Name: パラフィン埋め込み組織におけるヒトおよびマウス好中球外細胞トラップの免疫蛍光標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶ パラフィン埋め込み組織における好中球外細胞トラップ（NETs）の免疫蛍光標識法。70度の熱誘導抗原回収と抗体染色により、ヒトおよびマウス組織でNET成分を検出する標準化された手法を解説します。

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組織プロトコルは、ランデサムト・フュル・ゲスンハイト・ウンド・ソジアレス、ベルリン、ドイツ(G0121/16)によって承認されました。実験は、動物のケア、福祉および治療に関する欧州指令2010/63/EUに従って行われました。
1.固定、脱水、パラフィン埋め込み、断面、断面の取り付け
<ol><li>TBS(pH 7.4)でパラホルムアルデヒドを溶解して2%ホルムアルデヒド溶液を調作する。60°C以上の加熱は避けてください。RTに冷却し、ホルムアルデヒド溶液は-20°Cで保存することができる。</li>
	<li>新鮮なティッシュ(ここでは、マウス肺)をTBSとガラスペトリ皿に入れます。メスで、20mm x 30 mm x 3mmの大きさを超えない部分に解剖します。TBSで2%ホルムアルデヒド溶液に試料を浸漬します。 注:固定の体積は、組織の少なくとも20倍でなければなりません。</li>
	<li>8−20hのRTで固定し、試料をTBSに移します。</li>
	<li>一連のエタノール(70%、80%、90%、96%、100%、100%)を使用して脱水し、各工程は1時間持続する。</li>
	<li>100%キシレン(ジメチルベンゼン)で2xの検体をクリアし、各工程1h。</li>
	<li>パラフィン2xを60°C(溶融温度54−56°C)、各工程1hに浸す。</li>
	<li>埋め込み金型を使用して試料を取り付け、カバーとしてカセット底部を使用します。</li>
	<li>パラフィンを固化させ、埋め込み金型を除去します。</li>
	<li>3 μmの組織切片を準備し、37°Cの水浴に浮かべましょう。</li>
	<li>水面上の浮遊部を接着ガラススライド(材料の表)に浮かべる。</li>
	<li>40°Cで一晩ガラススライド上のセクションをインキュベートし、組織をガラスに結合させます。</li>
</ol>2.水分補給、熱誘発エピトープ検索、染色、取り付け、顕微鏡分析
<ol><li>ラック内のガラススライドにセクションを配置し、脱水とクリアに使用されるメディアに逆順に、5分間の各ステップ:2x 100%キシレン、エタノールシリーズ(2x 100%、96%、90%、80%、70%)。</li>
	<li>温度管理されたホットプレートで水浴を70°Cに加熱します。熱誘発エピトープ検索(HIER)-バッファー(pH 9;)で満たされた瓶を置きます。材料の表)は、温度バッファーとして10%のグリセロールを含有し、水浴に。HIER バッファが 70 °C に達したら、スライド付きのラックをバッファ ジャーに入れます。</li>
	<li>70°Cで120分間スライドをインキュベートします。</li>
	<li>水風呂から瓶を取り出し、脱イオン水で3倍、TBS(pH 7.4)で一度冷やします。</li>
	<li>ロールフィルターペーパーまたは綿棒で断面間のスライドから液体を慎重に取り除き、セクションを水和したままにします。</li>
	<li>疎水性バリアペンでセクションの周りにバリアを作成します。</li>
	<li>ブロッキングバッファー(1%ウシ血清アルブミン[BSA]、2%正常ロバ血清、5%冷水魚ゼラチンおよび洗剤[TBS]のセクションをRTで30分間、非特異的結合を防ぐ。</li>
	<li>ブロッキングバッファー内の1 μg/mLの濃度で一次抗体を希釈する。 注:ヒトおよびマウスのNETの場合、好中球エラスターゼに対するウサギ抗体とヒストン2Bに対する鶏抗体の組み合わせを使用することができる(材料の表)。</li>
	<li>スライドを湿った部屋に入れておきます。ブロッキングバッファーを除去し、乾燥を防ぐのに十分な体積を使用してセクションに洗浄することなく希釈した一次抗体を追加します。パラフィンフィルムで湿った部屋をシールし、RTで一晩インキュベートします。</li>
	<li>TBSでセクション3xを5分間洗います。</li>
	<li>ブロッキングバッファー内の二次抗体の作業溶液を調剤する。一次抗体の検出のために、ロバで発生し、複数の種からの血清タンパク質に対して事前に吸収された二次抗体を使用する(材料の表)。二次抗体の働く溶液で組織セクションをカバーします。湿った部屋にスライドを移し、パラフィンフィルムでシールする。RTで1時間インキュベートします。 注:Cy2に結合したロバアンチウサギとCy3に結合したロバアンチチキンは、DNAカウンターステインと組み合わせることができます。</li>
	<li>セクションをTBSでそれぞれ5分間3分洗い、その後1回5分間、脱イオン水で洗います。</li>
	<li>取り付け媒体(材料のテーブル)が付いているカバーセクションおよび泡の形成を避けるカバーガラスを適用する。</li>
	<li>取り付け媒体を固化させ、適切なバンドパスフィルタまたは共焦点顕微鏡で広視野顕微鏡を使用して免疫蛍光を分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin%2C+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639(2009).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+smears+observed+in+H%26E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BioMed Central Cell Biology. 9, 13(2008).</li>
<li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking%2C+immunoreactivity%2C+and+heat+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+unmasking+on+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.</a> Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).</li>
<li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval%3A+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li>
<li>Weckbach, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midkine+drives+cardiac+inflammation+by+promoting+neutrophil+trafficking+and+NETosis+in+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).</li>
</ol>

この作品の資金源はマックス・プランク・ソサエティです。私たちは、マウス組織の原稿とフィリップ・サイカリを批判的に読んでくれたアルトゥーロ・ジクリンスキーに感謝します。

病因9の間にNETsの役割に対する意識が高まるにつれて、患者または実験動物からの組織における検出の重要性が高まっている。パラフィン埋め込み組織サンプルは、他の組織製剤(例えば、凍結保存標本のセクション)と比較して多くの利点を有する。パラフィン埋め込みサンプル中の組織保存は明らかに優れ、一度埋め込まれると、サンプルは何十年も保存され、逆行研究が可能になります。繊細構造であるNETの検出のために、良好なサンプル保存は、凍結保存材料の使用を除外する前提条件であり、氷結晶形成による組織損傷を引き起こしやすい形態的に類似した人工物を生じやすい。ネット。
最適な保存のために、実験動物からの組織は、自己リシスを避けるために、理想的には灌流によって、死後まもなく固定されるべきである。固定剤として、最適なTBSまたはPBS鉱石のような適切なバッファーでパラホルムアルデヒドの新鮮な、または新たに解凍された溶液。これは、標準的な組織学に使用されるホルマリン製剤とは対照的に化学的に定義され、より少ない組織自己蛍光を誘導する。対照的に、ヒト組織は切除後に直接固定されることが多く、固定剤として、通常、重合を防ぐための安定剤としてメタノールの10%~15%を含むホルマリンの10%希釈が利用され、ギ酸、他のアルデヒド、ケトンが挙げられる。.多くの場合、組織は埋め込む前に長時間この固定剤に保存されます。結果は、自己解起(切除と固定の間の時間に応じて)、およびオーバーフィックスによるメチレンブリッジの過剰な形成することができます。ホルムアルデヒド固定は、内および分子間メチレンブリッジ10の形成によってタンパク質の三次構造の変化を誘発する。核酸、炭水化物、脂質などの非タンパク質細胞成分は、直接固定されるのではなく、三次元タンパク質ネットワークに固定化されます。ラベリングを成功させるためには、抗原検索の過程でエピトープを露出させるためにメチレン結合を分解する必要があります。これは、適切な熱誘発抗原検索バッファー(HIERバッファー)11内の顕微鏡スライドに取り付けられた組織セクションの加熱によって達成される。我々の前回の研究では、パラフィン化組織におけるNET成分の検出に対するHIERバッファーのpHおよび温度の影響を分析し、1つの成分に対する組織前処理の成功は、しばしば第2の成分8に対して最適ではないことが判明した。
一方、9のpHでHIERバッファーで組織を70°Cに加熱することは、多くのNET成分にとって良好な妥協であり、より高い温度でしばしば損なわれる良好な組織保存を保持することが分かっています。出発点として示された検索時間を使用することが提案されていますが、特に未知の固定パラメータのアーカイブ標本では、染色強度が不十分な場合があります。この場合、検索手順中の温度の延長またはより高い温度は、染色効率を向上させることができる。これはまた、我々のプロトコルで使用されるIgY抗体のヒストン2B染色に影響を与えることができる。図1に示すように、凝縮されたクロマチンは、NETosisを受けている好中球およびNETsの染色において、休息中の好中球のクロマチンと比較して、この抗体ではるかに強い染色を見つけることができます。これはおそらく、コンパクトな核への180 kDa IgY分子のアクセスが制限されているため、エピトープ回収の増加後に異なる可能性があります。これは凝縮クロマチンの領域でも結合効率を強める可能性があり、好中球および他の細胞の正常な核においてより強い蛍光をもたらす。NETosisを受けている好中球と非刺激性好中球の間の染色効率の違いは、図1に示されているよりも顕著でなく、顕著である可能性がある。NET形成の領域は、NE、H2B、およびDNAの共局在によって依然として同定されるであろう。
固定手順はまた、主にスペクトルの青みがかった/緑がかった部分で、組織の重要な自己蛍光を誘発することができます。この自己蛍光のほとんどを避けることは、青色の励起で使用されるフルオロクロムの放出最大値(例えば、Cy2、アレクサフルー)に一致する適切な狭いバンドパス蛍光フィルタセット(ワイドフィールド)または検出器設定(共焦点)を使用して、この自己蛍光のほとんどを避けるために重要です。488. 自己蛍光の極端な場合、スペクトルの青みがかった/緑がかった部分は避けるべきです。代わりに、蛍光信号はスペクトルの遠い部分(例えば、Cy5またはAlexaFluor 635に結合された二次抗体)で容易に検出できますが、これにはフィルターレスの白黒カメラまたは共焦点顕微鏡が必要です。人間の目は600nmを超えるかなり無感覚であるため、遠く赤色蛍光シグナルは眼を用いて検出することはほとんどできない。いずれにせよ、適切な露光時間または検出器の設定を決定するために、陰性コントロール(例えば、一次抗体の代わりに非免疫型/アイソタイプコントロール)を使用することが重要です。
1−2 μmの組織切片は10xまたは20xの目的を使用して広視野顕微鏡によって分析することができる。これらのレンズは、大きな焦点深さを提供するので、(ほぼ)組織セクション全体が焦点になります。これは、NET形成の領域が十分に大きい場合に組織セクションを迅速にスキャンするために使用できます (図 1のように)。緑(NE)、赤色(H2B)、青(DNA)チャネルの共局在化は、NET形成の領域を示す白色染色をもたらす(図1G)。高倍率を高めるには、デコンボリューションを伴う共焦点顕微鏡または広視野顕微鏡が必要です。図2は、図1にも使用されるヒト虫垂炎標本の詳細を示す。図2Aでは、NEは小さなドット(顆粒)に局局所化するが、大部分は細胞外であり、H2B(図2B)およびDNA(図2C)と重なるストライプを形成することが多い。このコローカライズの結果、NETs (図 2D)を示す白っぽいオーバーレイが発生します。M.結核に感染したマウスの肺部にも非常によく似たパターンが見られます(図3)。
ここで提示される標本は、低倍率でも同定できるNET形成度の高い領域を特徴とする。組織密度およびそれぞれの刺激に応じて、NET形成は、好中球の小さなグループのNET形成まで、はるかに顕著であり得る(例えば心筋炎の例では、以前の出版物12を参照)。このプロトコルは、組織内のNETに関するより多くの研究を促進し、うまくいけば、病気の形成または予防におけるNETの認識されていない役割の解明に役立つと考えられています。

好中球細胞外トラップ(NET)は複雑な三次元構造を持つ。高解像度の走査電子顕微鏡解析では、直径15~20nm(クロマチン)の滑らかな繊維で構成され、約30粒状および細胞質の品揃えで構成されていると考えられており、>25 nmの球状ドメインがちりばされている。タンパク質およびペプチド1,2.単離された好中球からインビトロで生成された場合、NETsは免疫蛍光(例えば、ヒストンおよび好中球エラスターゼ[NE])によって2つ以上の成分の染色によって同定することができる。未刺激型多原発性白血病(PMN)では、ヒストンは核内のみに位置し、NEは顆粒に含まれる。NETosisの間に、NEは核に入り、そこでヒストン3、4を処理する。NETは、刺激されていない好中球で明確に分離された成分のコローカライズによって特徴付けされます。現在、NET特異的エピトープを排他的に検出する抗体は存在しないため(すなわち、ナイーブ好中球と反応しない)、NETsにおける好中球タンパク質のコローカリゼーションを検出することがNETsを同定する唯一の方法である。
組織では、NETsは従来の組織学的染色(例えば、ヘマトキシリン/エオシン[H&E]で染色することによって、NETsを拡散淡い青みを帯びた色合いとして描写する)によって検出されにくい。非常に豊富な場合にのみ、NETは血栓5のようなH&E染色と明確に区別することができます。NETはそれ以上の拡散であるため、組織構造を最適に保存する必要があるため、凍結アーティファクトを誘発しやすいクライオ製剤は、組織内のNETの分析に最適ではありません。その代わりに、ホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みは、組織ウェル2におけるNET構造を維持することが示されている。(免疫-)パラフィン埋め込み組織のセクションの組織学的検査は、病理学的分析のための標準的な方法である。パラフィンブロック内の組織は室温(RT)でも保存されるため、毎日の診断作業の組織標本は、数年前に調製された標本と比較することができ、最近生じた疑問や技術を使用します。組織内のNETは最近まで検出されておらず、疾患の過程でNETの形成と除去の詳細な分析は、病因に関する新たな洞察につながる可能性があります。パラフィン埋め込み組織の使用は、アーカイブ材料の分析を可能にし、遡及的研究を行うために非常に貴重な利点を有する6.間違いなく、これらの利点はコストがかかります。パラフィンに埋め込む前に、組織はホルムアルデヒド固定、脱水、50°C以上の加熱されす必要があります。これらの手順は、組織の自己蛍光だけでなく、エピトープマスキングを誘発する。
固定アーティファクトを制限するには、固定時間を最小限に抑える必要がありますので、組織サンプルのサイズは、20 mm x 30 mm の面積を超えてはなりません (厚さ~3 mm)。このサイズのサンプルは、ホルムアルデヒドでRTで一晩インキュベーションした後に完全に固定され、理想的には直接脱水およびパラフィン埋め込みが続く。または、固定サンプルをバッファに1日または2日間保存することもできます。免疫蛍光研究のために、固定剤は、適切なバッファーに溶解したパラホルムアルデヒド(例えば、リン酸緩衝生理食べ物[PBS]またはトリスバッファー生理食べ物[TBS])から新たに調製されるべきである。固定調製中は、ギ酸の形成を防ぐために温度を60°C以下に保つ必要があります。病理の標準的な固定剤であるホルマリンは、メタノール、他のアルデヒド、ケトン、ギ酸を含むので使用しないでください。これらの不純物は、エピトープマスキングの増加および重要な組織自己蛍光につながる。
免疫標識を成功させるためには、エピトープマスキングを抗原検索と呼ばれるプロセスで元に戻す必要があります。組織切片は、メチレン橋を壊すと考えられている適切なバッファーで加熱されているので、エピトープは抗体7にアクセス可能になる。NETの検出のために、熱誘発エピトープ検索(HIER)は、プロテオ溶解酵素の使用などの他の方法に好ましい。日常的に、パラフィン切片の免疫標識は、単一の抗体で行われ、続いてペルオキシダーゼ標識二次抗体が、沈殿基板で検出される。免疫蛍光と比較して、酵素系検出方法は、沈殿物の拡散による空間分解能が低く、一般に、複数の抗原の同時検出は6である。
現在、NETに排他的に結合する抗体は存在しないため、このプロトコルは、核であるヒストン2Bと顆粒に局在する好中球エラスターゼの2つのタンパク質に標識するために使用されます。非刺激性好中球では、これらのタンパク質は分離されますが、NETosisを受けている好中球とNETsで共局在化します。2つの抗原の同時検出は、異なる宿主で発生した2つの一次抗体と、異なるフルオロクロムで標識された2種特異的二次抗体で達成することができる。このレポートは、以前に公開されたプロトコル8の標準化であり、ヒトおよびマウス起源のパラフィン埋め込み組織のNET成分を確実に染色する2つの市販抗体の組み合わせを使用しています。

<table><tbody><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>チキン アンチ ヒストン 2B 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab 134211</td><td></td></tr><tr><td>冷水魚ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>ロバ アンチ チキン抗体、Cy3 共役、複数のラベリングのために</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>703-165-155</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギ抗体、Cy2 共役、複数のラベリング</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>711-225-152</td><td>あるいは Cy5 コンジュゲート、711-175-152</td></tr><tr><td>埋め込みカセット</td><td>Roth</td><td>K116.1</td><td></td></tr><tr><td>埋め込み金型</td><td>Sakura</td><td>4162</td><td></td></tr><tr><td>埋め込みステーション</td><td>Microm</td><td>AP280</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Roth</td><td>9065.4</td><td></td></tr><tr><td>濾紙、ロール</td><td>OCB</td><td></td><td></td></tr>直径20cmの<tr><td>鉗子</td><td>デュモン</td><td>7a</td><td></td></tr><tr><td>ガラス</td><td></td>シリンダーVWR216-0075<td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td></td>Roth3783.1HIER<td></td><td></td></tr><tr><td></td>バッファーpH9ScytekTES999<td></td><td></td><td></td></tr>ヘ<tr><td>キスト33342</td><td>シグマ</td><td>14533イン</td><td></td></tr><tr><td>キュベーター(乾燥、最大40°C;C)</td><td>Memmert</td><td>MMIPP30</td><td></td></tr><tr><td>モイストチャンバー(蓋がしっかりしたプラスチックボックス)</td><td>Emsa</td><td>508542</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Aldrich</td><td>32.459-0</td><td></td></tr><tr><td>ノーマルロバ血清</td><td>メルク</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>PAPペン ImmEdge</td><td>ベクターラボ</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンミクロトーム</td><td>Microm</td><td>355S</td><td>ウォーターバス付属</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>アルドリッチ</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>シューベルト/ヴァイス</td><td>7020051</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ 抗 ELANE 抗体</td><td>アトラス</td><td>HPA068836</td><td></td></tr><tr><td>ラック、顕微鏡スライド用瓶</td><td>ロス</td><td>H554.1 H552.1</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>ブラウン</td><td>Fig.22</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス スライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td>J1800AMNZ</tr><tr><td>温度制御ホットプレート</td><td>NeoLab</td><td>D6010</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン包埋用組織プロセッサ</td><td>ライカ</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>トリス緩衝生理食塩水 TBS</td><td>VWR</td><td>788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fluka</td><td>93773</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス 37 &deg;C</td><td>GFL</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMR, SP8</td><td></td></tr><tr><td>キシレン (ジメチルベンゼン)</td><td>Roth</td><td>9713.3</td><td></td></tr></tbody></table>

パラフィン埋め込み組織におけるヒトおよびマウス好中球外細胞トラップの免疫蛍光標識

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

好中球顆粒球は、その基調核による多形核白血病(PMN)とも呼ばれ、最も豊富なタイプの白血病細胞である。彼らは骨髄で成熟し、末梢血に放出され、そこで約6−8時間循環する。しかし、組織では、彼らは何日も生き残ることができます。内皮を通してダイアペデス症を起用することにより、血流を離れ、組織に入り、化学的勾配に続く感染部位に向かって移動する。好中球は、性細胞減少、脱顆粒、好中球細胞外トラップ(NET)の生成によって侵入微生物と戦うことができます。このプロトコルは、パラフィン埋め込み組織のNETを検出するのに役立ちます。NETsはNETosisと呼ばれるプロセスの結果であり、生きている(重要なNETosis)または死ぬ(自殺NETosis)好中球から核、粒状、細胞質の成分の放出につながる。インビトロでは、NETsは雲状の構造を形成し、それらが降りてくる細胞の数倍の大きさの空間を占めています。NETsのバックボーンはクロマチンで、顆粒と細胞質に由来するタンパク質とペプチドの選択が結合している。それによって、NETが細菌、真菌、ウイルス、寄生虫を含む様々な病原体を捕捉し、不活性化できるように、高い局所濃度の有毒化合物が維持され、損傷につながる活性の高いNET成分の拡散隣接する組織は限られています。しかし、近年、NETが豊富に発生したり、不十分にクリアされたりすると、自己免疫疾患からがんに至るまで病理学的な可能性を持つことが明らかになっています。したがって、組織サンプル中のNETの検出は診断上の意義を有し、疾患組織におけるNETの検出は患者の治療に影響を及ぼす可能性がある。パラフィン埋め込み組織サンプルは病理学的分析に用いられる標準的な標本であるため、市販の抗体を用いてパラフィン埋め込み組織におけるNET成分の蛍光染色のためのプロトコルを確立することが求められた。

このプロトコルを使用して、NET成分は、ヒトおよびマウス起源のパラフィン埋め込み組織で正常に検出することができる。非刺激性好中球では、H2Bは顆粒中の核および好中球エラスターゼのみに位置する。その結果、蛍光シグナルは重なりません。対照的に、NETosisおよびNET形成後、NE、H2B、およびDNAは部分的にコローカライズする。緑、赤、青の信号としてイメージされている場合、コローカライズの領域は白っぽいオーバーレイとして表示されます(図 1G、図 2D、図3D)。このオーバーレイは、画像解析ソフトウェアを使用して定量化することもできます。緑、赤、青に対して正の信号が重なり合うピクセルは、図 1G、図 2D'、および図 3D'の NET 領域を示す紫色のオーバーレイを作成するために使用されています。図1および図2の細胞の一部は、核をロブ化しているが、NEに対しては陰性である。これらの細胞は好酸球顆粒球であると考えられている。
組織セクションの厚さが2~3μmの場合は、10倍または20倍の目的を用いて広視野顕微鏡で分析できます。図1に例を示し、NE(緑)、H2B(赤)およびHoechst 33342(青)に染色されたヒト虫垂組織の一部を示す。パネルA、C、E、およびGはNETを含むセクションの領域から、パネルB、D、F、およびHは多数の好中球(図1B、NE)を含む同じセクションの異なる領域から来ているが、NETsは含まない。3つのNET成分すべてがコローカライズするので、大規模なNET形成を有する領域は、多くの場合、3つのチャネルのオーバーレイに白っぽい細胞外線維として現れる文字列体外構造で、低倍率でも容易に見つけることができます(図1G))、図1Gの紫色のオーバーレイ。
両方の組織領域の染色パターンは明らかに異なり、NEは顆粒(図1B)および核内のDNA(図1F)に含まれる。興味深いことに、H2Bの染色は、NET含有組織(図1C)と比較して好中球が豊富な領域(図1D)においてかなり弱い。これは、抗体の大きさ(IgYはIgGの場合150kDに比べて180kD)に起因する可能性があり、無傷の核におけるコンパクトなクロマチンへの結合を防ぐことができますが、H2Bへのアクセスは、NETsの場合と同様にクロマチンが凝縮されている場合に容易になります(図1C)。
高解像度では、焦点の外れたぼかしを最小限に抑えるために、共焦点顕微鏡またはデコンボリューションを持つ広視野顕微鏡を使用する必要があります。図2は、同じヒト虫垂炎標本からのNETリッチ領域を示す。これは、共焦点スタックの最大投影です。NE(緑色、図2A)は顆粒に含まれるが、細胞外にも豊富であり、H2B(赤色、図2B)およびDNA(青色、図2C)と共局所化する。細胞外のコローカライズは、白っぽい色の組み合わせになります(図2D)。これらのピクセルは、図 2D'で NET を示す紫色のオーバーレイを作成するために、緑、赤、青の正のピクセルを使用しています。
図3は、結核菌(M.tb)に感染したマウス肺からの中央部の詳細である。抗原の検索および染色条件は、図1および図2と同じである。繰り返しますが、3つのNETコンポーネントすべてのコローカリゼーションは、図3D'でNETを示す紫色の層を作成するために使用されてきた好中球間の白っぽい領域として明確に見えます。
染色の特異性は、対照抗体によるごくわずかな染色を示す補足図1で示され、補足図1A、Bはウサギの非免疫血清(緑)および鶏の抗GFP IgY(赤色)を示す。図 1C,Dは二次抗体単独で染色を示し、その組み合わせは図1、図2、および図3で用いられたものと同じであった。補足図1A,Cは、図1および図2に類似したヒト虫垂炎のセクションを示す。補足図1B,Dは、図3と同様のマウス肺組織である。DNAは、ホーヒスト33342で染色される。スケール バーは 25 μm を表します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig01.jpg"> 図1:ヒト虫垂炎試料のパラフィン部の広視野蛍光顕微鏡検査。 パネルA、C、E、およびGはNETを持つ組織領域を示し、パネルB、D、F、およびHは好中球が豊富であるが、NET形成なしで同じセクションの異なる領域を示す。染色はNE(A,B;緑)、H2B(C、D;赤)、およびDNA(E、F;青色)に対してです。図1G,Hは3つのチャンネルすべてのオーバーレイを表す。すべての色で80と256の間の強度を持つピクセルは、NE、H2B、およびDNAの重なり合う染色の領域を表し、NETosisを受けているNETsまたは好中球に由来すると考えられています。これらのピクセルは、パネルG'で紫色として擬似色で、大きな領域を形成しています。そしてパネルH'では、小さなスポットだけが見つかります。画像は20倍の目的を使用して広視野顕微鏡で撮影され、スケールバーは25μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig01large.jpg" target="_blank">を表します。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig02.jpg"> 図2:ヒト虫垂炎試料中のNET成分の共焦点蛍光顕微鏡検査。 図1で用いたのと同じ組織部を用いた。(A)NEに対する染色,(B)H2Bの描写、および(C)ホッヒスト33342DNAの染色。(D)3 つのチャネルすべてのオーバーレイ。3つの信号すべてのコローカリゼーションは、パネルD'で擬似色の紫色です。このため、Volocity 6.3 を使用して、3 色すべてで強度 &gt;80 のピクセルを検出しました。紫色の領域は、NETosisを受けているNETsまたは好中球を示しています。画像は、Zスタックとして共焦点顕微鏡で撮影され、最大投影として提示された。スケールバーは25 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig02large.jpg" target="_blank">を表し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig03.jpg"> 図3:M.tbに感染したマウス肺におけるNET成分の共焦点蛍光顕微鏡検査 これは、大規模な好中球浸潤を伴う完全な肺のセクションの中央部からの詳細です。(A)NE染色、(B)H2B染色、及び(C)DNA染色。(D)3 つのチャネルすべてのオーバーレイ。パネルD'の紫色のオーバーレイは、NETosisを受けている好中球とNETsを示すすべての3色で&gt;80の強度値を持つピクセルを示します。画像は共焦点顕微鏡を用いたZスタックとして撮影し、最大投影として提示した。スケールバーは25 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig03large.jpg" target="_blank">を表し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a>
補足図1:無関係な一次抗体を伴う染色制御。ヒト(A,C)およびマウス組織(B,D)は、図1および図2に用いたものと、図3にそれぞれ、無関係な一次抗体(A,B)または一次抗体(C,D)なしで染色した。パネルA及びBにおける対照一次抗体として、GFPに対する非免疫ウサギおよびニワトリIgYからの血清を適用した。二次抗体は、他のすべての染色に示すのと同じであり、パネルCおよびDにも用いられた。予想通り、すべての条件において、ごくわずかな背景染色が検出され、図1、図2、および図3に使用される抗体の特異性を示した。画像は共焦点顕微鏡で撮影し、DNAはHoechst 33342で染色され、スケールバーは25μm<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115supfig01large.jpg" target="_blank">を表します。</a>

好中球細胞外トラップ(NET)は、刺激された好中球顆粒球によって生成される三次元構造である。近年、NETが多種多様な疾患に関与していることが明らかになりました。組織内のNETの検出は診断上の関連性を持つ可能性があるため、NETコンポーネントを標識するための標準化されたプロトコルが必要です。

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

今日は、一般的な熱誘導抗原検索プロトコルの変異体をお見せしたいと思います。これは、好中球エラスターゼ抗原の低い温度の利点とヒストンに必要な高いpH値を兼ね備えています。この技術は、マウスまたは男性からのパラフィン組織におけるNET、好中球外細胞トラップを研究することを可能にする。また、アーカイブされた資料や回顧研究を研究することも検討されています。まず、準備したスライドをラックに入れ、脱水に使用されるメディアに入れ、それぞれ5分間逆の順序でクリアします。次に、温度管理されたホットプレートを加えた水浴を摂氏70度に加熱します。熱誘導エピトープの取り出しバッファーと10%グリセロールを水浴に充填した瓶を置きます。バッファが摂氏 70 度に達したら、スライド付きのラックをバッファジャーに入れます。スライドを摂氏70度で120分間インキュベートします。その後、水浴から瓶を取り出し、室温まで冷まします。冷却された切片をイオン化された水で3回、TBSで1回リンスします。次に、疎水性バリアペンを使用して、各セクションの周囲にバリアを作成します。非特異的結合を防止するために、室温でブロッキングバッファー内のセクションを 30 分間インキュベートします。1ミリリットル当たり1マイクログラムの濃度でブロッキングバッファー内の一次抗体を希釈します。スライドからブロッキングバッファーを取り出し、希釈された一次抗体を添加し、乾燥を防止するのに十分な量を使用することを確認します。湿った容器を閉じ、室温で一晩インキュベートする。翌日、セクションをTBSで3回洗浄し、各洗浄は5分間続きます。ブロッキングバッファー内の二次抗体の作動溶液を調製する。二次抗体溶液で組織の切片を覆い、滑り込み容器に移します。湿った容器を密封し、室温で1時間インキュベートする。この後、セクションをTBSで3回、水で1回洗浄し、各洗浄は5分間続きます。洗浄した部分を取り付け媒体で覆い、泡形成を避けながらカバーガラスを塗布します。取り付け培地が固化した後、共焦点顕微鏡または適切なバンドパスフィルターを備えた広視野顕微鏡を使用して、免疫蛍光を分析する。スライドスキャナーを使用してセクション全体をデジタル化するには、負と正のコントロールを使用して蛍光強度を設定します。好中球エラスターゼ染色を使用して、好中球が豊富な領域を見つけ、それらの領域を拡大して、好中球エラスターゼシグナルが粒状または細胞外であるかどうかを確認します。シグナルが細胞外であり、ヒストン染色とDNA染色の両方と重なっている場合、好中球の細胞外トラップが得られている。本研究では、ヒトとマウスの両方の起源であるパラフィン埋め込み組織でNET成分が正常に検出される。組織切片の厚さが2~3マイクロメートルの間にある場合、10xまたは20xの目的を使用して広視野顕微鏡で分析することができます。染色を正しく評価するために、陰性サンプルと陽性サンプルの両方を処理しています。ヒト虫垂炎組織の代表的な部分は、NE、H2B、およびHoechst 33342に染色された組織を示す。左側の画像はNETを含むセクションの領域から、右側の画像は同じセクションの異なる領域からのもので、多数の好中球が含まれていますが、NETはありません。3つのNETコンポーネントすべてがしばしばひも状の細胞外構造で共局化するため、大規模なNET形成領域は低倍率でも容易に見つけることができます。これは、3つのチャンネルのオーバーレイに、画像解析ソフトウェアを使用して緑色、赤、青に正のピクセルを使用して紫色のオーバーレイを作成することで定量化できる白っぽい細胞外繊維として表示されます。高分解能のために、デコンボリューションを持つ共焦点顕微鏡または広視野顕微鏡は焦点外のぼかしを最小限に抑えるために使用する必要があります。同じヒト虫垂炎標本からのNETリッチ領域の共焦点スタックの最大投影は、NEが顆粒に見られるが、H2BおよびDNAと共局化する細胞外にも豊富であることを示している。細胞外の共局在化により、白っぽい色の組み合わせが生じる。緑、赤、青の正のピクセルをもう一度使用して、NET を表示する紫色のオーバーレイを作成できます。結核菌に感染したマウス肺の中央部分の代表的な詳細は、NETを示す紫色の層を作成するために使用できる好中球間の白っぽい領域として明確に見える3つのNET成分の共局在化のもう一つの例を提供する。染色手順の間、偽陽性染色または高い背景を引き起こすので、セクションは乾燥して落ちてはいけません。アーカイブされた材料の分析は、病気におけるNETの影響を理解するのに役立つ可能性があります。パラフィン組織は巨大な背景を持つことができるので、あなたの染色と背景を区別することができる肯定的な対照と否定的なコントロールを持つことは重要です。脱蝋と脱水は、ヒュームフードの下で行われるべきです。手袋とラボコートを着用してください。

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