Name: 超高性能液体クロマトグラフィーによる免疫グロブリンG N-グリカン分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学ぶUPLCによるIgG N-グリカン分析手法。親水性相互作用クロマトグラフィーでグリカン構造を正確に分離し、医療診断への応用可能性を示す高感度で再現性のあるバイオ化学的手法です。

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この研究は、中国国立自然科学財団(81673247&81872682)とオーストラリア・中国共同補助金(NH&MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020)からの助成金によって支援されました。

議定書に含まれるすべての科目は、首都医科大学、北京、中国12の倫理委員会によって承認されています。書面によるインフォームド・コンセントは、研究の開始時に各被験者から得られた。
1. IgGの分離
<ol><li>結合緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水、PBS):1x PBS(pH=7.4)、中和緩衝液:10x PBS(pH=6.6-6.8)、溶離剤:0.1Mギ酸(pH=2.5)、溶離液中和溶液:1M炭酸アンモニウム、貯蔵緩衝液を含む化学物質を調製する: 20%エタノール + 20 mM トリス + 0.1 M NaCl (pH = 7.4), タンパク質 G: 0.1 M NaOH + 30% プロパン-2-オールのための洗浄液. 注: このプロトコルでは、pH のレベルが重要です。IgGの溶出は非常に低いpHを必要とし、酸加水分解によるシアル酸の損失の危険性がある。したがって、溶出は数秒以内に発生し、pHは急速に中性に回復し、IgGおよびシアル酸の完全性を維持する。</li>
	<li>サンプルを準備する:冷凍プラズマサンプルを解凍し、80 x gで10分間遠心分離し、タンパク質Gモノリシックプレートと上記の化学物質を室温で30分間残します(RT)。</li>
	<li>100 μL サンプル (最初の故障を防ぐために 2x を検出するために使用できます) を 2 mL コレクション プレート (ここでは、合計 6 つの標準サンプル、1 つの制御サンプル [超純水]、および 89 個のプラズマ サンプルを 96 ウェル プレート用に設計し、ランダムに割り当てられました)をプレートに)</li>
	<li>サンプルを 1x PBS で 1:7 (v/v) 希釈します。</li>
	<li>超純水200μL(繰り返し2倍)で0.45μmの親水性ポリプロピレン(GHP)フィルタープレートを洗浄します。</li>
	<li>希釈したサンプルをフィルタープレートに移し、真空ポンプ(266.6-399.9 Paで真空圧を制御)を使用して回収プレートにサンプルを濾過します。</li>
	<li>タンパク質Gモノリシックプレートの調製<ol>
<li>ストレージ バッファを破棄します。</li>
		<li>超純水2mL、1x PBSの2mL、0.1 Mギ酸の1mL、10x PBSの2 mL、1x PBSの2 mL(順次)でモノリシックプレートを洗浄し、真空ポンプを使用して流れる液体を除去します。</li>
	</ol></li>
	<li>濾過したサンプルをIgG結合および洗浄用のタンパク質Gモノリシックプレートに移し、次いで1x PBSの2mLでモノリシックプレートを洗浄します(クリーニング2xを繰り返します)。</li>
	<li>1 mLの0.1 Mギ酸でIgGを溶出し、真空ポンプで回収プレートにサンプルを濾過し、170μLの1M重炭酸アンモニウムを回収プレートに加えます。</li>
	<li>吸収分光光度計(最適波長=280nm)を用いてIgG濃度を検出する。<ol>
<li>ソフトウェアを開き、タンパク質CY3モードを選択します。</li>
		<li>超純水を2°L引き、画面にロードし、ソフトウェアの「ブランク」をクリックして画面をクリアします(1xを繰り返します)。</li>
		<li>超純水を2°L引き、画面にロードし、ソフトウェアのサンプルをクリックして超純水を検出します。</li>
		<li>IgGサンプルを2μL引き出して画面にロードし、ソフトウェアの「サンプル」をクリックしてサンプルを検出します。</li>
		<li>超純水を2°L引き、画面にロードし、ソフトウェアの「ブランク」をクリックして画面をクリアします。</li>
		<li>ソフトウェアを閉じます。 注: IgG 濃度を計算する式は次のとおりです。 CIgG = 吸光度 x 消滅係数 (13.7) x 1,000 μg/mL</li>
	</ol></li>
	<li>抽出したIgGを60°Cのオーブンで乾燥させ、抽出したIgG(300μL抽出IgGを4時間抽出)に保存します。<ol>
<li>濃度が1,000μg/mLを超える場合は、抽出されたIgGを300μL除去します。</li>
		<li>濃度が500~1,000μg/mLの場合は、抽出したIgGを350μL取り除く。</li>
		<li>濃度が200~500μg/mLの場合は、抽出したIgGを400μL取り除く。</li>
		<li>濃度が200μg/mLより小さい場合は、抽出されたIgGの600 μLを除去します。 注:IgGの濃度は、後続の検出のために>200 μg/mLであることが好ましいはずです。IgGの平均量は、最初のテストが失敗した場合に2倍にテストすることができる>1,200 μgであることが好ましいはずです。</li>
	</ol></li>
	<li>再利用のためのタンパク質Gモノリシックプレートの洗浄<ol>
<li>2mLの超純水、1mLの0.1 M NaOH(沈殿タンパク質を除去する場合)、4mLの超純水、1x PBS(順次)でプレートを洗浄し、真空ポンプを使用して流れる液体を除去します。</li>
		<li>超純水2mL、30%プロパン-2-オール(結合疎水タンパク質を除去する場合)の2mL、超純水2mL、1x PBS(順次)の4mLでプレートを洗浄し、真空ポンプを使用して流れる液体を除去します。</li>
		<li>1 mL のバッファー (20% エタノール + 20 Mm Tris + 0.1 M NaCl) でプレートを洗浄し、1 mL のバッファー (20% エタノール + 20 Mm Tris + 0.1 M NaCl) をプレートに追加し、プレートを 4 °C のままにします。</li>
	</ol></li>
</ol>2. グリカンリリース
<ol><li>乾燥したIgGを準備し、1.33%SDS、4%イゲパル(光から離れて保存)、およびRTで5x PBSを含む化学物質を保存します。</li>
	<li>250 ΜLの超純水で250U酵素を希釈してPNGase F酵素を調製します。</li>
	<li>IgGの変性<ol>
<li>30°Lの1.33%SDSを加え、ボルテックスで混ぜ、サンプルを65°Cのオーブンに10分間移し、オーブンから取り出して15分間休ませます。</li>
		<li>4%イゲパルの10 μLを加え、5分間振るインキュベーターの上に置きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>グリカンの除去と放出<ol>
<li>5x PBSの20 μLと0.1モル/L NaOHの30-35 μLを加え、8.0のpHを調節し、ボルテックスで混合します。PNGase F酵素を4μL加え、ボルテックスで混ぜます。次いで、37°水浴中で18〜20時間インキュベートする。</li>
		<li>放出したグリカンを60°Cのオーブンで2.5~3.0時間乾燥させます。</li>
		<li>さらに測定するまで、放出されたグリカンを-80°Cで保存します。 注: この手順は重要です。グリカン放出の鍵は、その効率を最大化するためにPNGase F酵素の活性を改善することです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. グリカンの表示と精製
<ol><li>2-アミノベンズアミド(2-AB)標識試薬を0.70mgの2-AB、10.50μLの酢酸、6mgのシアノボロ水素ナトリウム(NaBH3CN)、24.50μLのジメチルスルホキシド(DMSO)(総体積=35μL)で調製します。次に、酢酸、2-AB、および NaBH3CN を DMSO に順番に追加します。</li>
	<li>2-AB標識試薬の35μLを使用してグリカンにラベルを付け、標識されたグリカンを5分間発振器に移し、65°Cで3時間オーブンに移し、30分間RTに移す。 注: グリカンラベリングステップ全体を光から保護しながら実行する必要があります。</li>
	<li>0.2μm GHPフィルタープレートを200°Lのエタノール700°L、200°Lの超純水、200μLの96%アセトニトリル(4°)で除去し、真空ポンプを使用して廃棄物を除去します。</li>
	<li>2-AB標識グリカンの精製<ol>
<li>2-AB標識グリカンに100%アセトニトリルの700 μLを加え、5分間振とうインキュベーターに移します。</li>
		<li>134 x g での遠心分離は5 分間 (4 °C)。</li>
		<li>サンプルを0.2μm GHPフィルタープレートに2分間移し、真空ポンプを使用して濾液(流動液体)を除去します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-AB標識グリカンを96%アセトニトリル(4°)の200°Lで洗浄し、真空ポンプ5x-6xを使用して濾液(流動液体)を除去します。</li>
	<li>超純水3xの100°Lで2-ABラベルグリカンをエルテ。</li>
	<li>2-AB標識グリカンをオーブンに移し、60°Cで3.5時間乾燥させます。</li>
	<li>さらに測定するまで、ラベル付けされたN-グリカンを-80°Cに保存します。</li>
</ol>4. 水酸相互作用クロマトグラフィーとグリカンの分析
<ol><li>UPLC機器のコンディショニングと移動相の準備<ol>
<li>溶媒A:100 mMアンモニウムギ酸(pH=4.4)、溶媒B:100%アセトニトリル、溶媒C:90%超純水(10%メタノール)、および溶媒D:50%メタノール(超純水)を含む移動相を調製する。</li>
		<li>モバイルフェーズを制御するソフトウェアを開きます。</li>
		<li>流量0.2mL/分(50%溶剤Bおよび50%溶媒C)で30分間のバランスをとり、流量0.2mL/分(25%の溶媒Aおよび75%の溶媒B)で20分間バランスをとり、次いで流量0.4 mL/分のバランスをとります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>標識したN-グリカンを100%アセトニトリルと超純水の混合物の25°Lで2:1の比率(v/v)で溶解します。次いで、134×gで5分間(4°)で遠心分離機を行い、標識されたN-グリカンの10μLをUPLC機器にロードする。</li>
	<li>標識されたN-グリカンを流量0.4mL/分で、75%~62%のアセトニトリルの直線勾配で25分間分離します。次いで、60°CのUPLC上でデキストランキャリブレーションラダー/糖ペプチドカラムによる分析実行を行う(ここでは、サンプルを注射前に4°Cに保った)。</li>
	<li>330 nmおよび420 nmの励起および発光波の長さでN-グリカン蛍光をそれぞれ検出する。</li>
	<li>ピーク位置と保持時間に基づいてグリカンを統合します。</li>
	<li>各グリカンピーク(GP)/すべてのグリカンピーク(GP)(パーセンテージ、%)次のように: GP1: GP1/GP*100, GP2: GP2/GP*100, GP3: GP3/GPs*100 など</li>
</ol>

<ol><li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%2C+glycoproteomics+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).</li>
<li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Biology%22%5BJournal%5D)">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li>
<li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Glycosylation+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Antibodies%22%5BJournal%5D)">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392(2013).</li>
<li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65(2018).</li>
<li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).</li>
<li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841(2013).</li>
<li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779(2014).</li>
<li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuropsychopharmacology+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20(2014).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235(2018).</li>
<li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension%3A+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).</li>
<li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22GLYCOBIOLOGY%22%5BJournal%5D)">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).</li>
<li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).</li>
<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
<li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963(2016).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

UPLCは相対定量分析方法5、15として機能する。この結果は、UPLCが再現性と相対的な定量精度を備えた安定した検出技術であることを示しています。各ピークのグリカンの量は、UPLCを使用して総統合領域のパーセンテージとして表されます。相対定量は、試験サンプルの比較性を向上させます。さらに、96ウェルタンパク質Gプレートを使用して、一度に96サンプルでIgGを精製し、高スループット検出を行います。IgGに結合するタンパク質Gの能力は、タンパク質Aの能力よりも大きく、以前の研究15、16で説明したように。
また、IgG N-グリカンの構造は明確に分離されている。由来のIgGグリカンは、初期IgG N-グリカンによって計算されるガラクトシル化、シアリル化、二分GlcNAc、およびコアフコシル化のレベルを記述する。以前の研...

ヒトタンパク質のN-グリコシル化は、一般的かつ必須の翻訳後修飾1であり、比較的正確に疾患の発生および発症を予測するのに役立ち得る。その構造の複雑さのために、5,000以上のグリカン構造があり、疾患の診断および予測バイオマーカーとして大きな可能性を提供することが期待される2.免疫グロブリンG(IgG)に結合したN−グリカンは、IgGの機能に必須であることが示されており、IgG N-グリコシル化は、プロおよび抗炎症系3との間のバランスに関与する。微分IgG N-グリコシル化は、疾患の発症および進行に関与し、疾患病理に関与する素因および機能機構の両方を表す。IgG N-グリコシル化の炎症役割は、老化、炎症性疾患、自己免疫疾患、および癌4に関連している。
検出技術の開発に伴い、 以下の方法は、高スループットグリコミクスで最も広く使用されています:蛍光性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC-FLR)、レーザー誘導蛍光検出による多重キャピラリーゲル電気泳動 (xCGE-LIF)、マトリックスアシストレーザー脱離/イオン化時間質量分析(MALDI-TOF-MS)、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析法(LC-ESI-MS).これらの方法は、低フラックス、不安定な結果、および低感度特異性の以前の欠点を克服しています5,6.
UPLCは、IgG N-グリコシル化と特定の疾患(すなわち、老化7、肥満8、脂質異常症9、II型糖尿病10、高血圧11、虚血性脳卒中12、およびパーキンソン病13)との関連を探索するために広く使用されている。上記の他の3つの方法と比較して、UPLCは以下の利点を有する5、14である。まず、相対的な定量分析方法を提供し、総面積正規化を伴うデータ分析により、各サンプルの比較性が向上します。第二に、機器のコストと必要な専門知識は比較的低いため、グリコシル化バイオマーカーの実装と臨床応用への変換が容易になります。ここでは UPLC の概要を紹介します。

<table><tbody><tr><td>2-アミノベンズアミド、2-AB</td><td>シグマ、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル収集プレート</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルフィルタープレート</td><td>Pol</td><td>0.45 um GHP</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルモノリシックプレート</td><td>BIA セパレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレートローター</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Acetic</td><td>acid Sigma、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Huihai Keyi技術有限公司、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Shenggong生物工学有限公司、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ギ酸アンモニウム</td><td>北京Minruida技術有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンスタントシェーキングインキュベーター/</td><td>ロッカーZhicheng分析機器製造有限公司、中国</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン校正はしご/糖ペプチドカラム</td><td>Watts技術有限公司、中国</td><td>BEHカラム</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>シグマ、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>Shenggong生物工学有限公司、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気オーブンテスター</td><td>機器株式会社</td><td>202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>Empower 3.0</td><td>Waters technology Co., Ltd, America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>シグマ, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB ラベリングキット</td><td>シグマ, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速遠心分離機</td><td>Eppendorf Co., Ltd, ドイツ</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低温遠心分離機</td><td>Eppendorf Co., Ltd, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低温冷蔵庫</td><td>Qingdao Haier Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マニホールド 96 ウェル プレート</td><td>ワット技術株式会社、中国</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Huihai Keyi技術有限公司、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q純水</td><td>メーターMillipore株式会社、アメリカ</td><td>アドバンテージA10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shenggong生物工学株式会社、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PHテスター</td><td>ザルトリウス株式会社、ドイツ</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、PBS</td><td>Shenggong生物工学Co.、株式会社、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>Eppendorf株式会社、ドイツ</td><td>4672100、0.5-10&mu;L&10-100μ;L&20-200μL&1000μ;l</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F酵素</td><td>シグマ、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>Shenggong生物工学有限公司、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Huihai Keyi技術有限公司、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>シグマ、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Shenggong生物工学有限公司、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)</td><td>シグマ、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>上海元渓計器有限公司</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>トランスファー液体ガン</td><td>スマーフェル科学技術有限公司、中国</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>・アムレスコ、アメリカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超低温冷蔵庫</td><td>サーモ株式会社、アメリカ</td><td>MLT-1386-3-V;MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>超高速液体クロマトグラフィー</td><td>Watts technology Co., Ltd, China</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>Watts technology Co., Ltd, China</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Volatilizing machine/Dryer</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>テスター機器株式会社</td><td>DK-98-IIA</td><td></td></tr><tr><td>計量天秤</td><td>上海Jingke科学機器有限公司</td><td>MP200Bの</td><td></td></tr></tbody></table>

超高性能液体クロマトグラフィーによる免疫グロブリンg n-グリカン分析

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

グリコミックスは、疾患感受性、創薬、精密医療のための次世代バイオマーカーの発見に大きな可能性を秘めた、オミックスシステム研究の新しいサブスペシャリティです。代替IgG N-グリカンは、いくつかの一般的な慢性疾患で報告されており、臨床応用に大きな可能性を有することが示唆されている(すなわち、疾患の診断および予測のためのバイオマーカー)。IgG N-グリカンは、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)の方法を用いて広く特徴付けられている。UPLCは、再現性と高い相対定量精度を備えた安定した検出技術です。さらに、IgG N-グリカンの構造が明確に分離され、血漿中のグリカン組成と相対的な存在量が特徴です。

図1に示すように、IgG N-グリカンはピーク位置と保持時間に基づいて24個の初期IgGグリカンピーク(GP)に分析した。N-グリカン構造は、以前の研究(表1)15に従った質量分析検出を通じて利用可能である。結果が同等であることを確認するために、各ピークのグリカン量を総集積面積に対するパーセンテージで表した総面積正規化が適用された。
この方法の再現性および安定性を評価するために、標準試料を6回並行して試験した。表2に示すように、24 GPの変動係数(CV)は1.84%-16.73%、15(62.50%)そのうち10%を下回った。比率が比較的小さい GP (≤1.16%)高い測定誤差(CVの10%以上)を示した。さらに、76個体から組み合わせたI...

免疫グロブリンG(IgG)N-グリカンは、親水性相互作用クロマトグラフィーUPLCを用いて特徴付けられている。 また、IgG N-グリカンの構造は明確に分離されている。ここでは、研究設定で広く使用できるように、この実験方法の紹介です。

超高性能液体クロマトグラフィーによる免疫グロブリンG N-グリカン分析

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

超高性能液体クロマトグラフィーは、その感度に起因するIgG n-glycanの正確な分析のための技術を確立し、グリカンの特定の情報を提供する能力を有するこの方法は使いやすく、異なる比較的低コストの増分、高い再現性異性体を有する。血漿中のタンパク質の測定は魅力的である可能性があります。薬で。また、グリコーゼ塩基および集団を含むそのような生物学的にIgGと関連する。不純な状態のことは、グリカンでIgGをテストするために使用されることを知っています。実際には、タンパク質のn-グリカンをテストすることができます。これは、2つの純粋な状態のクロスバウンドタンパク質で必要とされ、実験プロセスを標準化する必要がある一方で、OR実験プロセスは比較的簡単であるタンパク質に適用することができる。エンドツーエンドの実験プロセスは、操作に3日かかり、実験のスキルを習得するために、実験ステップを暗記する必要があります。サンプルを調製するために、凍結したプラズマサンプルを解凍する。その後、80回Gで遠心分離機を10分間行う。プロテインGモノリシックプレートを室温で30分間放置します。2ミリリットルの回収プレートの各ウェルに100マイクロメートルのサンプルを移します。1つのコントロールサンプルとして超純水を加えます。サンプルを1 X PBSで1~7体積比で希釈します。200マイクロリットルの超純水で0.45ミクロンの親水性ポリプロポレンフィルタープレートを洗浄します。クリーニングを 2 回繰り返します。希釈したサンプルをフィルタープレートに移し、266.6~399.9パスカルの真空ポンプを使用してサンプルを集合プレートにフィルターします。タンパク質Gモノリシックプレートを調製するために、まず保存バッファーを廃棄する。2ミリリットルの超純水、1 X PBS 2ミリリットル、0.17モルギ酸1ミリリットル、10 X PBS2ミリリットル、X PBS1個2ミリリットルを順次洗浄します。真空ポンプを使用して、次の液体を取り除きます。マルチチャネルパイプを使用して、フィルタされたサンプルをIgG結合および洗浄用のタンパク質Gモノリシックプレートに移します。次に、1つのX PBSを2ミリリットル加え、モノリシックプレートを洗浄します。真空ポンプを使用してPBSを取り出し、さらに2回洗浄を繰り返します。0.17モルギ酸の1ミリリットルでIgGをイルテし、真空ポンプでサンプルを回収プレートにフィルターします。次に、170マイクロリットルの重炭酸大モルアンモニウムを回収プレートに加えます。280ナノメートルの最適波長で吸収スペクトルメーターを使用してIgG濃度を検出します。抽出したIgGをオーブンに入れ、摂氏60度で3時間乾燥させます。原稿に記載されている濃度に従って観察される量を決定し、マイナス80°Cに保存します。乾燥したIgGを収集し、室温で1.33%SDS、4%IgePalと5%PBSを含む化学物質を保存します。250マイクロリットルの超純水で250単位の酵素を希釈して、インドグリコシダーゼF酵素を調製します。IgGを変性させるには、30マイクロリットルの1.33%SDSを加え、渦を混ぜて混ぜます。サンプルを65°Cのオーブンに10分間移します。その後、オーブンから取り出し、15分間冷まします。同じサンプルに4%のIgePalの10マイクロリットルを加え、5分間揺れるインキュベーターの上に置きます。20マイクロリットルのX PBSと0.1モル水酸化ナトリウムの30〜35マイクロリットルを加えてpHを8.0に調節し、渦を混ぜて混合します。4マイクロリットルのエンドグリコシダーゼF酵素を加え、渦を混ぜて混ぜます。その後、摂氏37度の水浴で18〜20時間インキュベートする。翌日、放出したギルカンを60°Cのオーブンに入れ、2時間半から3時間乾燥します。さらに測定するまで、リリースグリカンをマイナス80°Cで保存します。2つのアミノベンジミド標識試薬をDMSO24.5マイクロリットル、酢酸10.5マイクロリットル、0.7ミリグラムの2つのアミノベンジミド、および6ミリグラムのシアノボロ水素化ナトリウムで調製します。次に、暗室で、2つのアミノベンジミド標識試薬の35マイクロリットルを添加してグリカンにラベルを付ける。ラベル付きのglcansを発振器に5分間移し、摂氏65度で3時間オーブンに移します。その後、室温まで30分移します。IgG n-グリケースでは、不純状態の蛍光検出によって検出されるために標識します。200マイクロリットルの70%エタノール、200マイクロリットルの超純水、摂氏4度で96%のアセトニトリルの200マイクロリットルを用いて0.2ミクロンGHPフィルタープレートを退却。次に、真空ポンプを用いて廃棄物を除去する。グリカンに標識した2つのアミノベンジミドを精製するには、サンプルに100%アセトニトリルの700マイクロリットルを加え、5分間振盪インキュベーターに移します。摂氏4度で5分間Gの134倍の遠心分離機。スーパーナテントを0.2ミクロンのGHPフィルタープレートに2分間移し、真空を使用して濾液を取り除きます。200マイクロリットルの96%アセトニトリルを200マイクロリットルでグリカンとラベルした2つのアミノベンジミドを摂氏4度で洗浄し、真空ポンプを用いて濾液を5~6回除去する。100マイクロリットルの超純水でラベル付けされた2つのアミノベンジミドを3回イルタート。ラベル付けした2つのアミノベンジミドをオーブンに移し、摂氏60度で3時間半乾燥させます。さらに測定されるまで、ラベル付きn-グリカンをマイナス80°Cで保存します。まず、ソフトウェアを開いてモバイルフェーズを制御します。UPLCの器具を50%の溶媒Bと50%の溶媒Cで、毎分0.2ミリリットルの流量で30分間洗浄します。その後、25%の溶媒Aと75%の溶媒Bで毎分0.2ミリリットルの流量で20分間洗浄する。次に、毎分0.4ミリリットルの流量を加えます。標識したn-グリカンを100%アセトニトリルと超純水の混合物の25マイクロリットルを体積比で2~1体積で溶解します。その後、摂氏4度で5分間Gの134倍の遠心分離機を使用し、ドライパイプを使用して10マイクロリットルのスーパーナテントをUPLC機器に積み込みます。標識したn-グリカンを1分間0.4ミリリットルの流量で分離し、線形勾配は75%から62%のアセトニトリルで25分間分離します。次いで、摂氏60度のUPLC上でデクテラン較正ラダーグリコペプチドカラムによる分析実行を行う。X引用でn-グリカン蛍光を検出し、それぞれ330ナノメートルと420ナノメートルの発光波長を検出します。この図に示すように、IgG n-グリカンは、ピーク位置および保持時間に基づいて24の初期IgGグリカンピークに分析した。n-グリカン構造は質量分析法の検出によって24のタイプで利用できる。この方法の再現性と安定性をアセスするために、標準試料を6回並行して試験した。比較的小さな割合のグリカンピークは、変動係数の10%以上の高い測定誤差を示した。この部分では、特に末端を確立するために、IgG n-グリカン構造の確立に形成することが重要であり、その代わりに3.3で見つかったIgG n-グリケースは、IgGの重要性において重要である。からグリカンは異なることを知られています。グリカン原始トトミックの発展と, それは今日の診断の可能性として使用することができるようにこれに情報を探求するためにグリカンに組み合わ.この技術開発の後、新しい方法を提供し、

immunoglobulin-g-n-glycan-analysis-ultra-performance-liquid

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

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チャイニーズハムスター卵巣細胞における迅速な抗体糖工学

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学ぶUPLCによるIgG N-グリカン分析手法。親水性相互作用クロマトグラフィーでグリカン構造を正確に分離し、医療診断への応用可能性を示す高感度で再現性のあるバイオ化学的手法です。

超高性能液体クロマトグラフィーによる免疫グロブリンG N-グリカン分析

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