Name: ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶ ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学法。感度と特異性に優れたこの手法は、組織形態と関連して抗原を局在化し、狂犬病診断において重要な情報を提供します。

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私たちは、疾病管理予防センターへのサンプル提出のために公衆衛生部門を持つ研究所、疫学者、および関連会社に感謝します。この報告書の調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも疾病管理予防センターの公式の立場を表すものではありません。商品名と商業ソースの使用は識別のためだけであり、疾病管理予防センターによる承認を意味するものではありません。

IHCプロトコルはホルマリン固定組織で実施されたが、RABVが存在する場合は不活性化するが、適切なバイオセーフティプロトコルに適切に従うべきである。すべてのバイオセーフティ手順は、適切な個人用保護具(PPE)を着用する、および12に記載されているワクチン接種要件を含む、微生物学および生物医学研究所(BMBL)第5版(https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm)におけるバイオセーフティに記載されている。さらに、有害化学物質(ホルマリン、AEC、キシレンなど)の適切な封じ込めと取り扱いが続く必要があります(例えば、ヒュームフード)。
1. 組織のホルマリン固定
<ol><li>壊死13 の後に採取した3〜5mmの脳組織を10%リン酸緩衝ホルマリン溶液(1:20〜1:50組織/ホルマリン比)に24〜72時間置く。 注意:ホルマリンは有毒な固定剤です。</li>
	<li>おおよその組織重量(サイズ)、組織タイプ(脳領域)およびホルマリンの体積を記録する。研究所は、固定時間に記録を文書化し、維持することが重要です。</li>
	<li>ホルマリン固定後および処理前に組織貯蔵を長くするために、70%エタノールに組織を入れる。</li>
</ol>2. 組織処理
<ol><li>標本固定に続いて、例えば、脳幹の断面、小脳(3つのローブ)、または海馬(両海馬)がそれぞれ3〜5mmの厚さをカットし、処理カセットに入れられる重要な脳領域を含むように組織を解剖する。</li>
	<li>パラフィンワックス浸潤のための組織カセットを処理し、パラフィンブロックに埋め込み、ミクロトーム上で(3〜6μm)切断します。</li>
</ol>3. 材料の調製/染色料理
<ol><li>図1 に示すように、染色皿14 (材料表) を設定します。各皿に250mLの溶液を充填します。</li>
	<li>3-アミノ-9-エチルカルビゾール(AEC)基質ストック溶液の調製<ol>
<li>3-アミノ9-エチルカルバゾール(AEC)の1つの20mg錠剤を5mLのN,Nに溶解し、ガラスピペットを用いてジメチルホルムアミドを溶解する。 注意:AECは発がん性物質です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロテアーゼの調製(例えば、プロナーゼ)のストック溶液を抗原検索用<ol>
<li>プロテアーゼの7mgを200mLのPBSに溶解する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>リンスバッファー PBS-T の調製<ol>
<li>PBSの10 mLを80~990mL加えます。均質な溶液を形成するためによくそれを混ぜる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 脱パラフィンと組織の再水和
<ol><li>ミクロトームを使用して5μmのパラフィンセクションを作り、38°Cの水浴に浮かべ、ガラススライドに集めます。試薬耐性ペン/マーカーでスライドにラベルを付けます。</li>
	<li>スライドをトレイに置き、55〜60°Cのオーブンで1時間溶かします。ウイルス抗原を破壊する可能性がありますので、60°C以上の温度を上げないでください。</li>
	<li>オーブンからスライドを取り出し、皿1、2および3の中で5分の3連続キシレンリンスですぐに脱パラフィン化する。</li>
	<li>脱イオン水へのエタノールの希釈を減少させる順次浸漬によってスライド上のセクションを水分補給:(4〜11はディップリンスである)皿4:キシレン/100%エタノール(1:1);皿5:100%エタノール;皿6:100%エタノール;皿7:95%エタノール;皿8:95%エタノール;皿9:80%エタノール;皿10:70%エタノール;皿11:脱イオン水(図1.ディッシュセットアップ)。 注意:キシレンは有害な化学物質であり、作業はヒュームフードで行われるべきです。</li>
</ol>5. タンパク質分解抗原の検索
<ol><li>皿12の蛋白分解抗原の検索のために30分間プロテアーゼ(PBSの2.5 μg/mL)でスライドを扱う。</li>
	<li>その後、PBS-Tで10分間洗いすみます(皿13)。</li>
	<li>過酸化水素3%を10分間お取りします(皿14)。</li>
	<li>再度、PBS-Tで10分間洗います(皿15)。</li>
</ol>6. 染色手順
<ol><li>残りのスライドをバッファに取り付けたままにして、スライドを一度に1つずつ取り扱います(スライドホルダ全体を取り外さない - スライドを濡らしてください)。1つのスライドを取り除き、組織セクションの周りから余分なバッファ(ペーパータオルを使用して)を消し、組織セクションを邪魔しないように注意してください。湿らせたペーパータオルを置くことによって作られた湿度室で滑り、通常のヤギの血清(ブロッキング)を15分間室温でラボベンチトップ14 にインキュベートします。</li>
	<li>最適な事前決定希釈原発性抗狂犬病抗体(マウス抗狂犬病血清の1:250希釈、未発表)および陰性対照抗体を上記と同じ室温(ステップ6.1)でインキュベートし、その間に洗剤を行いません。</li>
	<li>60分後にPBS-Tで10分間洗います(皿16)。</li>
	<li>室温で15分間の湿度室内でビオチン化抗体(種特異的)をインキュベートする(工程6.1と同様の取り扱い)。</li>
	<li>PBS-Tで10分間洗浄します(皿16)。</li>
	<li>室温で15分間の湿度室にストレプトアビジン-HRP複合体をインキュベート(6.1と同じ処理)。</li>
	<li>PBS-Tで10分間洗浄します(皿16)。</li>
	<li>ペルオキシダーゼ基質をインキュベートし、アミノエチルカルバゾール(AEC)を、室温で10分間湿度室に入れます。使用する直前に AEC を作成します。これを行うには、0.1Mアセテートバッファー、pH 5.2の14 mLにAECストック溶液の1 mLを追加します。3%H2O2の0.15 mLを追加します。使用直前に混合液をフィルターします(0.45 μm フィルター)。 注:AECの動作ソリューションは2-3時間だけ安定しています。AECストックソリューションは、冷蔵庫に長期間保存することができます。</li>
	<li>脱イオン水で洗浄 10分 (皿 17)</li>
	<li>ジルのヘマトキシリンでカウンターを1:2希釈し、2分間脱イオン水(皿18)を用いた。</li>
	<li>脱イオン水ディップリンス(皿19と20)で過剰なヘマトキシリンを洗い流す。</li>
	<li>スコットの水道水30s(ブルーイング溶液)皿21で洗い流す。</li>
	<li>脱イオン水で洗浄 10分 (皿 22)</li>
	<li>スライドを一度に1つずつ取り外す - 水溶性取り付け媒体で取り付けます。</li>
	<li>軽い顕微鏡のスライドを読む。</li>
</ol>

<ol><li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+rabies%3A+current+conundrums%2C+concerns%2C+contradictions+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184(2017).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li>
<li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus%3A+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li>
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<li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li>
<li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+direct%2C+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li>
<li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li>
<li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+five+year+%281985-1989%29+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Pathology%22%5BJournal%5D)">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li>
<li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Zentralblatt+fur+Veterinarmedizin+Reihe+B%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li>
<li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+rabies+prevention--United+States%2C+2008%3A+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Reports+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. 1, 5th ed, 67-72 (2018).</li>
<li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diagnostic+procedures+for+antigen+detection%22">Diagnostic procedures for antigen detection</a>. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).</li>
<li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

症状の発症後の狂犬病の死亡率が高いため、RABV感染の疑いのある動物の診断は、適切な暴露後予防治療にとって極めて重要です。狂犬病の診断は、主にDFA、DRIT、および新鮮な組織または凍結組織を使用したPCRベースの技術に依存します。ホルマリン固定組織の検査では、IHC試験はRABV抗原の敏感かつ特異的な検出のための代替方法を提供します。ホルマリンに固定された組織は、架橋のような側鎖の改変によりタンパク質が安定化する一方、サンプルは抗原検出前に処理する必要がある。このプロトコルでは、エピトープをプロテアーゼによる部分タンパク質分解消化(例えばプロナーゼ)を介して回収し、RNP複合体への一次抗体の結合を可能にした。Nタンパク質に対して反応性mAbsはDFAおよびDRITにおいて主に依存しているが、Nタンパク質上の複数のエピトープに対して反応性を持つpAbsはIHC試験に好まれるであろう。さらに、反応性またはpAbsは、mAbsと比較して、異なるRABV変異体に対して、および非狂犬病リサウイルスに対して広くすることができる。
IHCテストの主な制限の1つは、プロトコルがいくつかの連続した...

狂犬病は、リサウイルス属に属するRNAウイルスの負の感覚によって引き起こされる急性進行性脳炎である。狂犬病ウイルス(RABV)による感染によって生じた全人類の死亡のほぼ99%は、属の型メンバーである、犬2によって伝染する。疑わしい動物の狂犬病診断は、脳組織3におけるゲノムRNA(リボヌクレオタンパク質複合体、RNP)と複合体中の抗原(主にウイルスコード型核タンパク質、Nタンパク質)の検出に依存する。直接蛍光抗体(DFA)検査による抗原検出は狂犬病診断4のゴールドスタンダードと考えられている。この方法は、新鮮または新鮮な凍結脳材料を利用して、スライド上のタッチ印象、アセトンでの固定、モノクローナルまたはポリクローナル抗体(mAbs/pAbs)と蛍光顕微鏡法5で読み取られる市販の蛍光イソチオシアネート(FITC)を用いて染色する。DFA試験は、新鮮な脳組織における狂犬病抗原検出に対して、迅速、感受性、および特異的である。最近、直接迅速な免疫構造化学検査(DRIT)、修飾免疫体化学(IHC)技術は、DFAと同様の感受性を示すことが実証されたが、可視化6のための光顕微鏡の利点を提供する。DRITで使用される検出方法は、IHCに似ていますが、最初のステップでは、新鮮な組織または凍結した組織を利用して、ホルマリンに固定されたサンプルのタッチインプレッションを生成します。
IHCは、パラフィンブロックに埋め込まれたホルマリン固定組織において、特定の抗体を用いて組織学的変化とタンパク質の検出を決定するために広く使用されている技術です。IHCは、組織切片7における狂犬病抗原検出のための確立された代替試験である。IHCは狂犬病の負担を決定するために神経疾患を呈した遡及症例の診断のために特に利用されてきた。パラフィン埋め込まれたホルマリン固定組織は、周囲温度9で保存した数年後でも検出のためにタンパク質を保存する。ホルマリン処理はアミノ酸側鎖を架橋および改変することによってタンパク質を修飾し、エピトープが抗体10に対して反応しなくなる可能性がある。狂犬病抗原検出のためのIHC検査にはmAbsまたはpAbsのいずれかが含まれるが、後者は複数のエピトープおよび発散性リサウイルスが11を検出できるとして有利である。
IHCに関与する標準的なステップは、組織のホルマリン固定、パラフィンブロックへの埋め込み、組織の切開、脱パラフィン化と水和、エピトープ回収、一次および二次抗体に対する反応性、および発色基質を用いた開発である。この原稿は狂犬病診断の議定書の詳細な説明を記述する。狂犬病抗原検出のために、米国疾病管理予防センター(CDC)アトランタ(ジョージア州)で発生したRABV(pAbs)で免疫されたマウス血清を、ビオチン化抗マウス二次抗体と組み合わせて利用する。ビオチン化腹筋は、ストレプトアビジン・ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合体の添加によって検出され、続いてアミノエチルカルバゾール基質を用いた色の発達が続く。

<table><tbody><tr><td>3% 過酸化水素</td><td>Pharamacy ブランド</td><td></td><td>既製 3% H2O2</td></tr><tr><td>3-アミノ-9-エチルカルバゾール (AEC)</td><td>ミリポア シグマ</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>アセテート緩衝液 pH 5.2</td><td>Poly Scientific R&Dコーポレーション</td><td>s140</td><td></td></tr>緩<tr><td>衝ホルマリン10%リン酸緩衝フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>SF100-4</td><td>認定</td></tr><tr><td>カバースリップコーニング</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-553-471</td><td>24 X 50 mm</td></tr><tr><td>エタノール190プルーフ</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>エタノール200プルーフ</td><td>Pharmco-AAPER</td><td></td> 111000200<td></td></tr><tr><td>ギルのヘマトキシリン製剤#2</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>HistoMark ビオチン-ストレプトアビジンペルオキシダーゼキット</td><td>セラケア</td><td>71-00-18</td><td>マウス一次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmunoHistoMount</td><td>Millipore Sigma</td><td>i1161</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>N,N, ジメチルホルムアミド GR</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>RR14440.01</td><td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 対物</td><td>レンズ Multiple vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective</td><td>Multiple vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore Sigma</td><td>53702</td><td>Protease, Streptomyces griseus</em</td></tr><tr><td>>Scott's Tap Water&nbsp;</td><td>ポリサイエンティフィックR&Dコーポレーション</td><td>s1887</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek スライドステインセット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-80&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Histological Grade</td></tr><tr><td>Zeiss Axioplan 2 イメージング - 顕微鏡</td><td>複数のベンダー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

狂犬病の主要な診断モダリティの1つは、感染した組織サンプル中のウイルス性リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体(抗原)の検出である。直接蛍光抗体(DFA)試験または直接迅速な免疫組織化学検査(DRIT)は、抗原検出のために最も一般的に利用されるが、両方のテストは、抗体を使用して抗原検出前のスライド上の印象のために新鮮な組織および/または凍結組織を必要とする。サンプルをホルマリンで収集して固定する場合、いずれの試験も抗原検出に最適ではないが、パラフィンブロックおよび切除に埋め込んだ後に、通常の免疫検査(IHC)によって試験を行うことができる。このIHC法により、組織は抗狂犬病抗体で染色され、切片は脱パラフィン化され、抗原は部分タンパク質分解または他の方法によって取り出され、一次および二次抗体と共にインキュベートされる。抗原は、ホサビペルオキシダーゼ/アミノエチルカルバゾールを用いて染色され、光顕微鏡を用いた可視化のためにヘマトキシリンでカウンター染色される。特異的抗原検出に加えて、ホルマリン固定は、組織学的変化の決定、標本の貯蔵および輸送のための緩和された状態(周囲温度下)、遡及症例をテストする能力、および感染性物質の不活性化による生物学的安全性の向上などの他の利点を提供する。

図2 は、テストされた異なる脳組織における陽性および陰性対照サンプルの代表的なIHC染色結果を示す。 図2A,D,G は200xで陽性サンプルを表し、 図2B、E、H はそれぞれ400倍の倍率に相当します。 図 2A-C は 脳幹に対応します。 図2D-F は小脳細胞とプルキンイェ細胞に対応している。 そして図2G-Iは 海馬に対応している。 図2C,F,I ...

ここでは、ホルマリン固定組織の代替診断試験として狂犬病ウイルス抗原の検出のための免疫組織化学試験プロトコルを紹介する。

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

免疫組織化学および診断組織病理学に使用される組織は、10%リン酸緩衝液ホルマリンに日常的に固定されている。ホルマリンで固定された脳組織における狂犬病ウイルス抗原の検出は、独特の課題を提示し、IHC試験は狂犬病ウイルス抗原検出のための敏感かつ特異的な方法であることが判明した。生検または他の検出方法の主な利点は、抗原が組織および細胞形態に関連して検出できることである。IHCでは、脳内および非脳組織における狂犬病抗原の局在化により、定期的なヘマトキシリンおよびエオシン染色片を介して得ることができなかった追加情報を提供する。狂犬病診断検査は、狂犬病ウイルスに曝露されたヒトにおける曝露後予防の開始に重要である。IHCは、ホルマリン固定組織に関する最も一般的に行われるアッセイの1つです。特異的抗体を用いて、それぞれの病原体の検出に使用することができる。この手順を開始するには、壊死後に採取した3〜5ミリメートルの脳組織を、24〜72時間10%緩衝ホルマリン溶液に入れる。おおよその組織重量、組織タイプ、ホルマリンの体積を記録する。ホルマリン固定後および処理前に、より長い組織貯蔵のために組織を70%エタノールに入れる。標本の固定に続いて、脳幹、小脳、海馬の断面などの重要な脳領域を含むように組織を解剖する。それぞれ、3ミリメートルから5ミリメートルの間の厚さにカットします。組織を処理カセットに入れます。パラフィンワックス浸潤のための組織カセットを処理します。パラフィンブロックに埋め込み、ミクロトームに切り離します。まず、テキストプロトコルの図1に示すように、染色皿を設定します。各皿に250ミリリットルの溶液を充填します。AEC基板ストック溶液を調製するために、ガラスピペットを使用して、1つの20ミリグラム錠剤のAECを5ミリリットルのN、N-ジメチルホルムアミドに溶解させる。プロテアーゼストック溶液を調製するために、プロテアーゼの7ミリグラムをPBSの200ミリリットルに溶解する。リンスバッファーを調製するには、100 ミリリットルの Tween 80 ~ 990 ミリリットルの PBS を加え、よく混合して PBT-T の均質溶液を形成します。ミクロトームを使用して、5マイクロメートルのパラフィンセクションを作ります。38°Cの水浴にセクションをロードし、ガラスのスライドにそれを収集します。試薬耐性ペンでスライドにラベルを付けます。スライドをトレイに置き、オーブンで55~60度で1時間溶かします。その後、スライドをオーブンから取り出し、5分間の3つの連続したキシレンリンスを使用して、すぐにそれらを脱パラフィン化します。この後、テキストプロトコルで概説されているように、脱イオン水へのエタノールの希釈を減少させる順次浸漬によってスライド上のセクションを水分補給します。プロテアーゼで30分間スライドを処理し、タンパク質分解抗原を取り出し、PBS-Tでスライドを10分間リンスし、3%過酸化水素で10分間処理します。その後、PBS-Tでスライドを10分間洗い直します。まず、バッファから1つのスライドを取り外し、一度に1つのスライドのみを処理し、他のスライドは水没したままにし、ペーパータオルを使用して組織セクションの周りから余分なバッファを消します。スライドを湿度チャンバーに入れ、室温で通常のヤギの血清で15分間インキュベートします。次に、最適な所定希釈原発性抗狂犬病抗体と共に湿度チャンバー内のスライドをインキュベートし、陰性対照抗体を、その間に洗剤を全く入れずに室温で60分間培養する。この後、PBS-Tでスライドを10分間洗浄し、室温でビオチン化抗体を用いて湿度チャンバーで15分間インキュベートします。PBS-Tでスライドを10分間洗い直します。スライドと湿度チャンバーをストリップ除細分とHRB錯体を室温で15分間インキュベートし、PBS-Tを10分間洗浄します。次いで、室温で10分間、湿度チャンバ内でAECでインキュベートする。スライドを脱イオン水で10分間洗い、ギルのヘマトキシリンでカウンターステインし、脱イオン水で1~2分希釈します。この後、滑り水を浸して余分なヘマトキシリンをすすぎま。スコットの水道水のスライドを30秒間洗い流し、脱イオン水で10分間洗います。スライドを1つずつ取り出し、水溶性の取り付け媒体で取り付けます。次に、軽い顕微鏡を使用してスライドを読み取ります。本研究では、ホルマリン固定組織の代替診断試験として狂犬病ウイルス抗原の検出に免疫特性化学試験が実証された。脳幹、小脳細胞、プルキンエ細胞、海馬など、異なる脳組織における陽性および陰性対照サンプルの代表的な免疫細胞化学染色結果がここに示されている。マゼンタ赤染色は、AEC基質を用いて青色の対部背景に対して発色を示し、狂犬病抗原に対する抗体の反応性に起因する。免疫組織化学の陽性結果は、組織切片におけるマゼンタ赤染色に相当する。細胞質含有物の染色と様々なサイズの粒状の含み物は、RABV感染に陽性のサンプルを示しています。試料は、ヘマトキシリンによる特定の赤色染色または青色の背景のみが観察されなかった場合に陰性とみなされる。陽性染色に加えて、含包物の分布は、サンプル中の狂犬病抗原のレベルを間接的に定量化することができ、これは組織サンプルのウイルス負荷に対応する可能性がある。分布のレベルに関係なく、任意の特定の染色は、RABV抗原検出のために陽性としてサンプルを分類します。組織はホルマリンで適切に固定し、このプロセス中に組織を凍結しないようにする必要があります。狂犬病抗原はIHCによって検出され、次に、分子技術は、RNA配列情報に基づいてリッサウイルス変異体を決定するパラフィンセクション上で行うことができる。キシレンやホルマリンなどの試薬は、ヒュームフードで取り扱う必要があります。発がん性物質であるため、AECの取り扱い中は注意が必要です。

immunohistochemistry-test-for-lyssavirus-antigen-detection-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）で組み合わせる手法は可視化、マッピングおよび分析、そのウイルスに感染したターゲットへのウイルス特異的CD8 +...

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

このビデオは、感染したマウス脳組織における狂犬病ウイルス抗原検出のための免疫組織化学染色を示しています。このプロセスには、脱パラフィンとアルコール処理が含まれ、その後、抗原のアクセシビリティを強化するためのタンパク質分解処理が行われます。免疫組織化学染色では、赤色の沈殿物が明らかになり、組織切片に狂犬病抗原が存在することが確認されます。...

狂犬病ウイルス抗原検出のための免疫組織化学染色

ここでは、ホルマリン固定、パラフィン包埋ラット中枢神経系(CNS)および末梢リンパ節(LN)組織切片における二重免疫染色のための最適化された詳細なプロトコールを紹介します。...

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。...

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

溶媒除去された器官の究極の3Dイメージングのような新しい、免疫染色互換組織クリアリング技術は、狂犬病ウイルス脳感染症とその複雑な細胞環境の3D可視化を可能にします。厚い、抗体標識された脳組織スライスは、画像深さを高め、共焦点レーザー走査顕微鏡による3D解析を可能にするために光学的に透明に作られています。...

溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

このプロトコルは、台湾のコウモリにおけるリッサウイルス抗原の診断試験のための標準的な実験室操作手順を導入する。...

台湾におけるコウモリ集団のリッサウイルスサーベイランスに関する標準的な手術手順

dsDNAインターカリング色素を用いてこのリアルタイムRT-PCRは、リサウイルス感染の診断に適しています。この方法は、狂犬病から抽出されたRNAから始まり、マンテモーテムまたは死後サンプル、マスターミックス調製、RNA添加、リアルタイムマシンのセットアップ、結果の正しい解釈を詳細に説明します。...

狂犬病診断のためのパンリサウイルスリアルタイムRT-PCR

脳生検サンプリングから最終解釈まで、迅速な免疫クロマトグラフィー診断検査(RIDT)を用いて、現場条件下での動物狂犬病の死後診断のための完全なプロトコルを提示する。また、分子解析やウイルス遺伝子作成用の装置を用いたさらなる応用についても説明する。...

フィールド死後狂犬病は、さらなる分子用途を用いた資源限定設定のための迅速な免疫クロマトグラフィー診断試験

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。...

凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

このプロトコルは、一部の非狂犬病リッサウイルスおよびラゴモルフのアッセイ性能を改善するためのプライマー配列および製剤の更新を含む、組織収集から結果の解釈までの汎リッサウイルスLN34リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)アッセイを実証しています。また、シングルウェルLN34マルチプレックス(LN34M)フォーマットのアッセイセットアップのデモも行います。...

更新されたマルチプレックスLN34リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイによる動物の狂犬病の死後診断

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶ ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学法。感度と特異性に優れたこの手法は、組織形態と関連して抗原を局在化し、狂犬病診断において重要な情報を提供します。

ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験

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