、パラメータおよびハードウェア((すなわち、同じC18カラム/エミッタ上で)。</li>
	</ol></li>
	<li>タンパク質同定(前述の11として評価されるMSデータ)<ol>
<li>「msconvert.exe」ツール(ProteoWizardの一部)を使用して、フラグメントイオンスペクトルからピークリストを抽出します。</li>
		<li>50 ppm ペプチド質量公差を持つ予備データベース検索で、タンパク質に割り当てられたすべてのペプチドの中央値 m/z オフセットによって、各データセットのすべての前駆体 m/z 値をシフトします。</li>
		<li>UniProtKB/スイス-Prot データベースのすべてのマウス エントリに対して、適切な検索エンジン (ここではマスコット 2.6.2) で修正されたピーク リストを検索します (リリース 2018_11)。</li>
		<li>「アセチル(タンパク質N項)」、「カルバミドメチル(C)」、「Gln」を選択します。パイログル(N期Q)、グル |パイログル(N-タームE)、「酸化(M)」、「プロピオナミド(C)」を可変修飾として用いる。</li>
		<li>ペプチドとフラグメント質量公差をそれぞれ±5ppmと±0.8 Daに設定し、1回の見逃したトリプティック切断を可能にする。ペプチド同定の予想値カットオフを0.5以下に設定します。おとりデータベース検索を使用して、偽陽性検出率 (FDR) を判別します。FDR を 1% に設定するか、追加の品質基準を適用して信頼性の高い識別を確保します。 注:提示された実験では、3,500以上のタンパク質を同定し、平均ペプチドFDRは4.4±0.77%(n= 101スライスサンプル)、またはペプチドFDRを1%に設定した場合は3,000個のタンパク質を同定した。重要なことに、プロファイリングされたタンパク質の選択に、より厳しい基準が用いられた(2,568)。それは、少なくとも2つのペプチドで同定されたすべてのタンパク質を含み、そのうちの少なくとも1つはタンパク質特異的である、少なくとも101のスライスサンプルのうちの少なくとも1つであった。</li>
	</ol></li>
	<li>タンパク質定量<ol>
<li>FTフルスキャンから得られるタンパク質定量にはペプチド信号強度(ピークボリューム[PV])を使用し、適切なソフトウェア(ここではMaxQuant v1.6.3)を使用して保持時間と質量シフトを修正します。</li>
		<li>LOESS回帰を使用して、MSデータセットを1つずつ並べ合わせて(合計平均)ペプチド溶出時間を参照します。PVをペプチドに直接(MS/MSベースの同定)または間接的に割り当てます(すなわち、非常に狭い許容範囲内で一致するm/zと溶出時間に基づいて)。 注: このプロトコルは、「挿入された」ペプチドの割り当てに社内ソフトウェアを使用します。パラメータを設定すると、有効な m/z と溶出時間が±2 ppm と ±1 分の許容値にそれぞれ一致します (図 2A,Bを参照)。</li>
		<li>隣接するスライスサンプル間の相対ペプチド強度の中央値差から算出したペプチド強度再スケーリングによるペプチド負荷およびイオン化効率の系統的な実行変動に対して正しい(図2C)。</li>
		<li>内部 PV 整合性分析によって識別された外れ値および残りの偽割り当ての PV データをフィルター処理します。</li>
		<li>相対的なペプチド豊富プロファイルを得るすべてのスライスデータセット上の最大値に各ペプチドのPVを正規化します。</li>
		<li>最後に、相対タンパク質の豊富なプロファイルを、3 つの連続したスライスのウィンドウ上で最も相関するペプチド プロファイルの少なくとも 2 つ (および 6 または 50% 以上の値)の平均として計算します。これにより、欠落したPV値のブリッジングとノイズの低減が可能になります。 注:最終的に2,545(2,568の事前選択された)タンパク質プロファイルが得られた(図2D)。</li>
	</ol></li>
	<li>タンパク質複合体の特性特性<ol>
<li>局所マキシマ法を用いて最初にピーク検出を行い、これらのピークに連続して正規分布を適合させ、最大値とFWHMの位置(スライスインデックスまたは明らかな複雑なサイズ)を得ることによってタンパク質プロファイルを分析する(全幅)半分の最大強度)値(図4のインセット)。 注: データセットでは、カスタム スクリプトを使用してプロファイルが自動的に分析されます。FWHM の最小値は、アプローチの有効なサイズ分解能を示します (ここでは、6 x 0.25 = 1.5 mm)。</li>
		<li>log10(予測分子量)値の線形回帰解析に定義された分子質量(UniProtKB/スイス-Protデータベースで報告されている)を持つ参照タンパク質複合体ピークを使用して、スライス数指数を見かけの分子サイズに変換します(すなわち、kDaで明らかに複雑なサイズ)。 注:試料中の23のマーカー複合体を、(i)プロファイルピークの単分散形状、(ii)分子量の実験的支持、および(iii)調査されたBN-PAGEゲルセクションに沿った分布に基づいて、本試験(図4)で選択した。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者Uwe Schulteは、この研究で使用されるComplexioLyte 47を生産するLogopharm GmbHの従業員と株主です。同社は、非営利団体にComplexioLyte試薬を非営利で提供しています。

本研究は、以前にミトコンドリア調製11でベンチマークしたcsBN-MS技術に基づいて構築された研究で、サンプル調製、ゲル処理、およびMSデータ評価の改善を組み込んだ。大規模分離BN-PAGEゲルのセクションの焦点を絞った分析は、ミトコンドリア膜との研究に匹敵する品質測定を示す包括的なデータセットを提供した。質量および保持時間の誤差および実行可能なバリエーションは非常に低く保たれ、信頼できるタンパク質の豊富なプロファイルを決定するための基礎を提供した。サイズの解像度は良好に見え、半分の最大ピーク幅は6枚(1.5mm、図4に相当)、相対的なサイズ差は10%未満です(図3、図5A)。これらの値は、ミトコンドリアの以前のcsBN-MS分析のサイズ分解能品質を完全に満たしていなかった(選択された小さいゲルサンプリングステップサイズにもかかわらず)が、従来のBN-MSまたはサイズ排除MSの性能よりも有意に優れている最近人気となっているアプローチ20。
高い有効な複雑なサイズ分解能の重要性は、図3のシミュレーション実験(TPC1関連複合体を用いて)によって強調され、2D BN/SDS-PAGEウェスタンブロット解析ではほとんど解決できない(図1B)。これらの結果は、この場合の0.25mmスライスがオーバーサンプリングをもたらしたことを示唆していますが、これは有効なサイズ分解能を損なうことなく「定量ノイズ」の除去に有用であることが判明しました。したがって、前の結果11に沿って、〜0.3mmのサンプリングステップサイズが一般的に推奨される。
特に、TPC1関連複合体の判分は、従来のBN-MS5、6で手動スライスによって提供される最小のステップサイズである1mmゲルサンプリングによって完全に失われます。これは、強力なMS技術が利用可能であるにもかかわらず、非常に少数のタンパク質複合体とサブユニットが複合体プロファイリングによってde novoを同定したという事実を説明するかもしれません。csBN-MSはよい解決力に加えて、高い多様性を提供する。50 kDaから複数のMDaに及ぶ膜結合複合体および可溶性タンパク質複合体は、最小バイアス11を用いて単一の実験で効果的に解決することができる。これは、サイズ排除やイオン交換クロマトグラフィーなどの複合体プロファイリングに使用される代替分離技術とは対照的であり、特定のサイズ範囲または電荷特性を有する可溶性タンパク質のサブセットで動作します。欠点として、csBN-MSはスケーラビリティが低く(ゲル当たり約3mgのタンパク質の最大負荷)、技術的に困難であり、自動化することはできません。
全体として、csBN-MSベースの錯体プロファイリングが非ミトコンドリアターゲットに正常に適用できるだけでなく、関連するいくつかの課題を示す結果が示されています。したがって、タンパク質複合体の効率的な抽出および生化学的安定性は、より多くの最適化を必要とし、洗浄工程は依然として制限されてもよい。調査されたサイズウィンドウ内では、ミトコンドリアサンプルと比較して、よく焦点を当てた単分散タンパク質複合体の数は実際にかなり低かった(図示されていないデータ)。また、許容可能なゲル分離を得るためにBN-PAGEサンプル負荷を下げることをお勧めします。負荷が高いほど、スライスのために適切に処理するのがより困難な、より広いゲルレーンが必要になる場合があります(付属のビデオを参照)。さらに、サンプルのタンパク質の複雑さは、ミトコンドリア由来のスライスダイジェストよりも高く(約2倍)、より多くの欠落したPV値と減少したダイナミックレンジにつながりました。実際、図5に示す複合体の一部であると予想されるいくつかの小さなタンパク質は、分析に欠けていました。これらの問題は、より高速で機密性の高い MS 計測器またはデータに依存しない取得モードを使用することで、将来的に解決できます。
サンプル調製は、タンパク質複合体の検索、安定性、およびゲル分離品質に非常に重要です。パラメータと手順は、各ソース組織、細胞リサート、膜(画分)、および目的のタンパク質複合体ごとに最適化する必要があります。csBN-MS のアプリケーションの拡張に役立つ一般的な推奨事項を次に示します。
(i) サンプルを新鮮に準備し、温暖化/凍結、強い希釈、バッファー条件の変化、および不必要な遅延を避ける。
(ii) 塩を本質的に欠損しているバッファー(500~750 mMベタインまたはアミノカプロン酸に置き換える)、中性pHについて、非型化洗剤(タンパク質:1:4-1:10の間の洗剤比1:1:10)を含有するタンパク質複合体、可溶性タンパク質複合体に必要な洗剤なし);
(iii) 分析BN-PAGEによる洗剤条件の慎重な試験と調整は、複雑な可溶化の効率、試料中の膜タンパク質複合体の表現、安定性、および均質性に強く影響を与える可能性があるため、タンパク質洗剤ミセル。後者は、タンパク質がBN-PAGEゲル上の異なるバンド/複合体集団として焦点を合わせるための前提条件です。以前の文献は、中性洗剤の広い範囲を提供しています。しかし、DDM(n-ドデシルβ-d-マルトシド)1、2、4、5、6およびデジボニン3、5、7、8、 9、10、13、18は、これまでのBN-MS分析のための最も人気のある選択肢となっています。洗剤の状態は、必ずしも溶化効率とタンパク質相互作用の保存との間の妥協を表し、すべてのタイプの標的タンパク質およびソース材料に等しく適していない可能性があることを強調する必要があります。
(iv)フィブリル、フィラメント、ポリリシン、DNA、および豊富な低分子量成分(すなわち、代謝産物、脂質、またはペプチド)のような帯電したポリマーを除去する。これは、超遠心分離、ゲル濾過、または透析によって達成されてもよい。これは、総細胞または組織のリサテスのために特に重要です。
(v) クマシーG-250の添加(最終濃度0.05%-0.1%)スクロース(積載密度を高めるために、最終濃度10%-20%[w/v])を装填直前のサンプルに、短い超遠心分離によってクリアし、摂動することなくサンプルをロードし、その直後に実行を開始する。
将来の視点として、csBN-MSベースの複合体プロファイリングは、タンパク質複合体のダイナミクスや特定の生物学的条件に関連する変化を研究するための多重化のためのオプションを提供します。サイズ除外ベースのプロファイリング21のために提案された代謝ラベル付きサンプルの組み合わせ分離は簡単に見えますが、使用された分離とは独立して起こる複合体における自発的なサブユニット交換によって妨げられる可能性があります。メソッド。あるいは、ラベル付きサンプルは隣接するゲルレーンで解決することができ、高感度と堅牢性を持つ差動分析のために消化後にコスライスまたは組み合わせることができます。

BN-PAGE分離は、まず、BN-PAGEゲルレーンの手動スライスを使用してマジェラン1およびウェッセル2研究グループによってLC-MS分析(BN-MS)に直接結合されました。彼らの分析は、植物プラスティドとHEK細胞ミトコンドリアから既知のサブユニット組成を有する豊富な膜タンパク質複合体の数を同定した。しかし、これらの分析は包括的なものではなく、新しいアセンブリの公平な識別を可能にしませんでした。質量分析計とラベルフリー定量法の性能は、それ以来大幅に向上し、包括的なBN-MS分析を可能にしました。これは「コンプレックスプロファイリング」という用語を造語しました。例えば、ハイデと共同作業者は、ラット心臓ミトコンドリアを同定し、464個のミトコンドリアタンパク質をクラスタリングし、それによって多くの既知のアセンブリを確認した。さらに、彼らはTMEM126Bが特定のアセンブリ複合体3の新しい、重要なサブユニットであることを発見しました。同等の結果(437ミトコンドリアタンパク質プロファイルを有する)は、HEK細胞ミトコンドリア4の並列研究で得られた。
これらの改善にもかかわらず、複合プロファイリングのためのBN-MSの可能性を完全に抑制するいくつかの問題が残っています。主な制限は、2つの要因によって決定される複合体の有効なサイズ分解能です:(i)ゲルマトリックス細孔勾配の均一性とサンプル複合体の安定性/溶解性に依存するBN-PAGE分離の品質、および(ii)ゲルサンプリングのステップサイズは、従来の手動スライス5、6を使用する場合に最高の1mmである。サイズの解像度が低いだけでなく、微妙な複雑なアイソフォームや不均一性を見逃すだけでなく、偏りのない、de novo サブユニットの割り当てと定量化のダイナミックレンジと信頼にも悪影響を及ぼします。
その他の課題としては、タンパク質定量の精度と、質量分析によるサンプル中のタンパク質の豊富さの実際の動的範囲のカバレッジが含まれます。したがって、BN-MS錯体プロファイリングの適用は、より低い複雑性、標的複合体の高発現、および良好な可溶化特性(すなわち、プラスチド、ミトコンドリア、およびおよび有利な可溶化特性を有する生物学的試料に大きく制限されたままであった。微生物)6,7,8,9,10.
最近では、BN-PAGEゲルレーンの精密なサブミリメートルサンプリングと包括的なMS解析を組み合わせたクライオミクロトームスライスアシストBN-MS(csBN-MS)を導入し、高いタンパク質プロファイルの決定のための精巧なMSデータ処理を行いました。自信11.ラット脳からのミトコンドリア膜製剤への応用は、以前に満たされていない効果的な複合体サイズ分解能および酸化呼吸鎖複合体(OXPHOS)サブユニットの最大カバレッジ(すなわち、90 MSアクセス可能な90)を実証した。この例では、多数の新規タンパク質アセンブリも同定した。
ここでは、タンパク質複合体(特定の生物学的源に限定されない)の準備スケールBN-PAGE分離、大規模な準備BN-PAGEゲルの鋳造、広いゲルレーンのクライオミクロトームスライス、およびMSデータの最適化された手順を示します。処理。高解像度プロファイリングの性能は、マウス腎臓エンドソーム富化膜からのタンパク質複合体製剤について実証される。最後に、質量分析定量の分解能と精度を高めることによる利点について説明します。

<table><tbody><tr><td>30% アクリルアミド/Bis 溶液、37.5:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610158</td><td>アクリルアミドグラジエントゲル溶液 13%まで推奨</td></tr><tr><td>30% アクリルアミド/Bis 溶液、19:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610154</td><td>アクリルアミドグラジエントゲル溶液に推奨 >13%</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby Protein Blot Stain</td><td>Bio Rad</td><td>#1703127</td><td>ブロットメンブレン上の総タンパク質染色; 高感度で免疫検出に適合</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Serva</td><td>no. 35050</td><td>使用前の遠心分離液</td></tr><tr><td>ComplexioLyte 47</td><td>Logopharm</td><td>CL-47-01</td><td>膜タンパク質の穏やかな可溶化のためのすぐに使える洗剤緩衝液(1%)</td></tr> メディ<tr><td>ウム/ティッシュ凍結培地の埋め込み</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td></td><td>14020108926 クライオミクロトーム</td></tr><tr><td>でスライスするゲル切片用のメディウムを埋め込むことができますImmobilon-Pメンブレン、PVDF、0,45 &micro;m</td><td>メルク</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>ECL プライム ウエスタンブロッティング検出試薬</td><td>GE ヘルスケア</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>ゴム栓付きプラスチックシリンジ、20-30 ml</td><td>n.a.a.any</td><td></td> <td>サプライヤー、ゲルセクション埋め込みツールを作るために重要</td></tr><tr><td>広いカミソリ刃</td><td>n.a.n.a.any</td><td></td> <td>サプライヤー、BN-PAGE ゲルトリミング/レーンの切除用</td></tr><tr><td>金属管/シリンダー、約 4 cm</td><td>ゲルサンプルの埋め込みと凍結のための</td>長い<td>n.a.n.a.mold</td><td></td></tr> <tr><td>タンパク質LoBindチューブ、1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Nr. 0030108116</td><td>、吸収によるタンパク質/ペプチドの損失を最小限に抑えることを強くお勧めします</td></tr><tr><td>シーケンシンググレードの修飾トリプシン</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>C18 PepMap100 プレカラム、粒子径 5 & マイクロ;m</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>P/N 160454</td><td></td></tr><tr><td>PicoTip エミッター (i.d. 75 &micro;m;ヒント8&マイクロ;m)</td><td>新対物レンズ</td><td>FS360-75-8</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 & micro;m)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.93。</td><td>手動でパックされたカラム</td></tr><tr><td>ウサギ抗TPC1抗体</td><td>Gramsch Laboratories</td><td>custom production</td><td>described in Castonguay, et al., 2017 (参考文献 12)</td></tr><tr><td>Cy3-biotinylated goat anti-rabbit</td><td>IgG Vector Laboratories</td><td>CY-1300</td><td>described in Castonguay, et al., 2017 (参考文献 12)</td></tr><tr><td>ビオチン化 Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated</td><td>Vector Laboratories</td> <td>#B1325</td> described <td>in Castonguay, et al., 2017 (参考12)</td></tr><tr><td>クライオミクロトーム Leica CM1950</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743905</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean II Cell with wetblot</td><td>unit Bio</td><td>Rad n.a.for</td> <td>SDS-PAGE and Westernblot (no sold no than)</td></tr><tr><td>Penguin Midi Gel Electrophoresis System</td><td>PeqLab</td><td>n.a.for</td> <td>BN-PAGE (no sold any sold any)</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera</td><td>Zeiss /攪</td>拌(2つの部屋)selfmade、またはバイオラッド1652000または勾配ポリアクリルアミドゲルの鋳造のための1652001、グラジエントポリアクリルアミドゲルのキャスティングのためのグラジエントポリアクリルアミドゲルのキャスティングのためのフォトメトリクス<td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ(IP高精度マルチチャンネル)</td><td>Ismatec</td><td>ISM940</td><td></td></tr>、<tr><td></td><td>または</td>バイオラッド<td>1652000またはグラ</td><td>ジエントポリアクリルアミドゲルのキャスティングのためのマニュアルは、線形または双曲線グラジエントゲルをキャストするための指示を提供します(http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td></tr><tr><td>超遠心分離機 Sorvall M120 with S80 AT3 rotor</td><td>Sorvall / Thermo Scientific</td><td>n.a.for</td> <td>sample preparation (no sold any more)</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td><td></td></tr></tbody></table>

クライオスライシングbn-ms解析による高解像度複合プロファイリング

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

タンパク質は、一般に、動的タンパク質アセンブリまたは安定形成複合体の一部として、他のタンパク質との相互作用を通じて生物学的機能を発揮します。後者は、天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動(BN-PAGE)を用いて分子サイズに従ってエレガントに解決することができる。このような分離を敏感な質量分析(BN-MS)に結合することは十分に確立されており、理論的には生物学的サンプル中の抽出可能な錯体の徹底的な評価を可能にする。ただし、このアプローチはかなり面倒で、複雑なサイズの解像度と感度が限られています。また、その適用は豊富なミトコンドリアおよびプラスチドタンパク質に限定されたままである。したがって、大多数のタンパク質では、安定タンパク質複合体への統合に関する情報はまだ不足しています。ここでは、準備スケールのBN-PAGE分離、凍結ミクロトームスライスによる広範なゲルレーンのサブミリメートルサンプリング、ラベルフリータンパク質定量による質量分析を含む複合体プロファイリングに最適化されたアプローチを示します。重要な手順の手順とツールについて詳しく説明します。このアプリケーションとして、マウス腎臓からの可溶化エンドソーム富化膜画分の複合体解析について説明し、合計で2,545個のタンパク質をプロファイリングした。この結果は、細胞内イオンチャネルなどの均一で低ふさわしい膜タンパク質の同定と、グリコシル化アイソフォームを含む高解像度で複雑なタンパク質アセンブリパターンの同定を実証した。結果は独立した生化学的分析と一致している。要約すると、この方法論は、タンパク質(スーパー)複合体とそのサブユニット組成の包括的かつ公平な同定を可能にし、任意のタンパク質複合体の修行法、組み立て、および相互作用ダイナミクスを調査するための基礎を提供します。生物学的システム。

マイクロトームを用いて汎用性の高い解起性BN-MSプロトコルを高解像度の複合プロファイリング用に提示する。

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

csBN-MS技術の開発の中心的な目標は、様々な種類の組織および器官の形質膜でおよび全体のシグナル伝達の根源となるタンパク質複合体の組織および組み立てへの包括的なアクセスを得ることであった。csBN-MSは現在、特に膜タンパク質に関して、天然タンパク質複合体およびそのサブユニット組成の分析に対して最高の分解能の汎用性を提供しています。csBN-MS技術はげっ歯類の脳内の膜タンパク質集合体の複雑な混合物を分析するために開発されたが、それは容易に生物学的サンプルの任意のタイプの分析に適応することができる。私たちの方法の重要なステップの1つは、ゲル片の埋め込みとスライス前の切断面への正しい位置合わせです。これは、解析の解像度を低下させるので、引き裂くか、ゲルを圧縮しないように注意し、それが切断面に傾いないことを確認してください。当社の csBN-MS 技術には、良い結果を得るには重要ないくつかの実用的なステップがあります。これらの手順を単に記述するよりも、詳細に実行する方法を示す方が簡単です。この手順を開始するには、ポンプによって駆動される攪拌2チャンバー勾配ミキサーを使用して、線形または双曲線細孔勾配ゲルをキャストする。テキストプロトコルで概説されているように、フロントミキシングチャンバーとリザーバーチャンバーのためのソリューションを準備します。攪拌機を起動し、前面チャンバーの溶液に30マイクロリットルのAPSと2.5マイクロリットルのTEMEDを加えます。次に、ポンプを起動し、フロントバルブを開きます。約1分後、90マイクロリットルのAPSと5マイクロリットルのTEMEDを貯留槽に加え、チャンバー接続を開きます。ゲルを室温で少なくとも24時間ゆっくりと完全に重合させ、均質な細孔サイズ勾配を生成する。湿らせた場合、重合ゲルは摂氏4度で最大1週間直立して保存することができます。次に、0.5 と 2.0 ミリグラムのタンパク質を分離するための適切なスペースをガラスプレートの間に挿入して、ローディング スロットを準備します。スロットは、少なくとも3センチメートル幅でなければなりません。ランニングバッファーの場合は、50ミリモルトリシン、50ミリモルビストリス、および0.01%クマシーG-250からなる立ちカソードバッファーを準備します。50ミリモルビストリからなる標準的なアノードバッファーを準備します。約2.5ミリグラムの膜と2ミリリットルの可溶化緩衝液を氷上に1%非変性洗剤を含む。その後、130,000倍Gで11分間超遠心分離機を行う。400,000倍Gで1時間超遠心することにより、短い50%20%スクロースステップ勾配に可溶化物を濃縮する。この後、チューブの底部からショ糖勾配を収穫し、0.05%クマシーG-250を可溶化物に加え、サンプルをゲルにロードします。テキストプロトコルで概説されているように、3段階の電圧プロトコルを使用して、摂氏10度で一晩で準備BN-PAGEを実行します。ゲルを実行した後、ガラスプレートの間に保管しながら、文書化の目的でゲルをスキャンします。ゲル分離の品質を検査します。次に、プレートを解体し、対象の車線セクションを切除します。30%エタノールと15%の酢酸でレーンを2回30分間固定します。埋め込み培地のサンプルを移し、軌道シェーカー上のスローモーションでゲルスラブを維持しながら、少なくとも2時間浸漬し、平衡化することができます。次いで、固定ゲルレーンを、タンパク質移行フロント、またはバンドパターンと正確に平行なセクションに切断する。取り扱いが容易になるプラスチック製のフィルムサポートに各セクションを配置します。車線を下部に閉じられ、上部に中央に穿ゲートされたストッパー付きのオープンチューブに車線を移し、両方ともゲルセクションの上下端に正確に整列します。液体窒素に気筒を短時間浸し、凝固を迅速に開始します。透明埋め込み媒体は数秒以内に固まり、色が白くなります。埋め込み媒体で空洞を満たし、液体窒素にシリンダーを短時間浸し、マイナス20度で数時間完全に凍結させます。分解後、プラスチックフィルムを取り外し、組み込みゲルセクションのブロックを冷却された金属シリンダーに移します。シリンダーは直径が大きく、埋め込み媒体で外側に密封される。それは平らなサポートの上に置かれる。埋め込み媒体でシリンダーを充填し、前に述べたように完全に凍結します。円柱の反対側でこの手順を繰り返して、同一平面下サーフェスを持つソリッド ブロックを取得します。次に、ブロックをシリンダーから取り外し、埋め込み媒体を使用して、あらかじめ冷却された金属ホルダーに接着します。金属ホルダーを冷凍機に挿入します。ホルダーは、スライス面に対して慎重に整列する必要があります。ブロックをスライスプロセスに最適な温度に平衡化します。この収穫後、ゲルは、0.25ミリメートルのステップサイズの最終的な所望の厚さで次々とスライスし、低タンパク質結合特性を有する反応管に個別に移します。次いで、スライスは、トリプティックダイジェストおよび質量分析に供される。このプロトコルは、低いタンパク質を発現する非ミトコンドリア膜への高分解能複合体プロファイリングの適用を拡張する。複雑な分離は、非常に少ない移行アーティファクトを有する強く染色されたタンパク質バンドを示す。質量および保持時間におけるペプチドシグナルの偏差は、偽陽性ピーク体積割り当ての非常に低い率を示す。実行するバリエーションは、ピークボリュームデータセットの再スケールによって簡単に排除されます。得られたペプチド強度情報は、その後、相対的な豊富さの2545タンパク質プロファイルを再構築するために使用されます。タンパク質複合体の分解能に対するゲルサンプリングステップサイズの関連性は、隣接するスライスのデータセットを結合することによって評価された。0.25ミリメートルでは、TPC1関連の複雑な集団のサイズ分離は、ウェスタンブロット分析の結果とうまく一致しています。2つ以上のスライスを結合すると、TPC1の複雑な亜集団の差別が廃止されます。最後に、分析は、よく特徴付けられる複合体に関する情報を提供し、新しいサブユニットと複雑なアセンブリの存在を示しています。フェリチンの場合、相対的な存在量のために調整されたサブユニットプロファイルは、異なる重鎖/軽鎖ストイチオメトリを有する少なくとも3つの複雑なアイソフォームの存在を示唆している。対照的に、ニカリン-ノモ1複合体、ガンマ-セクレターゼコア複合体、およびGPI-トランスアミダス機械は、そのコアサブユニットの全サイズ範囲にわたる固定豊富比を示し、追加のタンパク質との関連から独立している。csBN-MS分析の重要なパラメータは、サンプル生化学、BNゲル品質、埋め込みおよびスライス中の適切な位置合わせ、および取得したMSデータの品質によって決定される複合体の効果的な分解能です。csBN-MSとタンパク質およびサンプルの同位体標識を組み合わせると、異なる病態生理学的、生物学的、または発達状態における複合体学的比較が可能になります。げっ歯類の脳から膜上で行われたcsBN-MSは、サブユニット組成とその機能に関する受容体、イオンチャネル、トランスポーターの巨大な多様性を明らかにし、ネイティブ調製物における3D構造の分析に役立ちます。

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