赤外線ナノ分光法と原子間力顕微鏡による個々のタンパク質凝集物の特徴付け

原子間力顕微鏡に基づく方法により、ナノスケールで生体分子プロセスを形態学的化学的または構造的分解能で特徴付け、最終的に生物学に関する新たな前線の展望を開く。単一分子法は、タンパク質凝集の理解に特に関連する特徴である、非常に異種系の調査を可能にする。単一分子と逆アプローチを組み合わせることで、タンパク質の挙動、ヒト疾患との関連、薬理学的介入の設計に関する基本的な情報を得ることができます。

さらに、この方法は、薬物送達、用途および他のバイオテクノロジーの目的のための生体材料の化学的および構造的特性を研究するためにうまく適用することができる。最初は高解像度の正しい AFM パラメータを設定するのが難しい場合があり、フィブリラの凝集体を測定しながら AFM を簡単に設定できます。AFMイメージングの30分前に、AFMシステムの電源を入れ、セットアップとプローブをクリックします。

プローブ変更ウィンドウで、次のをクリックして Z フォーカスステージを準備します。AFMビームスイッチがオンの場合はオフにし、鳩尾ロックのロックを解除します。ヘッドをシステムから取り外し、プローブチェンジウィンドウで[次へ]をクリックします。

AFMカンチレバーをプローブホルダーに取り付けます。ヘッドをシステムに接続し、鳩尾ロックをロックします。AFMレーザービームスイッチをオンにして、プローブチェンジウィンドウで[次へ]をクリックします。

ポップアップ ウィンドウで、カンチレバーの種類が変更されない場合は [いいえ] をクリックし、オプティカル アライメント ノブを調整してカンチレバーを見つけます。カンチレバーにフォーカスを合わせ、[次へ]をクリックします。ポップアップ ウィンドウで、カンチレバーにフォーカスがある場合は [はい] をクリックします。

検出レーザービームノブを使用して、レーザービームをカンチレバーの端に配置します。偏向したレーザービームノブを使用して、4つの象限フォトダイオードで測定された総信号を少なくとも1ボルトより大きく最大化します。プローブ変更ウィンドウで、[次へ] をクリックして閉じます。

カンチレバーが熱安定性に達するまで15分待った後、必要に応じて位置感度フォトダイオード上の偏向レーザー光の位置を調整する。NCM スイープをクリックし、振動の希望する振幅を選択し、使用フェーズをクリックして[自動]をクリックします。カンチレバーを、1メートルあたり40ニュートンのスプリング定数でカンチレバーの振動の最初の自由共鳴の最大値に近い約300キロヘルツに調整します。

サンプルホルダーにサンプルを置きます。スキャン領域をクリックし、解像度を 256 x 256 ~ 1024 x 1024 ピクセルに設定し、スキャン サイズとピクセル数を設定します。スキャン速度を 0.3 に 1 ヘルツに設定し、スキャン領域を 1 ~ 5 x 5 x 5 マイクロメートル平方に設定します。

サンプルに光学ビューを焦点を当て、サンプルサーフェスにアプローチするアプローチをクリックします。次に、100マイクロメートルを持ち上げてサンプルの表面から100マイクロメートル上にAFMチップを上げ、サンプルの光学画像を拡大します。フォーカスステージバーをクリックして、サンプルのサーフェスにビューをフォーカスし、矢印を使用して目的のサンプルの領域を移動します。

アプローチをクリックしてサーフェスをエンゲージし、ラインスキャンをクリックして、先端がサーフェスウェルに従っているかどうかを確認します。必要に応じて、設定点を調整します。次にスキャンをクリックしてサンプル表面のイメージングを開始し、イメージング中にデルタ20を超えない位相変化の一定のレジームを維持し、大きなイメージング力を回避し、独立したサンプル間の一貫性を維持します。

IRナノスペクトロスコピーイメージングの場合、分析の30〜60分前に、AFM IRシステムとIRレーザーをオンにします。内蔵のソフトウェアを開いて機器を制御し、ファイルと新しいファイルをクリックして新しいナノIRファイルを開きます。AFM IRシステムを起動し、計測器カバーを開くには、初期化をクリックします。

公称半径30ナノメートル、1メートル当たり0.2ニュートンのスプリング定数を持つシリコンゴールドコーティングプローブをAFM IRシステムに取り付け、接触モードでサンプルを測定します。AFM プローブセクションと次の[負荷]をクリックします。プローブ矢印にフォーカスを使用してカメラを片持ちレバーに焦点を当て、先端を使用して十字線を片持ちの端に配置します。

検出レーザーの位置をコントロールするノブを回転させ、レーザーをカンチレバーの端に配置します。レーザーノブを回転させて、4つの象限フォトダイオードで測定した合計を3ボルトより大きい値に検出して最大化します。偏向ノブを回転させて片持ち偏向をマイナス1ボルトに調整し、次をクリックします。

その後、楽器のカバーを閉じます。プローブ矢印に焦点を当てて、カメラをサンプルに焦点を当て、先端をクロスヘアの矢印に合わせ、サンプルの対象領域を移動します。次をクリックして、エンゲージします。

顕微鏡ウィンドウで、形態の高さ、IR吸収のための振幅2、サンプル接触共鳴にチップをマッピングするPLL周波数を選択します。AFM スキャン セクションで、AFM イメージングの例に示すようにパラメータを設定し、スキャンをクリックして形態図を取得します。モルフォロジーマッピングが完了したら、顕微鏡ウィンドウで高さマップをクリックして、プローブを 1 つの集合体の上に配置します。

ナノ IR セクションで、[IR の開始] をクリックして、サンプルを IR レーザーで照らします。カンチレバーに赤外線レーザーを集中するには、「最適化」をクリックし、波数として1655センチメートルを入力します。[追加] をクリックして IR レーザーの位置を決定し、[更新] をクリックして、その位置を片持ちレバーに合わせます。

一般セクションで、相対フィールドの吸光度が高いと予想される波番号を入力し、バンドパスフィルタオプションを無効にします。[IRの開始]をクリックし、メーターの読み取りとカンチレバー応答のFFTを確認します。FFT ウィンドウで、緑色のカーソルを動かして、カンチレバーの共振周波数を読み取ります。

カンチレバーの共振のFFTの典型的な値は約200キロヘルツである。生成された共振周波数値を周波数中心フィールドの一般セクションに入力し、50キロヘルツの周波数ウィンドウを使用します。レーザーパルスチューンウィンドウをクリックして共振強化モードを選択し、222キロヘルツのパルスレート、50キロヘルツのチューニング範囲、レーザーデューティサイクル5%を設定して、レーザーのパルスレートをスイープします。

カーソルを使用して、赤外線を吸収するサンプルの熱膨張の機械的応答の周波数にレーザーパルスを調整します。次に、フェーズロックループを選択して、サンプルとチップの間の接触共鳴を監視し、ゼロをクリックします。ナノスケールでの他の化学特性については、スペクトル取得中に接触共鳴を追跡し、サンプルスペクトルが過熱および軟化の影響を受けないようにします。

[Enable] を選択してサンプルを追跡して接触共鳴を追跡し、積分ゲイン 0.5、比例ゲインを 10 に選択して、[OK] をクリックします。最適化ウィンドウで、波長とスキャンをクリックして、サンプルの主要な吸光度バンドに対応する少なくとも3つの波数、およびレーザーの各チップに少なくとも1つの波数を求めます。ツール、IRバックグラウンドキャリブレーション、新しいをクリックし、波の数を1200〜1800センチメートルに設定します。背景を平均1に、デューティサイクルを5%、掃引速度を100センチメートル平方に設定します。

測定されたナノスケールの局在スペクトルの正規化のためのIRレーザーの背景を測定するために、取得をクリックし、ファイルを保存し、ウィンドウを閉じます。IR スペクトル設定で、1 ~ 4 センチメートルの間の IR スペクトル解像度と、少なくとも 64 回の共平均の数を選択します。次に、獲得をクリックして、タンパク質範囲内のナノスケールの局在IRスペクトルを測定します。

ナノスケール分解された化学地図を取得するには、1655センチメートルとIRイメージングを選択し、AFMスキャンウィンドウでスキャンをクリックします。マッピングが完了したら、測定値を保存します。次に、AFM画像処理ソフトウェアに組み込まれたものを使用して、取得した形態、接触共鳴および化学、およびナノスケールの局在スペクトルを分析します。

凝集した種の存在は、動態の再現性が悪く、測定値にアーティファクトを導入する可能性があるため、非常に純粋な単量体溶液を得ることは重要なステップです。不均質性の高い生体試料の研究に成功するための基本的な要因は、固体基質の位置を正しくすることです。サンプルアーキテクチャと異種性を維持するために、手動の代わりにマイクロ流体噴霧堆積物を利用することができます。

これらの方法は、個々の生体分子の化学構造と特性、および生理学的およびネイティブな液体環境におけるそれらの相互作用を解明するための道を開きます。