超高性能液体クロマトグラフィーによる免疫グロブリンG N-グリカン分析

免疫グロブリンG(IgG)N-グリカンは、親水性相互作用クロマトグラフィーUPLCを用いて特徴付けられている。 また、IgG N-グリカンの構造は明確に分離されている。ここでは、研究設定で広く使用できるように、この実験方法の紹介です。

超高性能液体クロマトグラフィーは、その感度に起因するIgG n-glycanの正確な分析のための技術を確立し、グリカンの特定の情報を提供する能力を有するこの方法は使いやすく、異なる比較的低コストの増分、高い再現性異性体を有する。血漿中のタンパク質の測定は魅力的である可能性があります。薬で。

また、グリコーゼ塩基および集団を含むそのような生物学的にIgGと関連する。不純な状態のことは、グリカンでIgGをテストするために使用されることを知っています。実際には、タンパク質のn-グリカンをテストすることができます。

これは、2つの純粋な状態のクロスバウンドタンパク質で必要とされ、実験プロセスを標準化する必要がある一方で、OR実験プロセスは比較的簡単であるタンパク質に適用することができる。エンドツーエンドの実験プロセスは、操作に3日かかり、実験のスキルを習得するために、実験ステップを暗記する必要があります。サンプルを調製するために、凍結したプラズマサンプルを解凍する。

その後、80回Gで遠心分離機を10分間行う。プロテインGモノリシックプレートを室温で30分間放置します。2ミリリットルの回収プレートの各ウェルに100マイクロメートルのサンプルを移します。

1つのコントロールサンプルとして超純水を加えます。サンプルを1 X PBSで1~7体積比で希釈します。200マイクロリットルの超純水で0.45ミクロンの親水性ポリプロポレンフィルタープレートを洗浄します。

クリーニングを 2 回繰り返します。希釈したサンプルをフィルタープレートに移し、266.6~399.9パスカルの真空ポンプを使用してサンプルを集合プレートにフィルターします。タンパク質Gモノリシックプレートを調製するために、まず保存バッファーを廃棄する。

2ミリリットルの超純水、1 X PBS 2ミリリットル、0.17モルギ酸1ミリリットル、10 X PBS2ミリリットル、X PBS1個2ミリリットルを順次洗浄します。真空ポンプを使用して、次の液体を取り除きます。マルチチャネルパイプを使用して、フィルタされたサンプルをIgG結合および洗浄用のタンパク質Gモノリシックプレートに移します。

次に、1つのX PBSを2ミリリットル加え、モノリシックプレートを洗浄します。真空ポンプを使用してPBSを取り出し、さらに2回洗浄を繰り返します。0.17モルギ酸の1ミリリットルでIgGをイルテし、真空ポンプでサンプルを回収プレートにフィルターします。

次に、170マイクロリットルの重炭酸大モルアンモニウムを回収プレートに加えます。280ナノメートルの最適波長で吸収スペクトルメーターを使用してIgG濃度を検出します。抽出したIgGをオーブンに入れ、摂氏60度で3時間乾燥させます。

原稿に記載されている濃度に従って観察される量を決定し、マイナス80°Cに保存します。乾燥したIgGを収集し、室温で1.33%SDS、4%IgePalと5%PBSを含む化学物質を保存します。250マイクロリットルの超純水で250単位の酵素を希釈して、インドグリコシダーゼF酵素を調製します。

IgGを変性させるには、30マイクロリットルの1.33%SDSを加え、渦を混ぜて混ぜます。サンプルを65°Cのオーブンに10分間移します。その後、オーブンから取り出し、15分間冷まします。

同じサンプルに4%のIgePalの10マイクロリットルを加え、5分間揺れるインキュベーターの上に置きます。20マイクロリットルのX PBSと0.1モル水酸化ナトリウムの30〜35マイクロリットルを加えてpHを8.0に調節し、渦を混ぜて混合します。4マイクロリットルのエンドグリコシダーゼF酵素を加え、渦を混ぜて混ぜます。

その後、摂氏37度の水浴で18〜20時間インキュベートする。翌日、放出したギルカンを60°Cのオーブンに入れ、2時間半から3時間乾燥します。さらに測定するまで、リリースグリカンをマイナス80°Cで保存します。

2つのアミノベンジミド標識試薬をDMSO24.5マイクロリットル、酢酸10.5マイクロリットル、0.7ミリグラムの2つのアミノベンジミド、および6ミリグラムのシアノボロ水素化ナトリウムで調製します。次に、暗室で、2つのアミノベンジミド標識試薬の35マイクロリットルを添加してグリカンにラベルを付ける。ラベル付きのglcansを発振器に5分間移し、摂氏65度で3時間オーブンに移します。

その後、室温まで30分移します。IgG n-グリケースでは、不純状態の蛍光検出によって検出されるために標識します。200マイクロリットルの70%エタノール、200マイクロリットルの超純水、摂氏4度で96%のアセトニトリルの200マイクロリットルを用いて0.2ミクロンGHPフィルタープレートを退却。

次に、真空ポンプを用いて廃棄物を除去する。グリカンに標識した2つのアミノベンジミドを精製するには、サンプルに100%アセトニトリルの700マイクロリットルを加え、5分間振盪インキュベーターに移します。摂氏4度で5分間Gの134倍の遠心分離機。

スーパーナテントを0.2ミクロンのGHPフィルタープレートに2分間移し、真空を使用して濾液を取り除きます。200マイクロリットルの96%アセトニトリルを200マイクロリットルでグリカンとラベルした2つのアミノベンジミドを摂氏4度で洗浄し、真空ポンプを用いて濾液を5~6回除去する。100マイクロリットルの超純水でラベル付けされた2つのアミノベンジミドを3回イルタート。

ラベル付けした2つのアミノベンジミドをオーブンに移し、摂氏60度で3時間半乾燥させます。さらに測定されるまで、ラベル付きn-グリカンをマイナス80°Cで保存します。まず、ソフトウェアを開いてモバイルフェーズを制御します。

UPLCの器具を50%の溶媒Bと50%の溶媒Cで、毎分0.2ミリリットルの流量で30分間洗浄します。その後、25%の溶媒Aと75%の溶媒Bで毎分0.2ミリリットルの流量で20分間洗浄する。次に、毎分0.4ミリリットルの流量を加えます。

標識したn-グリカンを100%アセトニトリルと超純水の混合物の25マイクロリットルを体積比で2~1体積で溶解します。その後、摂氏4度で5分間Gの134倍の遠心分離機を使用し、ドライパイプを使用して10マイクロリットルのスーパーナテントをUPLC機器に積み込みます。標識したn-グリカンを1分間0.4ミリリットルの流量で分離し、線形勾配は75%から62%のアセトニトリルで25分間分離します。

次いで、摂氏60度のUPLC上でデクテラン較正ラダーグリコペプチドカラムによる分析実行を行う。X引用でn-グリカン蛍光を検出し、それぞれ330ナノメートルと420ナノメートルの発光波長を検出します。この図に示すように、IgG n-グリカンは、ピーク位置および保持時間に基づいて24の初期IgGグリカンピークに分析した。

n-グリカン構造は質量分析法の検出によって24のタイプで利用できる。この方法の再現性と安定性をアセスするために、標準試料を6回並行して試験した。比較的小さな割合のグリカンピークは、変動係数の10%以上の高い測定誤差を示した。

この部分では、特に末端を確立するために、IgG n-グリカン構造の確立に形成することが重要であり、その代わりに3.3で見つかったIgG n-グリケースは、IgGの重要性において重要である。からグリカンは異なることを知られています。グリカン原始トトミックの発展と, それは今日の診断の可能性として使用することができるようにこれに情報を探求するためにグリカンに組み合わ.

この技術開発の後、新しい方法を提供し、