Name: 転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング法。GATA2、GFI1B、FOSの強制発現により造血幹細胞前駆細胞を誘導し、造血発生の研究と患者特異的細胞治療への応用を可能にする。

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クヌートとアリス・ワレンバーグ財団、ルンド大学と地域スコーネの医学部は、寛大な財政支援のために認められています。この作品は、オルレ・エングヴィスト・スティフテッレス(194-0694からフィリペ・ペレイラへ)とフンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジア(PTDC/BIM-MED/0075/2014からフィリペ・ペレイラへの博士奨学金)の助成金によって支えられ、 SFRH/BD/135725/2018 および SFRH/BD/51968/2012 からリタ・アウベスそしてアンドレア・ゴメス)。この研究はまた、NIHとNYSTEM(1R01HL119404とC32597GGからカテリA.ムーアへの)からの資金によってサポートされました。

<ol><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+potent+human+hematopoietic+stem+cells+first+emerge+in+the+intraembryonic+aorta-gonad-mesonephros+region%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 2417-2427 (2011).</li>
<li>Tavian, M., Biasch, K., Sinka, L., Vallet, J., Péault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+human+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of human hematopoiesis.</a> International Journal of Developmental Biology. 1065, 1061-1065 (2010).</li>
<li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system%3A+advances+and+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138, 1017-1031 (2011).</li>
<li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+haematopoietic+stem+cell+development%3A+from+the+embryo+to+the+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li>
<li>Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+Hematopoietic+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making a Hematopoietic Stem Cell.</a> Trends in Cell Biology. 26, 202-214 (2016).</li>
<li>Vo, L., Daley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+HSCs+from+somatic+and+pluripotent+stem+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">De novo generation of HSCs from somatic and pluripotent stem cell sources.</a> Blood. 125, 2641-2648 (2015).</li>
<li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121, 770-781 (2013).</li>
<li>Ebina, W., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+toward+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming toward hematopoietic stem cells.</a> EMBO Journal. 34, 694-709 (2015).</li>
<li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+Hemogenic+Program+in+Mouse+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a Hemogenic Program in Mouse Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Reprogramming+In+vitro+Informs+In+Vivo+Identification+of+Hemogenic+Precursors+to+Definitive+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Reprogramming In vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells.</a> Developmental Cell. 36, 525-539 (2016).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Single+Human+Hematopoietic+Stem+Cells+Capable+of+Long-Term+Multilineage+Engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment.</a> Science. 333, 218-221 (2011).</li>
<li>Sinka, L., Biasch, K., Khazaal, I., Péault, B., Tavian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin-converting+enzyme+%28CD143%29+specifies+emerging+lympho-hematopoietic+progenitors+in+the+human+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Angiotensin-converting enzyme (CD143) specifies emerging lympho-hematopoietic progenitors in the human embryo.</a> Blood. 119, 3712-3724 (2012).</li>
<li>Gomes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Transcription+Factor+Induction+Mediates+Hemogenic+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cooperative Transcription Factor Induction Mediates Hemogenic Reprogramming.</a> Cell Reports. 25, 2821-2835 (2018).</li>
<li>Karlsson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+The+Tetraspanin+CD9+Affords+High-Purity+Capture+of+All+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Report The Tetraspanin CD9 Affords High-Purity Capture of All Murine Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Reports. 4, 642-648 (2013).</li>
<li>Leung, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetraspanin+CD9+regulates+migration%2C+adhesion%2C+and+homing+of+human+cord+blood+CD34%2B+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The tetraspanin CD9 regulates migration, adhesion, and homing of human cord blood CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 117, 1840-1851 (2011).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drug-inducible+system+for+direct+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 3, 346-353 (2008).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nature Protocols. 4, 495-505 (2009).</li>
<li>Suzuki, Y. S., Suzuki, Y. Gene Regulatable Lentiviral Vector System. Viral Gene Therapy. Ke, X. , (2011).</li>
<li>Riddell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+committed+murine+blood+cells+to+induced+hematopoietic+stem+cells+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors.</a> Cell. 157, 549-564 (2014).</li>
<li>Lis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+endothelium+to+immunocompetent+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells.</a> Nature. 545, 439-445 (2017).</li>
<li>Pereira, C., Lemischka, I. R., Moore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+blood+to+blood%E2%80%99%3A+de-differentiation+of+hematopoietic+progenitors+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">From blood to blood’: de-differentiation of hematopoietic progenitors to stem cells.</a> EMBO Journal. 33, 1511-1513 (2014).</li>
<li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Signatures+of+Tissue-Specific+Microvascular+Endothelial+Cell+Heterogeneity+in+Organ+Maintenance+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration.</a> Developmental Cell. 26, 204-219 (2013).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Murine+Fibroblasts+to+Hematopoietic+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Murine Fibroblasts to Hematopoietic Progenitor Cells.</a> Cell Reports. 9, 1871(2014).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+mouse+fibroblasts+into+engraftable+myeloerythroid+and+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reprogramming mouse fibroblasts into engraftable myeloerythroid and lymphoid progenitors.</a> Nature Communications. 7, 1-15 (2016).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

本稿では、HP細胞中間体を通過するヒト線維芽細胞から造血前駆細胞を直接生成する方法について、決定的なHSC14と同様に説明する。
GATA2、GFI1BおよびFOSをコードするレンチウイルス粒子のプール生産は、我々の手でより高いリプログラミング効率(未公開データ)をもたらすので、個々の生産よりも好ましい。レンチウイルスは、レトロウイルス科のメンバーとして、通常、正の一本鎖RNA19の2つのコピーを含む。リプログラミング効率の増加は、同じレンチウイルス粒子中の2つの異なるトランスジーンの包装によるものであってもよく、その結果、3つの転写因子と共に転写される細胞の数が増加する。このプロトコルの成功を確実にするためには、ステップ4.6で推奨されるように、リプログラミング効率と細胞生存率の最適なバランスを得るために、細胞通路に応じて十分な量のウイルスを持つHDFをトランスデュースする必要があります。また、新鮮な非濃縮ウイルスを使用することができます。3TF プールと M2rtTA の 0.5 ~ 3 mL のセルを変換することをお勧めします。また、セル密度は、アプリケーションに応じて調整する必要があります。6ウェルプレートあたり150,000 HDF(ステップ4.4)は、再プログラムされた細胞のFACS、移植およびフローサイトメトリー分析を行う最適な密度を提供しました。ChIP-seq実験では、最初からより多くの細胞が必要でした(ステップ5.1)。細胞の形態変化を定期的にチェックし、造血培地を週2回交換して、誘発造血細胞の出現をサポートすることが重要です。フィーダー層に造血サイトカインまたは共培養を添加すると、リプログラミング効率が向上する可能性があります。
この方法により、造血リプログラミング中に動的に表現される新しい造血マーカーを同定することができます。CD9は、転写レベル14で再プログラムされた細胞でアップレギュレートされていることが示されたが、CD49fおよびCD143と共にリプログラミングの初期段階で細胞表面で急速に発現し、ヒトHSC前駆体の新規マーカーとして機能する。また、ITGA6とACEは、CD9とCD34 14に加えて、ヘモジェニックリプログラミングの初期段階におけるGATA2の直接的な標的であり、ヒトヘモジェニック間の直接的な機械的リンクを提供することを示す前駆体表現型およびGATA2.
このシステムの利点の1つは、比較的均質な線維芽細胞培養物の使用に存在する。PSCはインビトロで容易に拡張され維持されるが、分化プロトコルは造血前駆体を含む異種集団を生成し、5、6、7を生着させる。また、PSC由来のHSPCを移植する際に腫瘍形成のリスクがあり、分化プロトコルを採用しても未分化PSCが培養中に残る可能性があるためである。線維芽細胞に代わるものとして、HSCへの直接リプログラミングは、血液中血前駆細胞20および内皮細胞21に適用されている。しかしながら、血液制限前駆細胞から始まり、患者が幹/前駆造血集団22に影響を与える突然変異を運ぶ場合、得られたHSCの治療適用を妨げる。内皮細胞の場合、これらは線維芽細胞に比べて得ることがより困難であり、臓器依存性23である表現型、機能および構造の点で非常に異種細胞集団を構成する。他の研究は、マウス線維芽細胞を生着造血前駆体24、25に再プログラミングすることに成功したが、これまでのところ、ヒト線維芽細胞からのHSPC様細胞の生成を記述する他のプロトコルはない。
このアプローチは、薬理学的阻害、遺伝子ノックアウト、またはノックダウンの許可と相まって、ヒトHSCを直接誘導するために必要な個々または組み合わせを定義することを可能にする。リプログラミングの前にHDFのCRISPR-Cas9技術は、ヒト決定的造電の新しいレギュレータを定義するためのエキサイティングな努力を表しています。将来的には、線維芽細胞のような非血液関連ヒト細胞型のリプログラミングは、臨床応用のための健康な患者に合わせた造血前駆細胞を生成するプラットフォームとして機能する。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.
The second author affiliation was&#160;updated from:
2Wallenberg Center for Molecular, Lund University
to:
2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.

Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

決定的造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)は、大動脈性ゴナド・メソネフロス(AGM)領域および造血能を有する内皮前駆体から胎盤に出現し、内皮から造血性転移(EHT)1を通じて、 2.血原性前駆体(HPs)は内皮マーカーと造血マーカーの両方を発現するが、その正確な同定は、特にヒトシステムにおいては依然として不明瞭である。哺乳類では比較的保存されたプロセスであるにもかかわらず、造血幹細胞(HSC)の発達は依然としてヒトとマウスモデル3、4の間で有意に異なる。したがって、ヒトHSC開発を再現するためのin vitroアプローチが必要である。
HSCに対する多能性幹細胞(PSC)の分化は、有望であるものの、過去20年間で限られた成功を収めており、主に利用可能な分化プロトコルによるもので、原始造着前駆体は生着不良である能力5,6,7.あるいは、直接細胞リプログラミング手法が適用され、転写因子(TF)8、9を用いて複数の細胞型からHSPC様細胞を生成する。特に、3つのTの過剰発現は、Gata2、Gfi1bおよびcFos、定義された表現型(Prom1+Sca-1+CD34+CD45-)10を有するHP中間体を介してHSPCにマウス胚性線維芽細胞を変換した。このプロセスは、決定的造形の指定中に胚および胎盤で発生するEHTに似た。この表現型は、短期培養およびノッチ活性化後に連続移植可能なHSC11を生成したマウス胎盤中のHPの集団の同定および単離を可能にした。
これまでのところ、ヒトHSCと前駆体を区別する表現型は確立されていないが、一部の分子は新興のHSCで発現することが知られている。HSCコンパートメント12内の細胞、およびアンジオテンシン変換酵素(ACEまたはCD143)は、胚性血液形成組織13においてCD34陰性造血前駆体中に存在する。
最近、我々は、3つのTF、GATA2、FOSおよびGFI1Bのヒトバージョンが、短期生着能力14を有するヒト皮膚線維芽細胞(HDF)をハフスに再プログラムすることを実証した。リプログラミングの初期段階では、GATA2はオープンクロマチンに従事し、GFI1BとFOSを募集して線維芽細胞遺伝子を抑制し、内皮および造血遺伝子を活性化します。誘導細胞はCD49fおよびACEを高度に発現し、かつHSPCマーカーCD34を発現する細胞の割合が少ない。HSC15で発現し、HSCホーミング16にとって重要であるCD9遺伝子は、GATA2の直接的な標的であり、再プログラムされた細胞14において最もアップ調節された遺伝子の中でも示された。したがって、CD9は、ヒト決定的造耳のHのための追加マーカーを構成し得る。
このプロトコルでは、GATA2、GFI1BおよびFOSの強制発現を通じたヒト線維芽細胞からのHSPC様細胞の生成と、クロマチン免疫沈降(ChIP)シーケンシング(seq)の開始時の適応方法について説明する。リプログラミング。TFをテトラサイクリン応答要素(TRE)と最小限のCMVプロモーターを含むドキシサイクリン(DOX)誘導性レンチウイルスベクター(pFUW-tetO)でコード化し、逆テトラサイクリンを含む構成ベクターと共に形質転換した。トランスアクティベータータンパク質(pFUW-M2rtTA)。DOX(テトラサイクリンのアナログ)を導入後に添加すると、TF転写を可能にするTRE(Tet-Onシステム)と相互作用するrtTAタンパク質に結合します。この手順が完了するまでに 25 日かかります。ChIP-seq実験では、GATA2(pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2)およびGFI1B(pLV-tetO-HA-GFI1B)のタグ付きバージョンを用いてHDFをトランスジェクションし、さらにpFUW-tetO-FOSおよびTF結合部位をDOX補充の2日後に分析した。
最終的に、ヒト線維芽細胞の血原リプログラミングは、ヒト発達造血の基礎となるメカニズムを研究する体外トラクタブルシステムと、将来の臨床応用のための患者特異的HSPCの潜在的な供給源を提供する。

<table><tbody><tr><td>0.45 μ;m 低タンパク質結合フィルター、150 mL ボトルトップ真空フィルター</td><td>Corning</td><td>#430625</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#M6250</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗ヒト CD34 クローン 581</td><td>BioLegend</td><td>#343518</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9</td><td>BD Biosciences</td><td>#557929</td><td></td></tr><tr><td>BES buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#14280</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#449709</td><td></td></tr><tr><td>遠心フィルターユニット, Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#UFC903096</td><td></td></tr><tr><td>解離液, TrypLE Express Enzyme (1x) no phenol red</td><td>Gibco</td><td>#12604-021</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリンヒクレート (DOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#D9891</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7</td><td>Invitrogen</td><td>#25-0495-82</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>#20342</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from Porcine Skin Type A</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#G1890</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#11140-035</td><td></td></tr><tr><td>造血培地、MyeloCult H5100</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#05150</td><td></td></tr><tr><td>臭化ヘキサジメトリン (ポリブレン)</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#H9268</td><td></td></tr><tr><td>Human Dermal Fibroblasts (HDFs)</td><td>ScienCell</td><td>#2320</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modifiedイーグルス・ミディアム (DMEM)</td><td>GE Healthcare</td> <td>#SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>GE Healthcare</td> <td>#SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillin Streptomycin 100x Solution (Pen/Strep)</td><td>GE Healthcare</td> <td>#SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)</td><td>GE Healthcare</td> <td>#SH30256.01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#7904</td><td></td></tr><tr><td>マウス血清</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#M5905</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a</td><td>BioLegend</td><td>#312105</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2</td><td>Addgene</td><td>#125600</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-FOS</td><td>Addgene</td><td>#125598</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-GATA2</td><td>Addgene</td><td>#125028</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-GFI1B</td><td>Addgene</td><td>#125597</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-HA-GFI1B</td><td>Addgene</td><td>#125599</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr></tbody></table>

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

ヒト造血幹細胞(HSC)の仕様の基礎となる細胞および分子機構は、依然として不可解である。インビトロでヒトHSCの出現を再現するための戦略は、この複雑な発達過程を研究する際の限界を克服するために必要とされる。ここでは、直接細胞リプログラミングアプローチを採用したヒト皮膚線維芽細胞から造血幹および前駆細胞を生成するプロトコルについて説明する。これらの細胞は、HSC仕様の内皮から造血転移(EHT)特性に似た造血中間細胞型を通過する。線維芽細胞は、GATA2、GFI1BおよびFOS転写因子を用いた形質転換を介して血球に再プログラムされた。この3つの因子の組み合わせは、形態学的変化、造血および造血マーカーの発現および動的EHT転写プログラムを誘発した。再プログラムされた細胞は造血前駆虫を生成し、免疫不全マウスを3ヶ月間再び生息させる。このプロトコルは、リプログラミングの初期段階でGATA2ターゲットを定義することにより、ここで例示されるようにヒトEHTプロセスの機械的解剖に向けて適応させることができる。したがって、ヒトヘモジェニックリプログラミングは、ヒトHSC出現の新規マーカーおよびレギュレータを同定するためのシンプルでトラクタブルなアプローチを提供する。将来的には、線維芽細胞における血球形成運命の忠実な誘導は、移植のための患者特異的HSCの生成につながる可能性がある。

HDF を使用したリプログラミングアプローチの概略図を図1Aに示します。線維芽細胞は、商業的なソースから取得されるか、ヒトドナーから収集され、リプログラミングの前にインビトロで拡大されます.めっき後、細胞はGATA2、GFI1BおよびFOS(およびM2rtTA)レンチウイルスで2回形質転換され、再プログラミングの0日目にドキシサイクリンが添加される。2日目には、培養25日目まで造血培地で細胞を分割してめっきする。再プログラムされた細胞は、免疫不全マウスにおける移植、精製細胞集団の単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)(2日目未分類、15日目CD49f+CD34およびCD34および25日目 CD49f+CD34+細胞)、ならびに細胞表面マーカーCD49f、CD34、CD9およびCD143の顕微鏡およびフローサイトメトリー分析。代表的なサイトメトリープロットは、25日間のリプログラミング後にCD49fとCD9の両方を発現する再プログラムされた細胞の約17%を示す(図1B、左パネル)。二重陽性細胞の大部分はCD143(〜86%)を発現し、かつ小集団発現CD34(0.9%)は、動的なヘモジェニック運命誘導を示唆している。これらのマーカーは、25日間培養したM2rtTA形質動HDFでは活性化されません(図1B、右側パネル)。免疫蛍光画像は、接着細胞および丸細胞におけるCD9およびCD143の発現を確認し、これらのマーカーに対して陰性である線維芽細胞と形態学的に異なる(図1C)。ヒトヘモジェニックコロニーはまた、CD49fおよびCD3414を発現する。HDFのScRNA-seq分析は、2日目の未分類細胞、および精製再プログラムされた細胞を15日目(CD49f+CD34-)および25日目(CD49f+ CD34+)で精製し、2日目から25日目までのCD49f、CD9およびCD143発現の段階的な増加を示す。CD49fおよびCD9陽性細胞は、リプログラミングプロセス中に最初に現れ、2日目から15日目の間に、これらの分子が初期ヒトヘモジェネシスのマーカーを表し得る可能性があることを示す。CD143発現は15日目に検出され始め、CD34発現細胞は後の時点(25日目)にのみ検出される。CD34+臍帯血(UCB)細胞を基準として用いた(図1D)。
図2Aは、ヘモジェニックリプログラミングの初期段階でChIP-seq分析のための十分な数の細胞を生成する改変プロトコルを記載している(2日目)。まず、HDFは標準プロトコルの2倍高い密度でめっきされます(300,000セル対プレートあたり150,000セル)。形質導入後、各ウェルを100mm皿に再めっきし、DOXで培地を補充する前に細胞を6日間拡張させる。細胞は、DOXと結果のTF発現を追加した2日後に分析されます。図2Bは、細胞が3つの因子(3TF)またはGATA2と個別に共に形質転換される場合のITGA6およびACEのゲノム調節領域に結合するGATA2のゲノムブラウザプロファイルを示す。GATA2はまた、CD9およびCD34遺伝子14のオープンクロマチン領域に結合する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig1a.jpg"> 図1:ヒト皮膚線維芽細胞における出血性運命の誘導(A)ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)のヘモジェニックリプログラミングのための実験戦略皮膚パンチ生検からの線維芽細胞は、ドナーから収集され、GATA2、GFI1B、FOSおよびM2rtTAレンチウイルスで拡張および形質転換される。ドキシサイクリン(DOX)は、リプログラミングの0日目に培養物に添加され、細胞は25日目までいくつかの時点で分析される。scRNA-seq,単一細胞RNAシーケンシング。FACS、蛍光活性化細胞選別。(B)3つの転写因子(3TF)を有する転移後25日目のフローサイトメトリーによる血原性/造血マーカーの発現を評価するために用いられるゲーティング戦略。サイトメトリープロットは、CD49fおよびCD9の二重陽性細胞のパーセンテージを示し、生細胞集団(DAPI陰性)にゲートする。二重陽性集団内では、CD143およびCD34の発現が示される。同じ培養条件下でM2rtTAウイルスのみを吹き込んだHDFが制御として用いられる。(C)CD9(上部パネル)およびCD143(下部パネル)の発現を確認する25日目の再プログラムコロニーの免疫蛍光画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig1alarge.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2large.jpg" target="_blank"></a>

このプロトコルは、血球性幹および前駆細胞を生成する転写因子GATA2、GFI1BおよびFOSの強制発現によるヒト皮膚線維芽細胞における血球形成プログラムの誘導を示す。

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

この方法は、直接細胞リプログラミングに基づく単純で、難易なインビトロプラットフォームを提供することにより、ヒト造血の研究における限界を克服するのに役立ちます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、レンチウイルス産生、線維芽細胞導入および細胞培養中にヒトヘモジェニック細胞を生成するための基本的なステップにおける理想的なガイダンスを提供する。皮膚線維芽細胞を血原性前駆体に変換することで、幹細胞移植に十分な数の患者特異的造血幹細胞および前駆細胞を生成したいと考えています。100ミリの組織培養でHEK293T細胞を成長させることから始め、摂氏37度で10ミリリットルの完全なDMEMを、合流するまで5%の二酸化炭素を処理した。トランスフェクションの前日に、培地を吸引した後、PBSの5ミリリットルで慎重に皿を洗い、解離液の1.5ミリリットルで細胞を取り外します。摂氏37度で5~10分間インキュベートした後、3ミリリットルの完全DMEMで溶液を不活性化し、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。完全なDMEMの5ミリリットルで皿を洗って、残りの取り付けられた細胞を取り除き、細胞溶液で洗浄を引っ張ります。遠心分離によって細胞を収集し、上清を吸引し、完全なDMEMの6ミリリットルでペレットを再懸濁する。次いで、6つの100ミリメートル組織培養物の間で懸濁液を均等に分割し、1皿当たり完全なDMEMの最終体積10ミリリットルで処理した。翌日、3つの転写プラスミドの総質量を10マイクログラム加え、新しい15ミリリットルの円錐管に加えます。次に、ギャグ、pol、タット、およびrev遺伝子をコードする第2世代のpsPAX2パッケージングベクターの10マイクログラムを追加し、続いて5マイクログラムのpMD2を追加する。管にVSV−G遺伝子をコードするGエンベロープベクター。最後に、水を加える500マイクロリットルに最終容積をもたらします。2つの新しい15ミリリットルの円錐形チューブに、FUW-M2rtTAプラスミドの10マイクログラム、包装ベクターの10マイクログラム、および各チューブにエンベロープベクターの5マイクログラムを追加します。次に、各チューブに500マイクロリットルの最終体積に水を加えます。次に、3本のチューブのそれぞれに62.5マイクロリットルの塩化モルカルシウムを加え、パスツールピペットを装備したピペットコントローラを使用して各混合物に気泡を放出します。気泡が形成されている間に、パスツールピペットに対して滴下してBES緩衝生理食塩水の500マイクロリットルを加え、混合物に加えます。混合物がわずかに曇って見えるまで、少なくとも15分間室温でチューブをインキュベートします。インキュベーション中、HEK293T細胞培養物の上清を抗生物質を使わずに10ミリリットルの完全なDMEMに慎重に交換してください。DNA複合体を個々のHEK293T細胞培養皿に滴下して分配し、24時間インキュベートする。翌日、上清を培養ごとに完全なDMEMの4ミリリットルに置き換え、食器を摂氏37度5%炭酸ガス細胞培養インキュベーターに一晩戻します。翌朝、上清を1皿あたり50ミリリットルチューブに集め、各皿に新鮮な媒体を4ミリリットル加えます。さらに8時間の培養の後、以前に収穫された上清を各皿に盛り付け、新鮮な培地を4ミリリットル加えます。一晩細胞培養インキュベーターに皿を返し、上清を1回最後に集める。すべてのウイルスが収集されたら、0.45マイクロメートルの低タンパク質結合フィルターを介して各レンチウイルス上清を個々のチューブにフィルターし、遠心分離のために個々の遠心フィルターユニットに最大15ミリリットルの濾過上清を加えます。フローを破棄します。液体を含む粘性レンチウイルスは、フィルターユニットに残ります。レンチウイルス上清の全てが、冷蔵用濃縮レンチウイルスのアリコート50〜200マイクロリットルを濾過した場合。リプログラミング手順を開始する前に、1ウェルあたり0.1%ゼラチンの500マイクロリットルで6つのウェル組織培養処理プレートをコード化し、37°Cで20分間プレートをインキュベートします。インキュベーションの終了時に、残りのゼラチン溶液を吸引する。ヒト皮膚線維芽細胞を1.5倍の密度でプレート10~5番目の細胞で、1プレート当たり2ミリリットルの完全なDMEMで十分にプレートし、一晩インキュベートする。翌朝、各井戸の培地を、1ミリリットルポリブレンあたり8マイクログラムで補った完全なDMEMの2ミリリットルに置き換え、新しいマイクロ遠心チューブにプール生産された転写因子レンチウイルスとM2rtTAの混合物を1対1に加える。次いで、レンチウイルス混合物の最適な体積で線維芽細胞を、ウェルあたり10〜100マイクロリットルの間でトランスデュースする。16時間のインキュベーションの後、上清を完全なDMEMに置き換え、細胞を6〜8時間培養インキュベーターに戻します。回復後、ポリブレンを補充した完全なDMEMの2ミリリットルで上清を交換し、ちょうど実証したように2番目の形質転換を行います。2回目のトランスダクションインキュベーションの終わりに、上清を、ドキシサイクリンのミリリットル当たり1マイクログラムで補った完全なDMEMに置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに48時間戻します。インキュベーションの終わりに、1〜2の比率で各ウェルを分割し、新しいゼラチンコーティング6ウェルプレートでドキシサイクリンを添加した造血培地のウェルあたり2ミリリットルの細胞を再プレートします。クロマチン免疫沈降シーケンシング解析に十分な数の細胞を得るために、ゼラチンに10〜5番目の線維芽細胞を3回10回プレートコーティングした6つのウェルプレートを塗布し、一晩インキュベートする。インキュベーションの終了時に、細胞を2日連続で2回、関心のある個々の因子またはFUW-M2rtTAのプールを1対1の割合で含むレンチウイルスの10〜20マイクロリットルでトランスデュースする。2回目の導入から16時間後、上清を含むウイルスを除去し、24時間完全なDMEMで細胞をインキュベートする。インキュベーションの終わりに、各ウェルの内容物を個々のゼラチンに再プレートし、完全なDMEMで100ミリメートルの組織培養処理された料理を1皿あたり10ミリリットルの培地の最終体積にして、細胞培養器に細胞を戻す。6日後、上清をドキシサイクリンを補充した完全なDMEMに置き換えます。培養物をさらに2日間培養器に戻します。これらの代表的なサイトメトリープロットが示すように、再プログラムされた細胞の約17%は、25日間のリプログラミングの後にCD49fとCD9の両方を発現する。二重陽性細胞の大部分はCD143を発現し、小集団はCD34を発現し、動的な血原性運命誘導を示唆している。これらのマーカーは、25日間培養されたヒト皮膚線維芽細胞をM2rtTAで活性化しない。免疫蛍光イメージングは、これらのマーカーに対して陰性である線維芽細胞と形態的に区別される接着細胞および丸型細胞におけるCD9およびCD143の発現を確認する。ブライトフェイルイメージングは、リプログラミングプロセス全体で細胞の合流、形態、コロニー形成を可視化するために行われます。再プログラムされた細胞の単一細胞RNAシーケンシング分析は、CD49f、CD9、およびCD143発現の2日目から25日目までの段階的な増加を明らかにする。クロマチン免疫沈降シーケンシング後、ゲノムブラウザプロファイルは、線維芽細胞が3つの因子またはGATA2と個別にコトランスタイズされたときに、ITGA6およびACEのゲノム調節領域にGATA2結合を示す。培養に添加される抗ウイルス粒子の量は、細胞の生存率を損なうことなく、リプログラミングを成功させるために最適化されるべきである。このプラットフォームは、CRISPR-Cas9などの薬理学的阻害およびゲノムスケールスクリーニング技術と組み合わせて、ヒト決定的造成の新しい調節因子を定義することができます。この直接リプログラミングアプローチにより、研究者はヒト発達造血の分野における新たな疑問を探求し、ヒト造血幹細胞の仕様の基礎となるメカニズムを解読することができます。レンチウイルス作業専用の層流フードで抗ウイルス収集とトランスダクションを行い、ウイルス汚染廃棄物を適切な容器に廃棄することが重要です。

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