Name: 圧力筋グラフを用したマウス生殖系の二軸基底音と受動的試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学ぶ 圧力筋グラフを用いたマウス子宮頸管・膣の二軸機械特性評価法。平滑筋細胞と細胞外基質の寄与を生理学的条件下で解析し、女性の健康と生殖生理学的研究に貢献する。

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この作品は、NSFキャリア賞助成金#1751050によって資金提供されました。

この記事で提供されるプロトコルは、マウス膣および子宮頸部の機械的特性を決定する方法を提示する。このプロトコルで分析される機械的特性は、器官の受動的および基底調素状態の両方を含む。受動的および基底トーン条件は、器官が水没する生化学的環境を変化させることによって誘発される。このプロトコルでは、基底試験に関与する媒体にはカルシウムが含まれています。基底トーン条件を試験すると、女性の生殖器官54,55内の平滑筋細胞機械的寄与の単離が可能である。受動機械試験を行う場合、媒体はカルシウムを含まない。カルシウムの欠如は、収縮から平滑筋細胞を阻害します。.これにより、コラーゲンや弾性繊維などの他のECM成分の解明が可能となり、受動性の機械的特性が大きく左右されます。生化学的および組織学的分析と組み合わせることで、これらの結果はECM微構成と機械的機能との関係の解明を可能にする。これは、女性の生殖健康に関連する病理の構造的および機械的メカニズムの線引きを可能にする。
以前は、膣と子宮...

膣壁は、上皮、層体プロプリア、筋肉、およびアドベンティシアの4つの層で構成されています。上皮は、主に上皮細胞から構成される。ラミナプロプリアは、弾性およびフィブリルコラーゲン繊維を大量に有する。筋肉はまた、エラスチンとコラーゲン繊維で構成されていますが、平滑筋細胞の量が増加しています。このアドベンティシアは、前の層と比較して濃度が低下するが、エラスチン、コラーゲン、および線維芽細胞で構成される。平滑筋細胞は、臓器の収縮性の役割を果たしているので、生体力学的に動機づけられた研究グループに関心があります。そのため、平滑筋細胞領域分画と組織を定量化することは、機械的機能を理解する上で重要である。以前の研究は、膣壁内の平滑筋含有量が主に円周軸と縦軸で組織されたことを示唆している。組織学的分析は、平滑筋領域の分率が壁1の近位部および遠位部の両方に対して約35%であることを示唆している。
子宮頸部は非常にコラーゲン構造であり、最近まで、平滑筋細胞含有量を最小限に抑えるものと考えられていた2,3.しかし、最近の研究は、平滑筋細胞が子宮頸部4、5においてより多くの存在と役割を持つことが示唆されている。子宮頸部は、平滑筋細胞の勾配を示す。内部osは、外部osが10%しか含まれている50-60%の平滑筋細胞が含まれています。しかし、マウス研究は、10〜15%の平滑筋細胞と85〜90%の線維性結合組織で構成される子宮頸部を報告し、局所的な差は言及しない6、7、8である。マウスモデルが頻繁に報告されるヒトモデルと異なっていることを考えると、マウス子宮頸部に関するさらなる調査が必要である。
このプロトコルの目的は、マウス膣および子宮頸部の機械的特性を解明することであった。これは、ネイティブの細胞マトリックス相互作用と器官形状を維持しながら、円周方向と軸方向の機械的特性の評価を同時に可能にする圧力筋グラフ装置を使用することによって達成されました。器官は2つのカスタムカニューレに取付けられ、絹の6-0縫合糸で固定された。圧力直径試験は、推定生理軸ストレッチの周りに行われ、コンプライアンスおよび接線モジュリ9を決定した。力長試験は、推定軸伸縮性を確認し、機械的特性が生理学的範囲で定量化されたことを確認するために行われた。実験プロトコルは、妊娠4~6ヶ月の妊娠4~6ヶ月で非妊娠マウス膣および子宮頸部に対して行われた。
プロトコルは、基礎音と受動試験の2つの主要な機械試験セクションに分かれています。基底トーンは、滑筋細胞のベースライン部分収縮として定義され、外部局所、ホルモン、および神経刺激10が存在しない場合でも。膣および子宮頸部のこのベースライン収縮性は、その後圧力筋グラフシステムによって測定される特徴的な機械的挙動をもたらす。受動的特性は、収縮のベースライン状態を維持する細胞間カルシウムを除去することによって評価され、平滑筋細胞の弛緩をもたらす。受動的な状態では、コラーゲンおよびエラスチン繊維は、器官の機械的特性に対する支配的な寄与を提供する。
マウスモデルは、女性の生殖健康の病理を研究するために広く使用されています。マウスは、生殖システム11、12、13、14内のECMと機械的特性との間の進化する関係を定量化するためのいくつかの利点を提供する。これらの利点は、短く、よく特徴付けられたエストルースサイクル、比較的低コスト、取り扱いの容易さ、および比較的短い妊娠時間15を含む。さらに、実験用マウスのゲノムは十分にマッピングされ、遺伝子組み換えマウスは、機械的仮説16、17、18をテストするための貴重なツールである。
市販の圧力ミオグラフシステムは、様々な組織や器官の機械的応答を定量するために広く使用されています。圧力筋グラフシステムで分析されたいくつかの注目すべき構造は、弾性動脈19、20、21、22、静脈および組織工学的血管移植片23、24、を含む食道25、および大腸26。圧力筋グラフ技術は、ネイティブセルECM相互作用と生体内ジオメトリを維持しながら、軸方向と周囲方向の特性を同時に評価することを可能にします。軟部組織および臓器力学におけるミオグラフシステムの広範な使用にもかかわらず、圧力ミオグラフ技術を利用するプロトコルは、これまで膣および子宮頸部のために開発されていなかった。膣および子宮頸部の機械的特性に関する以前の調査は、単一軸27、28を評価した。しかし、これらの器官は、体内で多軸負荷を経験し、従って、その二軸機械的応答を定量化することが重要である。
さらに、最近の研究は、平滑筋細胞が軟部組織病理5、28、31、32において潜在的な役割を果たす可能性があることを示唆している。これは、ネイティブの細胞マトリックス相互作用を維持するので、圧力筋グラフ技術を利用するもう一つの魅力を提供し、したがって、平滑筋細胞が生理学的および病態生理学的に果たす貢献の線引きを可能にする条件。本明細書では、基底音と受動条件の両方下で膣および子宮頸部の多軸機械的特性を定量するプロトコルを提案する。

<table><tbody><tr><td>2Fカテーテル</td><td></td><td>ミラーSPR-320</td><td>頸部圧を測定するカテーテル</td></tr><tr><td>6-0 縫合</td><td>糸 ファインサイエンスツール</td><td>18020-60</td><td>より大きな縫合糸タイ</td></tr><tr><td>CaCl2 (無水)</td> <td>VWR</td><td>97062-590</td><td>HBSS 濃度: 140 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2-2H20</td><td>フィッシャー化学</td><td>BDH9224-1KG</td><td> KRB 濃度: 3.68 g/L</td></tr><tr><td>デキストロース (D-グルコース)</td><td>VWR</td><td>101172-434</td><td>HBSS濃度:1000 mg / mL KRB濃度:19.8 g / L</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>湾曲した鉗子</td></tr><tr><td>Dumont SS</td><td>Forceps Fine Science Tools</td><td>11203-25</td>ストレート<td>鉗子</td></tr><tr><td>イメージングに使用されるEclipse</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>流量計</td><td>デンマークのMyoTechnologies</td><td>試験装置内の</td><td>161FM</td>流量計</tr><tr><td>力変換器 - 110P</td><td>デンマークのMyoTechnologies</td><td>100079</td><td>力変換器</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>SciJava</td><td>ImageJ1</td><td>体積を測定するために使用される</td></tr><tr><td>計器ケース</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>20830-00</td><td>解剖ツールを保持するためのケーシング</td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>97061-566</td><td>HBSS濃度:400 mg / mL KRB濃度:3.5 g / L</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>G-Biosciences</td><td>71003-454</td><td>HBSS濃度:60 mg / mL</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>VWR</td><td>97064-150</td><td> KRB濃度:1.14 g / L</td></tr><tr><td>MgCl2-6H2O</td><td>VWR</td><td>BDH9244-500G</td><td>HBSS濃度:100 mg / mL</td></tr><tr><td>MgSO4-7H20</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>HBSS濃度:48 mg / mL</td></tr>スプレッドシート<tr><td>Na2HPO4(二塩基性無水)</td><td>VWR</td><td>97061-588</td><td>HBSS濃度:48 mg / mL / KRB濃度:1.44 g / L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td>HBSS濃度:8000 mg / mL KRB濃度:70.1 g / L</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NaHCO3</td><td>VWR</td><td>97062-460</td><td>6278402HBSS濃度:350 mg / mL KRB濃度:21.0 g / L</td></tr><tr><td>圧力筋グラフシステム</td>デンマーク<td>のMyoTechnologies</td><td>110Pおよび120CP</td><td>圧力筋グラフシステム: プログラム、カニューレ挿入装置、 およびコントローラーユニット</td></tr><tr><td>圧力トランスデューサ</td><td>デンマークのMyoTechnologies</td><td>100106</td><td>圧力トランスデューサ</td></tr><tr><td>学生デュモン#5鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91150-20</td><td>ストレート鉗子</td></tr><tr><td>学生 バンナス 春はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91500-09</td><td>マイクロハサミ</td></tr><tr><td>組織染料</td><td>ブラッドリー製品</td><td>1101-3</td><td>in vivo ストレッチを測定するインク</td></tr><tr><td>超音波トランスデューサ</td><td>富士フイルムビジュアルソニックス</td><td>LZ-550</td><td>超音波トランスデューサを使用; 256 要素、40 MHz 中心周波数</td></tr><tr><td>VEVO2100</td><td>富士フイルムビジュアルソニックス</td><td>VS-20035</td><td>超音波</td></tr>は<tr><td>、イメージングに使用されるワグナーはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14069-12</td><td>大きなはさみ</td></tr></tbody></table>

圧力筋グラフを用したマウス生殖系の二軸基底音と受動的試験

Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph

女性の生殖器官、特に膣および子宮頸部は、様々な細胞成分とユニークな細胞外マトリックス(ECM)で構成されている。平滑筋細胞は、膣および頸部壁内の収縮機能を示す。生化学的環境と臓器壁の機械的膨張に応じて、平滑筋細胞は収縮状態を変化させる。ベースライン生理条件下での平滑筋細胞の寄与は、基底トーンとして分類される。より具体的には、基底トーンは、ホルモンおよび神経刺激がない場合の平滑筋細胞のベースライン部分収縮である。さらに、ECMは器官の壁のための構造サポートを提供し、生化学的手がかりのための貯蔵所として機能する。これらの生化学的手がかりは、成長を刺激し、恒常化を維持するなど、様々な臓器機能に不可欠です。各器官のECMは、主にコラーゲン繊維(主にコラーゲンタイプI、III、およびV)、弾性繊維、およびグリコサミノグリカン/プロテオグリカンで構成されています。ECMの組成および組織は、各器官の機械的特性を決定する。ECM組成物の変化は、骨盤臓器脱出や早期子宮頸部改造などの生殖病理学の発症につながる可能性がある。さらに、ECM微細構造および剛性の変化は、平滑筋細胞活性および表現型を変化させ、したがって収縮力の喪失をもたらす。
この研究では、報告されたプロトコルは、妊娠していないマウス膣および子宮頸部の基底トーンおよび受動的な機械的特性を、エストラスの生後4〜6ヶ月で評価するために使用される。器官は市販の圧力ミオグラフに取り付けられ、圧力直径および力長の両方のテストが行われた。生殖器官の機械的特徴付けのためのサンプルデータおよびデータ分析技術が含まれる。このような情報は、数学的モデルを構築し、女性の健康病理のための治療介入を合理的に設計するのに役立つ可能性があります。

女性の生殖器官の機械的特性の正常な分析は、適切な臓器解剖、カンヌレーション、およびテストに依存しています。子宮角を欠陥なく膣に植え付ける必要がある(図1)。臓器の種類によってカニューレの大きさが異なります(図2)。実験中に臓器が動くだけでなく、処置中に器官の壁を損傷しないように、カンヌレーションを行う必要があります(図3)。いずれかのステップの失敗は、容器が圧力を保持することができない結果になります。一貫性のある反復可能な結果を得るためには、プロシージャの標準化はプロトコルの成功に不可欠です。
臓器が解剖され、適切にカニューズされると、圧力筋グラフシステムに電力を供給します。圧力ミオグラフシステムのセットアップには、コントローラユニット、流量計、ステージが含まれます(図4)。圧力筋グラフシステムは、機械的検査を受ける臓器の様々な側面を監視するために使用されます(図5)。超音波システ...

このプロトコルは、市販の圧力ミオグラフシステムを利用して、マウス膣および子宮頸部の圧力筋グラフ試験を行った。カルシウムの有無にかかわらず培地を利用して、平滑筋細胞(SMC)基底色および受動細胞外マトリックス(ECM)の寄与は、推定生理学的条件下で臓器に対して単離された。

The female reproductive organs, specifically the vagina and cervix, are composed of various cellular components and a unique extracellular matrix (ECM). ...

このプロトコルは、平滑筋細胞および受動母質からの寄与を解明する生殖器官の二軸的な機械的特性を調べる。この技術は、器官の形状および母体の平滑筋細胞をマトリックス相互作用に維持し、器官の主観的な圧力および軸エクステンションの範囲に器官を受ける。生理学的に関連する負荷下での臓器二軸機能を調べていると、生殖病理の病因をよりよく理解する助けとなるかもしれない。子宮頸部と膣を隔軸的に検査すると、女性の健康とバイオメカニクスの分野に関する洞察が得られます。同様の方法は、血管、食道および大腸を研究するために利用される。新しい臓器を使用する場合、組織を縫合する方法やアンロードされた長さを決定する方法などの技術的な詳細を確定するのに時間がかかる場合があります。実験動物から生殖器系を採取するには、マウスを解剖顕微鏡の下の吸収パッドの上に置き、斜めピンセットとハサミを使って腹部の周りの皮膚を持ち上げます。腹筋壁を穿刺しないほど浅い恥骨の上の腹部の基部に最初の切開を行い、肋骨ケージに向かって優れた切開を続け、腹筋を通して深く切開を続ける。表面的な脂肪を取り除き、慎重に陰部のシンフィシスを切断した後、まっすぐなピンセットを使用して膀胱をつかんで緊張を作り出し、鈍い解剖を使用して周囲の組織を膣から分離する。その後、生殖器系の基盤を切断して、体腔から組織を取り除く。収穫されたシステムに適したサイズのカニューレを決定した後、頸部側をカニューレーション装置の力のトランスデューサ部分に取付け、装置のマイクロメータ部分にオルガンの反対側端を取り付ける。その後、縫合糸で両端を締めます。装着された組織のアンロードされた長さを見つけるには、まず壁が張力を持たないように臓器を伸ばします。膣の場合は、膣壁の溝を観察します。子宮頸部の場合は、中央の子宮頸部の上と下にあるインクドットのすぐ下に切ります。キャリパーを使用して、縫合糸から縫合までのシステムの長さを測定し、1ミリメートルの水銀増分で、ミオグラフシステムの圧力を0から10ミリメートルの水銀に上げます。臓器が崩壊しなくなった圧力は、所定の圧力で外径で最大のジャンプとして決定することができます。圧力と外径を記録した後、これらのデータを臓器が崩壊しない最初の点として注意し、力をゼロにする。インビボストレッチの実験を見つけるには、アンロードされた圧力で推定インビボの長さにオルガンを調整し、開始をクリックして、アンロードされた圧力から最大圧力までの圧力値の圧力対力値を評価します。次に、[停止] をクリックしてファイルを保存します。圧力直径プリコンディショニングの場合は、圧力を水銀の0ミリメートル、実験のインビボの長さに、勾配を1秒あたり1.5ミリメートルに設定します。水銀のゼロミリメートルから最大圧力とアンロードされた圧力までの圧力を取り、30秒間保持し、さらに30秒のホールド期間で水銀のゼロミリメートルに戻るシーケンスを実行します。このシーケンスを合計 5 サイクル繰り返した後、[停止] をクリックしてファイルを保存します。力長プリコンディショニングの場合は、最大圧力の1/3と入口圧と出口圧力の両方に対するアンロードされた圧力を入力し、インビボの長さのマイナス2%にオルガンを調整します。開始をクリックし、長さを2%in vivoの長さに調整し、10マイクロメートル/秒のレートでマイナス2%まで戻ります。[停止]をクリックしてファイルを保存する前に、合計 5 サイクルの軸方向の延長を繰り返します。インビボの長さの圧力直径のテストのために開始をクリックし、インビボの長さに臓器を調整し、水銀の0ミリメートルに圧力を設定し、1秒あたり水銀の1.5ミリメートルに勾配を設定します。20秒のホールド期間で圧力をゼロミリメートルの水銀に戻す前に、水銀のゼロミリメートルから最大圧力まで圧力を上げます。その後、システムを停止してデータを保存する前に、5 サイクルのテストを繰り返します。最大圧力の1/3とアンロードされた圧力の力長テストでは、圧力を最大圧力とアンロードされた圧力の1/3に設定し、インビボの長さのマイナス2%にオルガンを調整します。開始をクリックした後、インビボの長さのプラス2%に臓器を伸ばし、毎秒10マイクロメートルの速度でインビボの長さのマイナス2%に戻ります。次に、システムを停止してデータを保存する前に、合計 3 サイクルのテストを繰り返します。最後の試験の後、KRB試験培地を取り出し、カルシウムを含まないKRB培地で臓器を洗浄します。洗浄後、2ミリモルEGTAを補った新鮮なカルシウムフリーKRB溶液で臓器を30分間インキュベートし、処理液を新鮮なカルシウムフリーKRBに置き換えます。基底調試験の完了時に、圧力直径の事前調整のために、開始をクリックし、圧力を水銀の0ミリメートル、推定インビボ長さとしての長さ、および1.5ミリメートルの水銀/秒に勾配に設定します。水銀のゼロミリメートルから最大圧力に圧力を取り、水銀の0ミリメートルに戻るシーケンスを実行し始めます。このプロセスを 5 サイクル繰り返し、30 秒のホールドタイムを設定します。力の長さの予備調整のために、インビボの長さにオルガンを調節し、手動で両方の圧力のためのアンロードされた圧力を入力する。[開始]をクリックし、勾配を水銀の1.5ミリメートル、圧力を最大の1/3に設定します。オルガンをプラス2%まで伸ばし、毎秒10マイクロメートルでマイナス2%のストレッチまで戻り、合計5回サイクルを繰り返します。圧力直径試験では、実験で決定されたインビボ長さのマイナス2%の臓器と水銀の0ミリメートルの圧力で、開始をクリックして水銀のゼロミリメートルから最大圧力まで圧力を上げ、水銀の0ミリメートルに戻ります。水銀のステップのゼロミリメートルを20秒間保持し、サイクルを5回繰り返します。力の長さのテストのために、わずかな圧力に圧力を設定し、インビボの長さのマイナス2%にオルガンを調整します。インビボ長さのプラス2%までオルガンを伸ばし、10マイクロメートル/秒の速度でインビボ長さのマイナス2%に戻します。合計3サイクル後、データを保存し、最大圧力の1/3、最大圧力の2/3、および最大圧力で力長テストを繰り返します。女性の生殖器官の機械的特性の解析を成功させるためには、欠陥を伴わずに膣に子宮の角を出す必要があります。臓器の種類によって、カニューレの大きさは異なります。試験中に臓器が動かないように、そして、処置の間に器官の壁を傷つけることなく、cannulationを行わなければならない。圧力ミオグラフシステムは、機械的検査を受ける臓器の様々な側面を監視するために使用することができ、超音波システムは、基底音の有無にかかわらず、アンロード状態の臓器の厚さを測定するために使用することができます。機械的試験の後、接線弾性率は、周方向および軸方向について計算され得る。基礎音調試験と受動的検査の両方が、平滑筋細胞の収縮寄与の有無にかかわらず生殖管の主要な機械的特性をもたらす。子宮頸部と膣が生体内で異なる負荷を経験するので、器官間のスケーリングはプロトコルにいくつかの調整を必要とする。平滑筋細胞の生存率を維持するために迅速に解剖を行うことが重要ですが、所望の器官を穿刺しないように注意してください。臓器の残存歪みを測定する開口角度実験は、機械的検査手順の後、ならびに様々な組織学的および生化学的アッセイの後に行うことができる。平滑筋細胞の基底寄与の開発および調査の後、この技術はまた、生理学的に関連する負荷の下で生殖器系の平滑筋最大収縮反応を評価することを可能にする。

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