パラフィン埋め込み組織におけるヒトおよびマウス好中球外細胞トラップの免疫蛍光標識

好中球細胞外トラップ(NET)は、刺激された好中球顆粒球によって生成される三次元構造である。近年、NETが多種多様な疾患に関与していることが明らかになりました。組織内のNETの検出は診断上の関連性を持つ可能性があるため、NETコンポーネントを標識するための標準化されたプロトコルが必要です。

今日は、一般的な熱誘導抗原検索プロトコルの変異体をお見せしたいと思います。これは、好中球エラスターゼ抗原の低い温度の利点とヒストンに必要な高いpH値を兼ね備えています。この技術は、マウスまたは男性からのパラフィン組織におけるNET、好中球外細胞トラップを研究することを可能にする。

また、アーカイブされた資料や回顧研究を研究することも検討されています。まず、準備したスライドをラックに入れ、脱水に使用されるメディアに入れ、それぞれ5分間逆の順序でクリアします。次に、温度管理されたホットプレートを加えた水浴を摂氏70度に加熱します。

熱誘導エピトープの取り出しバッファーと10%グリセロールを水浴に充填した瓶を置きます。バッファが摂氏 70 度に達したら、スライド付きのラックをバッファジャーに入れます。スライドを摂氏70度で120分間インキュベートします。

その後、水浴から瓶を取り出し、室温まで冷まします。冷却された切片をイオン化された水で3回、TBSで1回リンスします。

次に、疎水性バリアペンを使用して、各セクションの周囲にバリアを作成します。非特異的結合を防止するために、室温でブロッキングバッファー内のセクションを 30 分間インキュベートします。1ミリリットル当たり1マイクログラムの濃度でブロッキングバッファー内の一次抗体を希釈します。

スライドからブロッキングバッファーを取り出し、希釈された一次抗体を添加し、乾燥を防止するのに十分な量を使用することを確認します。湿った容器を閉じ、室温で一晩インキュベートする。翌日、セクションをTBSで3回洗浄し、各洗浄は5分間続きます。

ブロッキングバッファー内の二次抗体の作動溶液を調製する。二次抗体溶液で組織の切片を覆い、滑り込み容器に移します。湿った容器を密封し、室温で1時間インキュベートする。

この後、セクションをTBSで3回、水で1回洗浄し、各洗浄は5分間続きます。洗浄した部分を取り付け媒体で覆い、泡形成を避けながらカバーガラスを塗布します。取り付け培地が固化した後、共焦点顕微鏡または適切なバンドパスフィルターを備えた広視野顕微鏡を使用して、免疫蛍光を分析する。

スライドスキャナーを使用してセクション全体をデジタル化するには、負と正のコントロールを使用して蛍光強度を設定します。好中球エラスターゼ染色を使用して、好中球が豊富な領域を見つけ、それらの領域を拡大して、好中球エラスターゼシグナルが粒状または細胞外であるかどうかを確認します。シグナルが細胞外であり、ヒストン染色とDNA染色の両方と重なっている場合、好中球の細胞外トラップが得られている。

本研究では、ヒトとマウスの両方の起源であるパラフィン埋め込み組織でNET成分が正常に検出される。組織切片の厚さが2~3マイクロメートルの間にある場合、10xまたは20xの目的を使用して広視野顕微鏡で分析することができます。染色を正しく評価するために、陰性サンプルと陽性サンプルの両方を処理しています。

ヒト虫垂炎組織の代表的な部分は、NE、H2B、およびHoechst 33342に染色された組織を示す。左側の画像はNETを含むセクションの領域から、右側の画像は同じセクションの異なる領域からのもので、多数の好中球が含まれていますが、NETはありません。3つのNETコンポーネントすべてがしばしばひも状の細胞外構造で共局化するため、大規模なNET形成領域は低倍率でも容易に見つけることができます。

これは、3つのチャンネルのオーバーレイに、画像解析ソフトウェアを使用して緑色、赤、青に正のピクセルを使用して紫色のオーバーレイを作成することで定量化できる白っぽい細胞外繊維として表示されます。高分解能のために、デコンボリューションを持つ共焦点顕微鏡または広視野顕微鏡は焦点外のぼかしを最小限に抑えるために使用する必要があります。同じヒト虫垂炎標本からのNETリッチ領域の共焦点スタックの最大投影は、NEが顆粒に見られるが、H2BおよびDNAと共局化する細胞外にも豊富であることを示している。

細胞外の共局在化により、白っぽい色の組み合わせが生じる。緑、赤、青の正のピクセルをもう一度使用して、NET を表示する紫色のオーバーレイを作成できます。結核菌に感染したマウス肺の中央部分の代表的な詳細は、NETを示す紫色の層を作成するために使用できる好中球間の白っぽい領域として明確に見える3つのNET成分の共局在化のもう一つの例を提供する。

染色手順の間、偽陽性染色または高い背景を引き起こすので、セクションは乾燥して落ちてはいけません。アーカイブされた材料の分析は、病気におけるNETの影響を理解するのに役立つ可能性があります。パラフィン組織は巨大な背景を持つことができるので、あなたの染色と背景を区別することができる肯定的な対照と否定的なコントロールを持つことは重要です。

脱蝋と脱水は、ヒュームフードの下で行われるべきです。手袋とラボコートを着用してください。