Name: インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 学ぶインビトロ転写mRNAを用いた一次マクロファージの高効率トランスフェクション手法。サイトトキシシティや免疫原性を引き起こさず、高い導入効率を達成し、変異タンパク質やタグ付きタンパク質の発現を可能にする。

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著者たちは何も開示する必要はない。

ここでは、インビトロ転写mRNAを用いた通常はトランスフェクト性の高い一次マクロファージの非常に効率的なトランスフェクションのためのプロトコルを提示する。重要なことに、このプロトコルを用いたマクロファージのトランスフェクションは、細胞死を誘導したり、トランスフェクション試薬もトランスフェクトされたmRNAも非自己として認識されていないことを示す炎症シグナル伝達を活性化しない。
mRNAの品質は、このプロトコルを使用してマクロファージのトランスフェクションを成功させるために重要です。したがって、mRNAがRNA(汚染されたバッファやバイアルを介してなど)と接触しないことを細心の注意を払う必要があります。疑わしい場合は、mRNA分解(例えば、アガロースゲル電気泳動による)をチェックします。トランスフェクション率及び発現量は、トランスフェクション後6時間で既に最大であった。従って、目的のタンパク質は、トランスフェクション後の早期時点での分析に十分なレベルで発現することができる。しかし、私たちはこれをテストしていません。さらに、より大量のmRNAをトランスフェクトすると、トランスフェクショ...

マクロファージは、微生物、アポトーシス細胞、細胞破片の検出、摂取、分解に特化した貪食細胞です。さらに、サイトカインやケモカインを分泌し、T細胞やB細胞に抗原を提示することで免疫応答を調整するのに役立ちます。マクロファージはまた、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、腫瘍形成および肥満のような他の多くのプロセスにおいて重要な役割を果たす。
病原体関連分子パターン(PAMP)や損傷関連分子パターン(DamP)などの場外分子などの非自己分子を検出できるように、マクロファージは、大きなパターン認識受容体(PRR)1を備えている。残念ながら、これはまた、トランスフェクション試薬3およびトランスフェクト核酸4、5、6、7としてトランスフェクト2に特に困難なマクロファージを作り、多くの場合、PrRによって非自己として認識される。このため、化学的または物理的方法8を用いたマクロファージのトランスフェクションは、通常、トランスフェクトされた核酸のマクロファージ活性化および分解、あるいはピロ球症を介したマクロファージ自殺においても、DNAまたは外来RNA9などのサイトソリックPamPs/Dammpの認識後に引き起こされるプログラムされた溶解細胞死の形態をもたらす。アデノウイルスやレンチウイルスなどのウイルスをベクターとして用いたマクロファージの生物学的トランスフェクションは、より効率的であることが多いが、そのようなウイルスベクターの構築には時間がかかり、バイオセーフティレベル2装置10、11を必要とする。
したがって、マクロファージは集中的な研究の対象であるが、分子生物学の最も重要なツールの一つである、発出性発現のための核酸構築物のトランスフェクションにより、分子レベルにおけるその機能の解析が妨げられる。タンパク質は、ほとんど適用できない。これはしばしば、研究者がボナ・フィデス・マクロファージではなくマクロファージ様細胞株を使用することを強制する。核酸構築トランスフェクションのアプリケーションには、変異またはタグ付けされたタンパク質バージョンの発現、特定のタンパク質の過剰発現、それぞれのノックアウトバックグラウンドでのタンパク質再発現および他の種からのタンパク質の発現(例えば.、クレリコンゲナーゼまたはガイドRNAおよびCas9を標的遺伝子ノックアウト用)。
ここでは、プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いたマウス腹蓋マクロファージ(PM)および骨髄由来マクロファージ(BMDM)である一次マクロファージの非常に効率的なトランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。重要なことに、このプロトコルを用いて生成されたインビトロ転写mRNAには、免疫原性を低下させ、安定性を高める天然の修飾ヌクレオシド5-メチル-CTPおよび擬似UTPが含まれており、安定性を高める4、6、7、12、13である。また、インビトロ転写mRNAの5'末端は、RIG-I複合体14、15による認識を防止するために南極ホスファターゼによって脱リン酸化される。これは、インビトロ転写mRNAの自然免疫認識を最小限に抑える。プロトコルを実行しやすいので、トランスフェクション率は50~65%(腹蓋マクロファージ(PM))~85%(BMDM)に達し、重要なことに、細胞傷害性や免疫原性は認められません。(i)トランスフェクション用の免疫学的に沈黙したmRNAが、プラスミドや(ii)トランスフェクション手順そのものなどのDNA構築物からどのように生成できるかを詳しく説明する。

<table><tbody><tr><td>5-メチル-CTP (100 mM)</td><td>Jena Biosience</td><td>NU-1138S</td> は <td>-20 °C で保存されています。C</td></tr><tr><td>南極ホスファターゼ</td><td>ニューイングランド BioLabs</td><td>M0289</td> -<td>20 °C;C</td></tr><tr><td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10x)</td><td>New England BioLabs</td><td>B0289</td> を <td>-20 °C で保存。C</td></tr><tr><td>anti-NEMO/IKK&gamma; 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-41046</td> を <td>-20 °C で保存。C</td></tr><tr><td>抗β-アクチン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td>を<td>-20°Cで保存C</td></tr><tr><td>ペトリ皿 92,16 mm カム付き</td><td>Sarstedt</td><td>821,473</td><td>RT</td></tr><tr><td>CD11b Microbeads マウスとヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-601</td> 4 <td>C</td></tr><tr><td>Cre リコンビナーゼ + T7-プロモーター フォワード プライマー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&acute;、-20°Cで保存;C</td></tr><tr><td>Cre リコンビナーゼ + T7-プロモーター リバース プライマー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&prime;、-20°C;C</td></tr><tr><td>DNA精製キット:QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td>は<td>RT</td></tr><tr><td>eGFP + T7-Promotorフォワードプライ</td><td>マーSigma-Aldrich</td><td></td><td>5&acute;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&acute;で保存、-20°Cで保存されています。C</td></tr><tr><td>eGFP + T7-Promotor リバースプライマー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&acute;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&acute;、-20°Cで保存;C</td></tr><tr><td>Fast Digest buffer (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B64</td> を <td>-20 °C;C</td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td> を <td>-20 °C;</td></tr><tr><td>校正付きCハイフィデリティポリメラーゼ:Q5ハイフィデリティDNA-ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボスインク</td><td>M0491S</td>は<td>-20°Cで保存されています。C</td></tr><tr><td>IKK&beta; + T7-Promotor フォワードプライマー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&prime;, -20 &deg;C</td></tr><tr><td>IKK&beta; + T7-Promotor リバースプライマー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&prime;、-20°Cで保存;C</td></tr><tr><td>In vitro mRNA 転写キット: HiScribe T7 ARCA mRNA キット (polyA テーリング付き)</td><td>New England BioLabs</td><td>E2060</td> は <td>-20 °C で保存されています。C</td></tr><tr><td>LS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>RT</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>RT</td></tr><tr><td>mRNAトランスフェクションバッファーおよび試薬に保管:jetMESSENGER</td><td>Polyplus トランスフェクション</td><td>409-0001DE</td> 4°C<td>;C</td></tr><tr><td>ミュータントIKK&beta;IKK-2S177/181E プラスミド</td><td>Addgene</td><td>11105</td> を <td>-20 °C で保存。C</td></tr><tr><td>変異体 NEMOC54/347A プラスミド</td><td>Addgene</td><td>27268</td> を <td>-20 °C で保存。C</td></tr><tr><td>pEGFP-N3プラスミド</td><td>Addgene</td><td>62043</td>を<td>-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>ポリ(I:C)</td><td>カルビオケム</td><td></td><td>528906-20°Cで保存されます。C</td></tr><tr><td>pPGK-Creプラスミド</td><td></td><td></td><td>F.T.ヴンダーリッヒ、H.ワイルドナー、K.ラジェフスキー、F.エデンホーファー、誘導性Creリコンビナーゼの新しい変異体:Cre-PR融合タンパク質の新規変異体は、感度が向上し、誘導性の範囲が拡大しています。Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001).-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>擬似 UTP (100 mM)</td><td>Jena Biosience</td><td>NU-1139S</td><td>は -20 °C で保管されています。C</td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>RT</td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD11b 抗体、APC 標識</td><td>BioLegend</td><td>101212</td><td>4 °C で保存。C</td></tr><tr><td>ラット抗マウス F4/80 抗体、PE 標識</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td> 4<td>°C で保存。C</td></tr><tr><td>組換え M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td> -<td>20 °C;C</td></tr><tr><td>RNA精製キット:MEGAclear転写クリーンアップキット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td>を<td>4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>RNAse分解界面活性剤:RnaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020</td>を<td>RT</td></tr><tr><td>超高純度LPSで保存 大腸菌O111:B4</td><td>Invivogen</td><td></td>を<td>-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>野生型 IKK&β; プラスミド</td><td>Addgene</td><td>11103</td> は <td>-20 °C で保存されています。C</td></tr><tr><td>野生型 NEMO プラスミド</td><td>Addgene</td><td>27268</td><td>-20 °C;ハ</td></tr></tbody></table>

インビトロ転写mrnaによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化した貪食細胞です。この用に、それらはパターン認識受容体(PRR)の大きな配列を備えている。残念ながら、これはまた、トランスフェクション試薬としてトランスフェクトに特に困難なマクロファージを作り、トランスフェクトされた核酸は、多くの場合、非自己としてPRRによって認識されます。したがって、トランスフェクションは、多くの場合、トランスファージの活性化とトランスフェクション核酸の分解、あるいはマクロファージの自殺をもたらす。ここでは、腹腹マクロファージ(PM)や骨髄由来マクロファージ(BMDM)などのマウス一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルを、プラスミドなどのDNAテンプレートから転写したmRNAを用いて説明する。この単純なプロトコルを使用すると、PMのトランスフェクション率は約50〜65%、BMDMのトランスフェクション率は、細胞傷害性または免疫原性が観察されずに達成される。プラスミドなどのDNA構築物からのトランスフェクションのためのmRNAの生成とトランスフェクション手順について詳しく説明する。

このプロトコルを使用して、FLAG タグ付き NEMO および IKKβ バリアントの mRNA エンコーディングを生成し、一次マクロファージ16をトランスフェクションしました。FLAG タグ付きワイルドタイプ (NEMOWT)および C54/347A 変異型 NEMO (NEMOC54/374A)のプラスミドエンコーディング (材料表を参照) には、正しい向きの T7 プロモータが既に含まれています (図 1A)。したがって、インビトロ転写のためのDNAテンプレートを生成するためにプラスミドを線形化するだけでした。この端に、プラスミドDNAの10μgを5μL Xbalで消化し、ストップコドンの単一カット3'によるプラスミドの線形化をもたらした。プラスミドDNAの完全な線形化をアガロースゲル電気泳動により検証した(...

マクロファージ、特に一次マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化しているため、トランスフェクトに挑戦しています。プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いた一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

電子チャイミング マクロファージは非自己起源の分子を検出することに特化しているため、特にトランスフェクトが困難です。プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いて、一次マクロファージのトランスフェクションを高効率に行えるプロトコルについて説明する。我々の方法の主な利点は、高いトランスフェクション率が検出可能な細胞毒性または免疫原性の不在で達成されるということです。手順を実証することは、私の研究室からのポスドクであるマーク・ハーブになります。まず、RNA転写キットのすべての成分を解凍します。試薬を5秒間ボルテックスし、2,000回gで2秒間回転させ、使用するまで氷の上に置きます。原稿の指示に従って0.5マイクロ遠心チューブでインビトロRNA転写反応を準備します。チューブを渦し、それを回転させます。その後、サーマルミキサーで400rpmで混合しながら、30分間摂氏37度でインキュベートします。インキュベーション後、DNase Iの2マイクロリットルを直接反応ミックスに加えます。ボルテックスを回転させ、チューブを下に回転させ、サーマルミキサーでさらに15分間インキュベートします。コントロールジェル用のDNA処理製品の2マイクロリットルのアリコートを予約し、マイナス80°Cで保存します。ポリAテーリングの場合、10Xポリポリメラーゼ反応バッファーの5マイクロリットルとポリAポリメラーゼの5マイクロリットルをDNA処理反応に加えます。渦とミックスをスピンダウン。その後、サーマルミキサーで30分間インキュベートします。反応が完了したら、コントロールジェルに2マイクロリットルのアリコートを取り、マイナス80°Cで保存します。5素分脱リン酸化試薬を原稿の指示に従ってポリA尾製品に直接加えます。ボルテックスをスピンダウンし、さらに30分間サーマルミキサーでインキュベートします。南極ホスファターゼを不活性化するために、80°Cで2分間のインキュベーションで脱リン酸化反応に従ってください。次に、専用のRNA精製キットを使用して、インビトロ転写mRNAを精製します。マイクロボリューム分光光度計で溶出したmRNAの濃度と純度を測定します。以前に収集したアリコートを使用して変性アガロースゲルを実行し、単一の製品、正しい転写長、およびポリAテーリングの存在を確認します。mRNA トランスフェクション バッファーの事前に計算された量から mRNA トランスフェクション試薬の量を差し引いた量と mRNA を反応チューブに加えてトランスフェクションの準備をします。mRNAストックを解凍し、チューブを反転して穏やかに混ぜます。次に、事前に計算されたmRNAの体積を反応管に加えます。ボルテックスとmRNAトランスフェクション試薬との反応ミックスをスピンダウンし、次いでmRNAトランスフェクション試薬の適切な量を反応ミックスチューブに加える。チューブを渦し、それを回転させます。その後、室温で15分間インキュベートします。一方、マクロファージの培養培地を新鮮な温かい培地に置き換える。トランスフェクションミックスのインキュベーションが完了したら、マクロファージを含むプレートウェルにミックスを加え、外側から井戸の真ん中まで円で入れ加えます。トランスフェクションミックスの均一な分布を確保するために、プレートを垂直方向および水平方向にそっと揺らします。その後、プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%を少なくとも6時間インキュベートします。インキュベーション後、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、またはイムノブロットでトランスフェクション効率を分析します。この手順の最も重要な部分は、すべてのマクロファージが同じ量のmRNAと接触するようにトランスフェクションミックスの均一な分布を確保することです。このプロトコルは、一次マクロファージのトランスフェクションのためのFLAGタグ付きNEMOおよびIKK-β変異体をコードするmRNAを生成するために正常に使用されました。mRNAの正しいサイズおよびポリAテーリングはアガロースゲル電気泳動によって検証された。GFPをコードするmRNAを生成し、フローサイトメトリー解析を行うことでトランスフェクション効率を確認した。トランスフェクション速度はトランスフェクションmRNAの量とともに増加し、PMでは50~65%、BMDMでは80~85%に達した。PMおよびBMDMの両方において、トランスフェクトされた細胞におけるEGFPの発現レベルは、時間および用量依存的に増加した。重要なことに、ヨウ化プロピジウム陽性またはアネキシンV陽性マクロファージの分析は、トランスフェクション手順が溶菌またはアポトーシス細胞死を誘発していないことを確認した。FLAGタグ付きニモまたはIKK-β変異体をコードするmRNAのトランスフェクション効率を免疫蛍光顕微鏡で分析した。ニモmRNAの割合は約60%、IKK-βmRNAでは55%であった。このプロトコルは、CreリコンビナーゼをコードするmRNAを生成するためにも使用された。400ナノグラムのCreリコンビナーゼmRNAを用いた400,000 BMDMのトランスフェクションは、48時間後にニモタンパク質のほぼ完全な枯渇をもたらし、非常に効率的なトランスフェクションを示した。インターロイキン1ベータ、インターロイキン-6および腫瘍壊死因子の検出可能な量の不在は、トランスフェクション手順が炎症促進シグナルを活性化しないことを示す。我々の比較的単純な方法により、最終的に原発マクロファージで変異タンパク質またはタグ付きタンパク質を効率的に発現させることができます。これにより、分子レベルでマクロファージ機能の解析が実質的に進んでいくだろう。

highly-efficient-transfection-primary-macrophages-with-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、細胞の成熟を引き起こすことなく、プラスミドDNAやsiRNAのどちらかで初代ヒト単球由来樹状細胞をトランスフェクトの効率的な方法として私たちの最適化されたハイスループットnucleofectionのプロトコルを提示する。我々はさらなる標的遺伝子のmRNAとタンパク質レベルの両方におけるRIG -...

細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

このビデオでは、緑色蛍光タンパク質をコードする修飾mRNAを初代マクロファージにトランスフェクションするプロセスを示しています。これらの修飾mRNAは、免疫原性を低下させ、その安定性を向上させるように設計されており、トランスフェクションの成功とその後の緑色蛍光タンパク質の発現を確実にし、これは蛍光顕微鏡法によって確認されます。...

修飾mRNAによる初代マクロファージのトランスフェクション

このプロトコルでは、Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle...

マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

このプロトコルは、高い細胞活力と分化と偏光のための完全なマクロファージの容量を維持しつつ、高いトランスフェクション効率でエレクトロポレーションによってsiRNAまたはプラスミドDNAを用いたヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクションするための効率的で信頼性の高い手法を提案する。...

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

マクロファージ細胞株RAW264.7へのトランスフェクションは、異物に対する細胞の自然な反応のために困難です。ここでは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をRAW264.7細胞にトランスフェクションするための穏やかでありながら堅牢な手順について説明しました。...

ルシフェラーゼレポーター遺伝子でRAW264.7細胞をトランスフェクト

この記事では骨髄での蛍光融合蛋白質の表現のための詳しいプロトコル由来樹状細胞とマクロファージを提供します。手法は骨髄の伝達レトロ ウイルス構造続いてマクロファージへの分化と樹状に前駆細胞の in...

マウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージの蛍光融合タンパク質の発現

ここでカチオン性 nanoliposomes、ドライ フィルム法に基づいており、安全のため使用することができますの生成のためのプロトコルについて述べるし、体外の効率的な配信は、メッセンジャー RNA...

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

ポリエチレンイミン (PEI) を使用しての方法を述べる-siRNA 株マクロファージの超常磁性酸化鉄ナノ粒子をコーティングします。これらのナノ粒子は効率的に大食細胞の体外および体内と沈黙のターゲット遺伝子の発現を siRNA...

小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo

ここでは、HIVに感染した個体および健全なコントロールからヒト一次単球を分離、培養、トランスフェクション、および区別するための最適化されたプロトコルです。...

原発性ヒト単球の単離、トランスフェクション、培養

私たちは、レンチウイルスベクターを使用して、 in vivoで腹膜組織に常在するマクロファージの遺伝子機能を調べるための段階的なプロトコルを示します。...

マウスにおける腹腔組織常在マクロ ファージの 効率的な遺伝子およびマイクロRNA調節のためのレンチウイルスベクター調製

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

学ぶインビトロ転写mRNAを用いた一次マクロファージの高効率トランスフェクション手法。サイトトキシシティや免疫原性を引き起こさず、高い導入効率を達成し、変異タンパク質やタグ付きタンパク質の発現を可能にする。

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

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