Name: 正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶグルタミン酸の単一シナプス動態評価法。iGlu u蛍光センサーと二光子顕微鏡を用いて、正常マウスとハンチントン病マウスの皮質線状体シナプスにおけるグルタミン酸放出と取り込みのバランスを解析し、神経変性疾患のシナプス機能障害を評価する。

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この研究は、CHDI(A-12467)、ドイツ研究財団(Exc 257/1およびDFGプロジェクトID 327654276 - SFB 1315)、シャリテの壁内研究基金によって支援されました。K.テレク、セントジョージズ、ロンドン大学、N.ヘラッサ(リバプール大学)に感謝します。uD.ベタンスとA.シェーンヘルは優れた技術支援を提供しました。

著者らは開示するものは何もない。

実験は、シナプス依存性と神経変性の過程におけるシナプスの損失の可能性という一般的な関心の問題に関するものであり、我々は、老化した(>1年)マウスからの急性脳切片の影響を受けたシナプスを同定するための新しいアプローチを記述する。最近導入されたグルタミン酸センサiGluuの改善された運動特性を利用して、シナプスグルタミン酸放出と取り込みとの関係を以前は不可能であった方法で照らす。
グル,タミン酸クリアランスがシナプスの機能と維持に及ぼす影響はあまりよく解明されていないが、グルタミン酸誘発性興奮毒性がニューロンの喪失およびシナプス剪定を引き起こす可能性があるという仮説は、てんかん、脳卒中および神経変性疾患38、39、40、41に関するほぼすべての関連レビューで38,39言及されている。40,41しかし、利用可能な...

「単一接続」に属する各シナプス末端の相対的な影響(すなわち、2つの神経細胞間の接続)は、典型的には、心内ナプティックニューロン11,22の初期セグメントに対するその影響によって評価される。ポストナプティクスニューロンからの体細胞および/または樹状記録は、最も一般的であり、これまで、トップダウンまたは垂直の視点33、4、54,5の下で情報処理を明確にする最も生産的な手段でもあります。しかし、それらの離散領域と(げっ歯類)非重なり合う領域を持つアストロサイトの存在,は、シナプス部位6、7、8、9、107における信号交換、統合9,10および同期6の局所メカニズムに基づく水平視点を寄与し得る。8
アストログリアが遊ぶことが知られているので、一般的に、神経変性疾患11、12,12および、特に、グルタマテル作動性シナプス13、14、15、1614,の維持および可塑性における役割13は、シナプス性の変化が多様な対象の線維の中でアストロシンの状態に応じて進化することが考えられる。15,16さらに、健康と病気における標的/アストログリア由来の局所調節機構を調べるには、個々のシナプスを評価する必要があります。本手法は、機能性グルタミン酸放出およびクリアランス指標の範囲を推定し、運動開始に最も密接に関連する脳領域における機能不全(または回収)シナプスを同定するために使用できる基準を定義するために働いた(すなわち、まず運動皮質および側側線条体の中で)。
線条体は、固有のグルタミン酸細胞系ニューロンを欠いている。したがって、他の起源のグルタマテルゲン酸凝集剤を比較的容易に同定することが容易である。後者は主に内側視床と大脳皮質に由来する(詳細については17、18、19、2018,19,20参照)。17コルチコストリアスシナプスは、皮質層2/3および5に局在する錐体ニューロンの軸索によって形成される。それぞれの軸索は、錐体管(PT)をより大きく構成する繊維系を介して、両側のテレンスファリック内(IT)接続またはipsilater接続を形成する。さらに、IT型およびPT型端末は、リリース特性とサイズ21、22,22が異なることを示唆している。これらのデータを考慮すると、グルタミン酸の取り扱いに若干の違いがあると考えることもできます。
線条体はハンチントン病(HD)5で最も影響を受けた脳5領域である。ヒトHDは、重度の遺伝的に遺伝する神経変性疾患である。Q175マウスモデルは、パーキンソニズムと多くの共通点を持つHDの低運動リジッド形態の細胞基盤を調査する機会を提供する。約1年齢から、ホモザイゴテQ175マウス(HOM)は、低血圧の徴候を示し、開場23で動かずに過ごした時間を測定することによって明らかになる。本実験では、ヘテロジゴテQ175マウス(HET)は、HOMで観察された以前の運動障害を確認し、さらに、観察された運動障害は、皮質化基底シナプス末端部24の近傍における占星興奮性アミノ酸トランスポーター2タンパク質(EAAT2)の減少レベルを伴っていることを示した。したがって、占星グルタミン酸の取り込みの赤字は、機能不全またはそれぞれのシナプス25、26,26の損失につながる可能性があると仮定されています。
ここでは、放出された神経伝達物質の量に対して単一シナプスグルタミン酸クリアランスを評価することを可能にする新しいアプローチを説明する。新しいグルタミン酸センサー iGluuは、コルチコストリアタール錐体のニューロンで発現した。それはカタリン・トレック27によって開発され、以前に導入された高親和性が遅いグルタミン酸センサーiGluSnFR28の修飾を表す。両方のセンサーは、強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の誘導体です。スペクトル特性および運動特性については、Helassaら27を参照してください。簡単に言えば、iGluuは急速な脱活性化動態を備えた低親和性センサーであり、したがってグルタミン酸放出シナプス末端におけるグルタミン酸クリアランスを研究するのに特に適している。iGluuの解離時定数は停止流れ装置で決定され、タウオフ値は20°Cで2.1ms、34°C27の温度に外挿すると0.68msとなった。272光子顕微鏡下でのORGAnotypichippoカンピカル培養のCA1領域におけるスパイラルレーザースキャンを用いて34°Cで探査された単一のシャファー担保端子は、2.7msの平均時反減衰を示した。

<table><tbody><tr><td>ステレオマイクロソープ</td><td>WPI</td><td>PZMIII</td><td>精密ステレオズーム双眼顕微鏡</td></tr><tr><td>立体視鏡</td>フレーム <td>Stoelting</td><td>51500D</td><td>デジタルラボ 新標準 定位固定装置</td></tr>フレーム <tr><td>高速ドリル装置</td><td>Stoelting</td><td>514439V</td><td>Foredom K1070 クロモターキット</td></tr><tr><td>インジェクションシステム</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>五等式脳定位固定装置インジェクター (QSI)</td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ5&マイクロ;l</td><td>ハミルトン</td><td>87930</td><td>75RN Syr (26s/51/2)</td></tr><tr><td>レーザー位置決めシステム</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA-40</td><td>UGA-40</td></tr><tr><td>iGluu 励起用青色レーザー</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-473-020-S</td><td>473 nm レーザー</td></tr><tr><td>ダイクロイック ミラー 473 nm</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>ROE TB-355-405-473</td><td>ダイクロイック</td></tr><tr><td>1P 直立顕微鏡</td><td>カール・ツァイス</td><td>000000-1066-600</td><td>Axioskop 2 FS Plus</td></tr><tr><td>対物レンズ 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td>421480-9900</td><td>W Plan-Apochromat</td></tr><tr><td>4x 対物レンズ</td><td>Carl Zeiss</td><td>44-00-20</td><td>Achroplan 4x/0,10</td></tr><tr><td>iGluu</td><td>Omega 光学</td><td>XF2030</td><td></td></tr><tr><td>用ダイ</td><td></td>クロイックミラー <td>XF3086</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>Omega 光学</td><td></td><td></td>QMAX_DI580LP</tr><tr><td>自家蛍光微量用蛍光フィルター</td><td>オメガオプティカル</td><td>QMAX EM600-650</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS カメラ</td><td>Andor</td><td>ZYLA4.2PCL10</td><td>ZYLA 4.2MP Plus</td></tr><tr><td>Acquisition ソフトウェア</td><td>Andor</td><td>4.30.30034.0</td><td>Solis</td></tr><tr><td>AD/DA コンバータ</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895035</td><td>InstruTECH LIH8+8</td></tr><tr><td>取得ソフトウェア</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895153</td><td>TIDA5.25</td></tr><tr><td>電極位置決めシステム</td><td>サッターインスツルメント</td><td>MPC-200</td><td>マイクロマニピュレーター</td></tr><tr><td>電気刺激装置</td><td>シャリテ工房</td><td>STIM-26</td><td></td></tr><tr><td>スライカ</td><td></td><td>VT1200 S</td><td>バイブロトーム</td></tr><tr><td>ブラウン/フレーミングタイププーラー</td><td>サッター</td><td>Instr SU-P1000</td><td>P-1000</td></tr><tr><td>インジェクションピペット用ガラス管</td><td>WPI</td><td>1B100F3</td><td></td></tr><tr><td>刺激用ガラス管ピペット</td><td>WPI</td><td>R100-F3</td><td></td></tr><tr><td>テトロドトキシン</td><td>Abcam</td><td>ab120054</td><td>TTX</td></tr><tr><td>iGluu プラスミド</td><td>Addgene</td><td>106122</td><td>pCI-syn-iGluu</td></tr><tr><td>Q175 マウス</td><td>Jackson Lab</td><td>27410</td><td>Z-Q175-KI</td></tr></tbody></table>

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

シナプスは、互いに独立して動作する高度に区画化された機能ユニットです。ハンチントン病(HD)および他の神経変性疾患では、グルタミン酸クリアランスの不十分さと結果として生じる流出および流出効果のために、この独立性が損なわれる可能性がある。シナプス前の末端および/または樹状脊椎の変わった占星術のカバレッジ、ならびにグルタミン酸放出部位におけるグルタミン酸輸送体の減少サイズは、疾患の病因に関与しており、その結果、異症/高キネジーの症状が生じる。しかし、HDにおけるグルタミン酸シナプスの機能障害につながるメカニズムはよく理解されていない。シナプスイメージングの改善と応用により、動きの開始を妨げるメカニズムに新たな光を当てるデータを得ました。ここでは、新しい遺伝子でコード化された超高速グルタミン酸センサーiGluu、広視野光学、科学CMOS(sCMOS)カメラ、473 nmレーザー、およびレーザー測位システムを使用して、適切な健康または病気の疾患の年齢から急性の皮質コストリアタールシナプスの状態を評価することによって、単一シナプス分解能を達成するための比較的安価なアプローチの原理要素を説明する。グルタミン酸過渡は、単一または複数のピクセルから構築され、i)グルタミン酸濃度の最大上昇に基づいてi)グルタミン酸放出が活性領域とiiの隣にあるグルタミン酸濃度[Glu]の時間定数(TauD)に反映されるように構築された[Glu]。短期可塑性の安静ブブトンサイズと対照パターンの違いは、子宮内脳症(IT)または錐管(PT)経路に属するコルチコストリアタール末端の同定の基準として役立った。これらの方法を用いて、症状のあるHDマウスではPT型コルチコストリアタールシナプスの40%がグルタミン酸クリアランスが不十分であることを発見し、これらのシナプスが興奮性損傷の危険にさらされる可能性があることを示唆した。この結果は、虚血性表現型を有するハンチントンマウスにおける機能不全シナプスのバイオマーカーとしてのTauDの有用性を強調した。

2種類のコルチコストリアタール酸筋性静脈瘤の同定 IT および PT の afferent は、それぞれレイヤ 2/3 と 5 に由来し、イプシラショナルおよび逆側 (IT 端末のみ) 線条体に差異的な影響と終了パターンを示します。運動の開始の間に観察される反復的な活性化条件下でのグルタミン酸放出およびクリアランスの特性についてはまだほとんど知られていないが、それぞれのグルタミン酸放出静脈瘤がサイズ22において異なることは十分に文書化されている。サイズ基準を適用すると、IT端末とPT端末が短期可塑性24の対照的な形態を示すことが分かった。50ミリ秒の刺激間隔で、より小さいIT端末は対パルスうつ病(PPD)を起こしやすいが、より大きなPT端末は対パルス促進を示した。この差は、より短い間隔(20ms)および一連の6パルスにわたっても観察された。図3および図6は、生理学的Ca2+/...

我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ iGluu、信号取得用のsCMOSカメラ、焦点レーザー照明装置を使用します。

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

高速グルタミン酸センサーを発現する単一シナプスの高解像度イメージングにより、送信機の放出と取り込みの局所的な不一致を検出できます。疾患の場合、この方法は、機能不全シナプスを同定するために使用することができる。自己蛍光補正のために、まず、目的のマウスから脳スライスを1光子顕微鏡の記録室に入れる。スライスを酸素化された人工脳脊髄液に浸漬し、20倍の水浸漬目的を使用して、後部線条体を見つけます。ティッシュの動きを最小にするためにプラチナハープのナイロングリッドでスライスを固定し、63x水浸しの目的に切り替えます。510ナノメートルのハイパスフィルターを使用して、自己蛍光センサとグルタミン酸センサの正の構造の画像を一緒に取得します。600ナノメートルのハイパスフィルターを用いて、自発蛍光構造の第2像を単独で取得する。範囲を定義するには、最も明るい 10 個のピクセルと最も暗いピクセルの平均強度を使用して、赤と黄色の画像をスケールします。次に、黄色のマイナス赤の画像を減算し、減算された画像を再スケールして標準の 8 ビット TIFF ファイルを生成し、対象の吹き出物を簡単に視覚化します。応答性の高いブトンの探索を行うには、電気刺激に適したガラスマイクロピペットが必要です。マイクロピペットプーラーを使用して、約1マイクロメートルの内部先端径のホウケイ酸ガラス毛細血管から刺激ピペットを生成します。候補のブトンからのグルタミン酸の作用電位依存放出を探るために、63倍の倍率および510ナノメートルの放出フィルタを選択する。減算された画像をロードして、蛍光変動の隣にガラス刺激電極を配置し、追加の軸索の近接を避けます。スライスのより深い部分内の最大分岐または割り当てに関連する変動性。刺激電極を目的のブットンの近くに置き、完全な暗闇の中で録音を行わなければならないので、光を消します。次いで、マルチチャネルバスアプリケーションシステムをオンにし、一方のチャネルが標準的なバス溶液を供給し、他のチャネルがイオンチャネル、トランスポーター、または膜受容体の必要なブロッカーを送達し、テトロトキシンを含む作用電位生成を阻止する。記録部位の流れを制御し、刺激ピペットに2〜10マイクロアンペアの脱分極電流パルスを供給するために刺激器をオンにします。このリリースは、電圧ゲートチャネルを介した直接のカルシウム流入によって活性化されるようになりました。クリアランス中のグルタミン酸放出を可視化するには、顕微鏡X、Yドライブを用いて、試験したグルタミン酸センサ陽性のバウトンを視野中央近くに配置する。取得を停止した後、マウスの左ボタンで画像をクリックして、静止した吹き出物の中心のX、Y位置を決定します。セットカーソルのX,Y座標が表示されます。キャリブレーションデータを用いて、示された式を使用して、グルタメー

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神経科学

隔離された海馬から急性脳スライスだけでなく、アストロサイトとニューロンの同時電気生理学的記録の準備...

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

このビデオは、マウスの脳スライスの単一の皮質線条体シナプスにおけるグルタミン酸の放出とクリアランスの評価を示しています。電気刺激は、シナプスでのグルタミン酸の放出を促進します。放出されたグルタミン酸は、センサータンパク質の蛍光を変化させ、時間の経過とともに崩壊し、放出効率とクリアランス効率を示します。...

マウス脳スライスにおける単一ニューロンシナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスの解析

出典:McLeod, F., et al.海馬のげっ歯類の脳スライスにおけるシナプス密度の評価。J. Vis. Exp.

免疫蛍光法を用いたマウス海馬切片のシナプスの顕微鏡解析

我々は、興奮毒性媒介性脳損傷に関与する分子メカニズムを調べるために使用できる脳切片モデルを開発した。この技術は、生存可能な成熟した脳組織を生成し、部分的に無傷の神経回路、細胞間相互作用、およびシナプス後区画を維持しながら、実験に必要な動物の数を減少させる。...

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

私たちは、全細胞パッチクランプおよびマウス脳の急性組織切片における樹状突起および海馬ニューロンのスパインにおける細胞内ナトリウム過渡の多光子イメージングによる神経活性化合物の焦点UV誘導光活性化の組合せを記載。...

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

ここでは、トニックおよび酵素結合微小電極アレイ（MEA）を使用して、in vivoで相性の細胞外グルタミン酸変化を測定の空間的及び時間的に正確な方法のセットアップ、ソフトウェアナビゲーション、およびデータ分析を記載しています。...

アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。...

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

これは、経心面灌流と氷冷NMDG-aCSFによるスライス切断を利用して組織への低酸素損傷を軽減する、成体および老化マウス海馬からの急性スライス調製のためのプロトコルである。結果のスライスは、長時間にわたって健康を維持し、長期的なパッチクランプやフィールド記録に適しています。...

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。...

マウス脳の水平海馬スライス

急性脳スライスを用いた内因性モノアミン放出の検出に関する簡単な手法を紹介する。セットアップはモノアミン放出のためのティッシュホールダーを含んでいる48ウェル版を使用する。放出されたモノアミンは、HPLCによって電気化学的検出と結合して分析される。さらに、この技術は、創薬のためのスクリーニング方法を提供する。...

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

学ぶグルタミン酸の単一シナプス動態評価法。iGlu u蛍光センサーと二光子顕微鏡を用いて、正常マウスとハンチントン病マウスの皮質線状体シナプスにおけるグルタミン酸放出と取り込みのバランスを解析し、神経変性疾患のシナプス機能障害を評価する。

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

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