正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

高速グルタミン酸センサーを発現する単一シナプスの高解像度イメージングにより、送信機の放出と取り込みの局所的な不一致を検出できます。疾患の場合、この方法は、機能不全シナプスを同定するために使用することができる。自己蛍光補正のために、まず、目的のマウスから脳スライスを1光子顕微鏡の記録室に入れる。

スライスを酸素化された人工脳脊髄液に浸漬し、20倍の水浸漬目的を使用して、後部線条体を見つけます。ティッシュの動きを最小にするためにプラチナハープのナイロングリッドでスライスを固定し、63x水浸しの目的に切り替えます。510ナノメートルのハイパスフィルターを使用して、自己蛍光センサとグルタミン酸センサの正の構造の画像を一緒に取得します。

600ナノメートルのハイパスフィルターを用いて、自発蛍光構造の第2像を単独で取得する。範囲を定義するには、最も明るい 10 個のピクセルと最も暗いピクセルの平均強度を使用して、赤と黄色の画像をスケールします。次に、黄色のマイナス赤の画像を減算し、減算された画像を再スケールして標準の 8 ビット TIFF ファイルを生成し、対象の吹き出物を簡単に視覚化します。

応答性の高いブトンの探索を行うには、電気刺激に適したガラスマイクロピペットが必要です。マイクロピペットプーラーを使用して、約1マイクロメートルの内部先端径のホウケイ酸ガラス毛細血管から刺激ピペットを生成します。候補のブトンからのグルタミン酸の作用電位依存放出を探るために、63倍の倍率および510ナノメートルの放出フィルタを選択する。

減算された画像をロードして、蛍光変動の隣にガラス刺激電極を配置し、追加の軸索の近接を避けます。スライスのより深い部分内の最大分岐または割り当てに関連する変動性。刺激電極を目的のブットンの近くに置き、完全な暗闇の中で録音を行わなければならないので、光を消します。

次いで、マルチチャネルバスアプリケーションシステムをオンにし、一方のチャネルが標準的なバス溶液を供給し、他のチャネルがイオンチャネル、トランスポーター、または膜受容体の必要なブロッカーを送達し、テトロトキシンを含む作用電位生成を阻止する。記録部位の流れを制御し、刺激ピペットに2〜10マイクロアンペアの脱分極電流パルスを供給するために刺激器をオンにします。このリリースは、電圧ゲートチャネルを介した直接のカルシウム流入によって活性化されるようになりました。

クリアランス中のグルタミン酸放出を可視化するには、顕微鏡X、Yドライブを用いて、試験したグルタミン酸センサ陽性のバウトンを視野中央近くに配置する。取得を停止した後、マウスの左ボタンで画像をクリックして、静止した吹き出物の中心のX、Y位置を決定します。セットカーソルのX,Y座標が表示されます。

キャリブレーションデータを用いて、示された式を使用して、グルタメートセンサーの蛍光を励起するためにレーザー光を送るべき部位の座標を計算する。レーザー制御ソフトウェアで1点シーケンスを作成するには、レーザー制御ソフトウェアのシーケンスページの「シーケンスに追加」ボックスで点を選択し、実行と実行遅延をゼロに設定し、TLLで実行するシーケンスを設定します。次に、[シーケンスの開始] をクリックします。

カメラコントロールソフトウェアで、適切なイメージングパラメータを選択し、トリガモードの外部開始を選択します。カメラコントロールソフトウェアで[信号を取る]をクリックします。次に、トリガデバイス用に敷設された実験プロトコルを開始し、適切なタイムラインで実験プロトコル試験を実施し、カメラが1回の試行中に2.48キロヘルツ周波数の400フレームを取得し、0.1ヘルツ以下の繰り返し周波数を持つ。

病理学的シナプスを識別するには、上昇ルーチンをオンにし、静置中の関心のある選択領域の蛍光強度、平均および標準偏差を計算します。平均と3標準偏差を超える平均時の蛍光強度を持つピクセルで占める面積を決定し、ボックス化し、超閾値領域の円形の形状を仮定してミクロン単位で仮想直径を決定します。時間に対する蛍光強度をプロットし、実際の蛍光強度値と安静時蛍光強度値との差を、安静時の蛍光強度値で割った値としてプロットする。

蛍光応答のピーク振幅を決定します。蛍光応答のピークからの減衰に対して単一指数フィッティングを行い、減衰の時定数であるTauDを決定します。特定のシナプスでの最大振幅を推定するには、シナプスのクリアランス機械に提示されるグルタミン酸負荷の最良の指標である蛍光強度の変化が最も高いピクセルを選択します。

シングルシナプスイメージングを使用して、サイズと対パルス比基準を使用して、コルチコストリアタールシナプスの2つのクラスを同定することができます。刺激間隔は20~50ミリ秒で、より小さい腸間腸間ヘーザル酸末端は対パルス抑うつを起こしやすく、より大きな錐体管末端は対パルスファシリテーションを示した。ハンチントン表現型を発現する野生型マウスとマウスに対して行われた運動行動に関する試験は、オープンフィールドでの全経路走行の結果と、遅延を超えるステップとの間に有意な陽性のクー関係を明らかにする。

また、単一シナプスグルタミン酸イメージングは、単一シナプス刺激に対するグルタミン酸応答のTauD値に反映される並立性ハンチントンマウスが、並立性グルタミン酸崩壊の速度に欠損を示したことを示す。野生型動物では、このような延長はグルタミン酸摂取の選択的で非輸送性阻害剤の適用後にのみ観察された。野生型マウスのスライスにおける所与のタウD値の発生確率の評価と、ハンチントン病の症状を発現するマウスは、野生型動物では、TauDが15ミリ秒を超えないことを明らかにした。

しかし、症候性ハンチントン病では、シナプスの40%は、放出されたグルタミン酸量の減少傾向にもかかわらず、16〜58ミリ秒の間にTauD値を示す。したがって、TauDはハンチントン病における機能不全シナプスのバイオマーカーとみなされ、さらに、天体グルタミン酸輸送を標的とする実験で機能的回復を検証するために使用され得る。個々のコルチコストリアスシナプスにおけるグルタミン酸モニタリングのためのこのプロトコルは、神経変性疾患の病因におけるグルタミン酸摂取欠乏症の役割を明確にするのに役立つかもしれない。

単一シナプスイメージングは、興奮性シナプスのシナプティック前の部位を探索するのに特に有用である。