Name: 70%部分肝切除術とアセトアミノフェンを組み合わせた急性肝不全ラットモデルの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶ急性肝不全ラットモデルの作製法。70%部分肝切除術とアセトアミノフェン投与を組み合わせた再現性の高い肝障害誘導法で、治療介入の効果評価に適した時間枠を提供し、新規治療法開発に貢献します。

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この研究は、インド政府バイオテクノロジー省からニューデリー国立免疫学研究所に寄せられたコア補助金によって支援されました。

以下に説明する手順は、ニューデリー国立免疫学会の動物倫理委員会によって承認されています。承認のシリアル参照番号は IAEC#355/14 です。
1. 準備
<ol><li>Das B et al.26によって前述したように外科的処置の準備をする。</li>
	<li>体重が200~250gの6~8週齢の近親交配ウィスターラットを使用します。</li>
	<li>標準的な動物のケア条件の下で動物を収容し、手順の前後にラットチョウと性欲でそれらを養います。</li>
	<li>70%PHxを行う場合は、腹腔内注射されるケタミン塩酸塩(体重100mg/kg)とキシラジン(体重10mg/kg)の標準的なカクテルミックスを使用してください。 注:使用される麻酔薬の種類は、死亡率および罹患率に術後効果を有し得る。</li>
	<li>細胞移植の間、吸入麻酔イソフルラン(2-クロロ-2-(ジフルオロメトキシ)-1,1,1,1-トリフルオロエタン)を使用して、移植手術後の動物の回復時間を短縮する。</li>
	<li>カスタマイズされた麻酔システムを使用して吸入麻酔を誘発し、維持する。酸素の流れを4L/分に保つ。誘導使用のために4%でイソフルラン、および手術の間に2-3%の維持使用のために。</li>
</ol>2. 術前手順
<ol><li>ステップ3.1で説明したケタミン-キシラジン混合物を腹腔内に注入してラットを麻酔する。動物のつま先をつまんで完全な麻酔を確認します。さらなる手順は、ペダル反射がない場合にのみ行われます。</li>
	<li>角膜乾燥を防ぐために、両方の眼にカルボキシメチルセルロースベースの眼滴を塗布する。</li>
	<li>白いテープを使用して麻酔された動物を外科用板に拘束する。腹部を上に向けて動物を置き、手術を行う人から口が遠位側にあることを確認する。</li>
	<li>電気バリカンを使用して、右上腹部の手術場から髪を取り除きます。</li>
	<li>ポビドネヨウ素の3つの交互のスクラブと70%エタノールを円形運動で殺菌された綿パッドを使用して手術部位を消毒する。</li>
</ol>3. 肝肝切除術(PHx)を肝切除し、肝臓の質量の70%を除去する
メモ:層流フード内の滅菌環境下で外科的処置全体を実行します。手術後の感染リスクを最小限に抑えるために、無菌の手術器具のみを使用してください。肝臓量の70%の除去は、70%部分肝切除術(70%PHx)と名付けられ、C.ミッチェルおよびH.ウィレンブリング、200827によって記載されているように行われた。
<ol><li>手術を開始する前に、そのつま先をつまむことによって動物の完全な麻酔を確認します。さらなる手順は、ペダル反射がない場合にのみ行われます。</li>
	<li>胸骨のすぐ下で切断し、xiphoidに垂直で、胸部に平行に切断する皮膚をマークします。</li>
	<li>マークされた皮膚の上に約3cm x 1cmの開口部を有する滅菌ドレープシートを置きます。</li>
	<li>メスでマークされたラインに沿って約2〜3cmの横方向の切開を行います。外科用ブレード22番を使用してください。無菌の湿った綿の先端を使用して、切開領域付近の下層に皮膚の付着を穏やかに取り除きます。</li>
	<li>次に、xiphoidプロセスのすぐ下にある腹膜層を通して横切開を行います。</li>
	<li>2つの生理線湿った綿の先端の助けを借りて、胸部に穏やかな圧力を加えることによって肝臓の左葉を露出させる。切開部の横隔膜領域に綿の先端を1つ置き、もう一方の綿の先端を切開領域の下に置き、肝臓の葉を持ち上げます。</li>
	<li>露出した肝臓の葉の周りに8〜10cmの長い滅菌ナイロン糸ループ(サイズ4-0、0.15 mmの直径)を滑ります。マイクロディセプ鉗子や湿った綿の芽の助けを借りて、ヒラムに近いローブのベースにループを取ります。</li>
	<li>マイクロサージャリー針ホルダーとマイクロフォースプスの助けを借りて、ループの両端を結び、結び目を可能な限りローブの基部に近づけるので、血管を収縮させ、肝葉を取り除いた後の出血を減らします。反対側に2つの追加の結び目を結びます。</li>
	<li>近くの血管に近すぎて結び目を結びすぎないように注意してください。</li>
	<li>マイクロサージャリーハサミを使用して結ばれたローブを結んだローブを結び目のすぐ上に切断し、ローブの代わりに虚血性切り株と呼ばれる組織の変色した塊を残します。 注:ラット肝臓は、マウスと同様に、中央葉、右横葉、左横葉、および全肝臓質量の約40%、20%、30%、および7%を表すコーデートローブの4つの異なる葉に分かれています。これらの葉の任意の組み合わせは、70%の肝臓の質量を切除するために除去することができます。現在の研究では、中央値ローブと左横葉が除去された。</li>
	<li>左横葉の残りの切り株を損傷することなく、慎重に中央値ローブを見つけます。腹腔からそっと引き出し、ローブの基部で8〜10cmの長いナイロン糸(サイズ4-0)の結び目を結びます。反対側に2つの追加の結び目を結びます。慎重に物品を取り除き、記載されているすべての予防措置を取って結ばれた中央値ローブを取り除く。</li>
	<li>ローブを取り除いた後、吸収性の高いクロミック4~0の縫合糸を使用して腹腹を縫合し、続いて皮膚を中断した縫合を行います。</li>
	<li>感染を防ぐために縫合糸を取り囲む皮膚にポビドンヨウ素を塗布する。</li>
	<li>ドレープシートを取り外し、手術板から動物を取り除きます。</li>
</ol>4. 動物の術後ケア
<ol><li>腹腔内は、術後感染のリスクからそれを保護するために、1 mLの注射器で5%グルコース溶液の1 mLで12 mgのセフォタキシム抗生物質の用量で動物を注射する。</li>
	<li>手術後の痛みの軽減のために鎮痛性メロキシカム(体重1mg/kg)の皮下注射を投与し、さらに2回の用量でフォローアップし、レジメンを1日1回の投与量として維持する。</li>
	<li>12時間の光/暗いサイクルの標準条件の下で操作された動物を収容し、定期的に監視します。</li>
</ol>5. 肝不全を誘発する部分的にヘパトクトム化動物における薬物の注射
<ol><li>24時間手術後、動物が70%PHxから正常に回復したら、その後注射を行う動物の体重を測定する。</li>
	<li>APAPの体重750mg/kgを、手術から正常に回復した動物の70%PHxの後に24時間、部分的に肝切除動物に腹腔内に注入する。24時間後に再度用量を繰り返す。 注:APAPの2回の用量は、動物に腹腔内に投与される(すなわち、24時間および48時間はそれぞれ70%PHx手順をポストする)。</li>
	<li>APAPの注入後の各時点で、回収動物の体重を測定する。 注:APAP(ビオセタモール)は、2%ベンジルアルコール中の150mg/mL溶液として動物に注入される。</li>
</ol>6. ALF動物モデルにおける健康肝細胞の移植
注:ラットにおけるALFの可逆性を研究するために、APAPの1st用量と共にALF誘導動物に正常な同系ラット肝細胞を移植する。現在の研究では、ホーミングおよび生着のために移植された細胞に十分な時間を提供するために、移植はAPAPの1st用量を与えた直後に行われた。ラット肝細胞は、ベリーとフレンズら28によって最初に公開されたプロトコルによって単離され、その後、いくつかの改変を伴う様々な他の研究29、30、31に適応される。ALF動物モデルにおける細胞の脾臓内移植については、以下に示す手順に従う。
<ol><li>ラットを250~350gのラットに対して4%のイソフルランと4 L/min酸素流量の麻酔誘導用のポリ(メチルメタクリレート)チャンバーに入れます。動物のつま先をつまむとき、ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認してください。</li>
	<li>麻酔されたラットを外科用板の上に置き、左側の部分が上を向いている。適切なマウスピースを介して2〜3%のアイソフルラン吸入で麻酔を維持する。</li>
	<li>左の側面領域の皮膚を剃り、ポビドンヨウ素溶液によって殺菌します。</li>
	<li>皮膚の剃った領域に横方向の切開を行います。</li>
	<li>腹膜層で1~2cmのカットを行い、脾臓を露出させる。</li>
	<li>腹膜腔の脾臓を穏やかに取り出し、2つの湿った綿の先端の助けを借りてそれを持ち上げます。</li>
	<li>移植される細胞(通常は動物1匹につき107個)を、29G針で1mLインスリン注射器中の50μL IMDM媒体に懸濁して保管する。</li>
	<li>脾臓皮質に針をそっと突き刺し、細胞懸濁液を2~3分以内に脾臓に放出する。</li>
	<li>細胞移植が完了したら、針を慎重に取り出し、部位からの細胞懸濁液の漏れを避けるために、湿った綿の先端で針穿刺の領域をダブします。</li>
	<li>腹腹と皮膚を4~0の吸収性縫合糸で閉じ、連続および不連続な縫合を行います。</li>
	<li>手術部位の感染を防ぐために縫合糸の場所で皮膚にポビドンヨウ素溶液を塗布する。</li>
	<li>腹腔内注射は、12mg/mLの抗生物質(例えば、セフォタキシム)溶液を注入し、術後ケアの一環として1mg/kg体重を動物に皮下注射する。暖かい回復ケージに動物を移動します。</li>
	<li>手術中の創傷が完全に治癒するまで、12時間の光/暗いサイクルの正常な条件下で手術した動物を隔離しておいてください。これには 3 ~ 4 日かかる場合があります。</li>
</ol>7. ALF開発の特徴付け
<ol><li>APAP治療の2回目の用量後にケタミン-キシラジン溶液2時間の過剰摂取によって動物を安楽死させ、血液および組織サンプルを収集する。</li>
	<li>生化学的研究のために血液から血清を収集する 32.</li>
	<li>組織学的および遺伝子発現研究のための肝臓組織サンプルを処理する 33,34,35.</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ALFのための適切な動物モデルの開発は、病因およびALFの進行のより良い理解のために最も重要である。よく特徴付けられたALF動物モデルはまたALFに対する新しい治療アプローチの開発および試用のための機会を提供する。ALF6,12,21,23,46,47,48の臨床的に関連するモデルを開発する試みが数多く行われています。これらの研究のほとんどは、外科的処置を利用するか、肝毒性化学物質による肝障害を誘発する。
PHxは壊死組織およびアポトーシス組織によって引き起こされる炎症の欠如のためにALFの病理を反映しないので、PHxだけ...

急性肝不全(ALF)は、米国肝疾患研究協会によって、損傷の事前徴候なしに急性肝障害の急速な発症として定義され、肝臓1の合成、代謝、および解毒機能の重度の障害によって特徴付される。ALFは、長期間にわたる肝障害の結果として障害が生じる慢性肝不全と、慢性肝疾患2、3、4の結果として突然の肝障害が起こる急性慢性肝不全(ACLF)とは異なる。ALFの唯一の治療法は、オルソトピック肝臓移植(OLT)であり、または死亡が起こる可能性がある。肝臓ドナーの不足のために、ALFに罹患している患者の死亡率は非常に高いです。
代替治療アプローチの可能性を研究し、ALFの病態生理学をよりよく理解するためには、ヒトで起こっているALFを反映できる動物モデルが必要である。すでに利用可能なALF動物モデルの多くには、いくつかの欠点があります。アセトアミノフェン(APAP)効果は再現が困難ですが、時間的、臨床的、生化学的、および病理学的パラメータの点で最も近い類似点を有する。APAP誘導動物モデルは、APAPおよびその中間体5、6、7によるヘモグロビンの酸化によって引き起こされるメトヘモグロビン血症の存在による問題にしばしば遭遇する。もう一つの問題は、予測不可能な用量応答と死亡時によって反映される再現性の欠如である。四塩化炭素(CCl4)を用いて製造されたALF動物モデルは、再現性が悪い8、9、10、11である。コンカバリンA(Con A)およびリポプリ糖(LPS)誘発ALF動物モデルは、自己免疫性肝疾患に関与する細胞機構の研究および敗血症の研究においてそれぞれ12、13、14、15に有利であるが、ヒト疾患の臨床パターンを反映していない。同様に、チオアセトアミド(TAA)はまた、活性代謝産物チオアセトアミドスルホキシドへの生体変換を必要とし、種変動16、17、18、19を示す。D-ガラクトサミン(D-Gal)は、ALFに類似した生化学的、代謝的、および生理学的変化を生じるが、ALF病理学的状態20、21、22、23全体を反映することができない。より良い方法でALF症候群を反映することができるALFモデルを開発するために、これらの方法の2つ以上を組み合わせる試みはほとんどありませんでした13.したがって、疾患パラメータを反映し、より良い再現性を有し、治療介入の効果を研究するのに十分な時間を提供するモデルを開発するためにさらなる研究が必要である。
現在の研究では、ラットの代替ALFモデルは、肝毒性試薬の部分肝切除術(PHx)と低用量の効果を組み合わせることによって作成されています。APAPは、肝臓の損傷を引き起こす上で確立された役割を持っています5,24,25.これは広く使用されている鎮痛薬であり、有毒な代謝産物を形成することによって、上剤用量で肝臓に有毒です.APAPは先進国で多くの死亡の原因です。部分肝切除術によって引き起こされる身体的傷害は、炎症および肝臓再生に関与する様々なプロセスの活性化を開始する。肝毒性剤APAPの注射は、肝臓に敵対的な環境を引き起こし、肝細胞の増殖を防ぐ。これは、ヘパトトキシンのより小さな用量と組み合わせると、手順のより良い再現性につながる動物のストレス期間を減少させます。そこで、このモデルを用いて、2種類の肝損傷の組み合わせ効果が検討されている。開発されたALF動物モデルを特徴付けるために、生理学的および生化学的パラメータが研究されている。ALFの可逆性の成功は、合成健康ラット肝細胞の移植によって確認された。

<table><tbody><tr><td>アセトアミノフェン(ビオセタモール)</td><td>EG医薬品</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし(現地調達)</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼキット(DEA)</td><td>コーラルクリニカルシステム、インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし(現地調達)</td></tr><tr><td>自動分析装置</td><td>チューリップ、アルトサンタクルス、インド</td><td>スクリーンマースター3000</td><td>肝臓機能試験用生化学分析装置</td></tr><tr><td>ベタジン(ポビドン-ヨウ素溶液)</td><td>-メディケア;インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし (現地調達)</td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット (クラスI)</td><td>Kartos international;インド</td><td></td><td>カタログ番号不定(現地調達)</td></tr><tr><td>Bright Field Microscope</td><td>Olympus, Japan</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime (Taxim&reg;)</td><td>アルケム;インド</td><td></td><td>セフォタキシムナトリウム注射、特定のカタログ番号なし(現地調達)</td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>シグマ;米国</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型</td><td>Gibcoライフサイエンス</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>ピュアスワブPvtLtd;インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし (現地調達)</td></tr><tr><td>ドレープシート</td><td>JSD Surgicals, Delhi, India</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし (現地調達)</td></tr><tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma;US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y溶液、アルコール</td><td>シグマ;米国</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>の主要な外科手術;インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし (現地調達)</td></tr><tr><td>ガス麻酔システム</td><td>Ugo Basile;イタリア</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Himedia、インド</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>脱毛クリーム(Veet&reg;)</td><td>レキットベンキーザー、インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし(現地調達)</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン溶液、メイヤーズ</td><td>シグマ;米国</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>ハイメディア;インド</td><td>RM554</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ 羊精巣</td><td>シグマ由来;US</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>I.V. カニューレ (プラスフロン)</td><td>Mediplus, India</td><td>Ref 1732411420</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringes</td><td>BD;US</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン(フォラン&reg;)</td><td>Asecia Queenborough</td><td>No B506</td><td>吸入麻酔</td></tr><tr><td>薬ケタミン (Ketamax&reg;)</td><td>トロイカ・ファーマシューティカルズ・リミテッド</td><td></td><td>ケタミン塩酸塩IP、特定のカタログ番号なし(現地調達)</td></tr><tr><td>メロキシカム(Melonex&reg;)</td><td>インタス・ファーマシューティカルズ・リミテッド;インド</td><td></td><td>カタログ番号不定(現地調達)</td></tr><tr><td>マイクロニードルホルダー ストレート& 湾曲</td><td>したメルシャン。イングランド</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>マイクロニードルホルダーストレート& 湾曲</td><td>したメルシャン。イングランド</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>Histo-Line Laboratories, Italy</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Thread</td><td>Mighty;インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし(現地調達)</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Himedia;インド</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td><td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td><td>P3060</td><td>特定のカタログ番号なし</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia;インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし (現地調達)</td></tr><tr><td>メス</td><td>Major Surgicals;インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし(現地調達)</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>主要な外科;インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし (現地調達)</td></tr><tr><td>SGOT (ASAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし (現地調達)</td></tr><tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, India</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし (現地調達)</td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation;米国</td><td></td><td>:特定のカタログ番号はありません</td></tr><tr>:<td>スクロース</td><td>シグマ;US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade No. 22</td><td>La Medcare, India</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし(現地調達)</td></tr><tr><td>Surgical Board</td><td>Locally Made</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし(現地調達)</td></tr><tr><td>Surgical White Tape</td><td>3M India;インド</td><td>1530-1</td><td>マイクロポア外科用テープ</td></tr><tr><td>縫合Ethicon</td><td>、Johnson&縫合ジョンソン、インド</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ (1ml、26 g)</td><td>ディスポバン;インド</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし (現地調達)</td></tr><tr><td>トリマー (クリッパー)</td><td>フィリップス</td><td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td><td></td></tr><tr><td>計量機</td><td>ブラウン</td><td></td><td>特定のカタログ番号なし (現地調達)</td></tr><tr><td>ウィリアムズ E メディア</td><td>ハイメディア;インド</td><td>AT125</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン(キシラキシン&reg;)</td><td>Indian Immunologicals Limited</td><td></td>の<td>鎮静剤、麻酔前剤、鎮痛剤、筋弛緩剤</td></tr></tbody></table>

70%部分肝切除術とアセトアミノフェンを組み合わせた急性肝不全ラットモデルの生成

Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen

急性肝不全(ALF)は、代謝、生化学的、合成、および肝臓の解毒機能の喪失をもたらす様々な病因によって引き起こされる臨床状態である。ほとんどの不可逆的な肝臓障害の場合, 直交異方性肝移植 (OLT) 唯一の利用可能な治療法.ALFの治療の治療可能性を研究するには、ALFの動物モデルにおけるその以前の試験が不可欠である。現在の研究では、ラットのALFモデルは、70%の部分肝切除術(PHx)と48時間の治療ウィンドウを提供するアセトアミノフェン(APAP)の注射を組み合わせることによって開発されました。肝臓の中央および左横葉を除去して肝臓塊の70%を切除し、APAPは2日間手術後に24時間与えられた。ALF誘発動物の生存率は著しく低下することが分かった。ALFの発症は、酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アルカリホスファターゼ(ALP)の血清レベルを変化させることによって確認された。プロトロンビン時間(PT)の変化;国際正規化比(INR)の評価。qPCRによる遺伝子発現プロファイルの研究は、アポトーシス、炎症、および肝障害の進行に関与する遺伝子の発現レベルの増加を明らかにした。肝細胞の拡散変性および免疫細胞の浸潤は、組織学的評価によって観察された。ALFの可逆性は、同系健康ラット肝細胞の脾臓内移植後のALT、AST、およびALPの生存および血清レベルの回復によって確認された。このモデルはALFの病態生理学を研究し、ALFのための新しい療法の可能性を評価するために利用できるALF動物モデルに信頼できる代わりを提示する。2つの異なるアプローチの使用はまた、物理的および薬物誘発性肝障害の組み合わせ効果を研究することを可能にする。現在のプロシージャの再現性と実現可能性は、モデルの追加の利点です。

ALFの動物モデルにおける生存率 70%PHxと組み合わせてALFを引き起こすAPAPの最適な用量は、750 mg/kgの体重として標準化された。治療レジメンは、動物が手術から完全に回復した70%PHxの後に24時間開始し、24時間間隔で2つのAPAP用量から構成された。死亡率は、APAPの2回目の投与後80%の割合で観察され、48時間後の手術後に観察された。生存率を分析し、カプランマイヤー法を使用してプロットした(図1)。このモデルによって提供される死亡および期間の再現性は、ALFに対する治療的介入を研究するための適切な候補となる。
研究のために考慮された動物の4つのグループ:グループ1(対照群、生理結度のみ)、グループ2(750 mg/kg体重でのAPAPのみ)、グループ3(70%PHxの生理行治療)およびグループ4(70%PHxの750 mg/kg体重でのAPAP)。3匹の動物が全ての群に含まれ、各群から2つの代表的な画像が含まれる。全4群の動物は、それぞれの治療の2...

現在の研究で開発された急性肝不全動物モデルは、潜在的な治療法の研究のための実行可能な代替手段を提示します。現在のモデルは物理的および薬物誘発性肝障害の結合効果を採用し、新しい療法の可能性を研究するために適切な時間枠を提供する。

Acute liver failure (ALF) is a clinical condition caused by various etiologies resulting in the loss of metabolic, biochemical, synthesizing, and ...

急性肝不全またはALFは、一般的に健康な肝臓における肝臓損傷の急速な発達として定義され、その主要な機能の重篤な障害を伴う。異所性肝移植は、ほとんどの症例で唯一利用可能な治療法である。しかし、肝臓ドナーの不足のために、ALF患者の死亡率は非常に高い。代替治療アプローチの可能性を研究し、ALFの病態生理学をよりよく理解するために、疾患の動物モデルが採用されている。ALFモデルの多くは、アセトアミノフェン、四塩化炭素、コンカナバリンA、リポ多糖、D-ガラクトサミンおよびチオアセトアミドの肝毒性作用に基づいている。しかし、再現性や可逆性が悪い、他の重要な臓器への毒性、ヒト疾患の病理や種の変動の反映が悪いなど、いくつかの欠点があります。したがって、再現性があり、治療介入の効果を研究するのに十分な時間間隔を可能にする、より良いモデルシステムが必要です。現在の研究では、ラットのALFモデルは、部分的な肝切除術とアセトアミノフェン肝毒性の効果を組み合わせることによって作成されています。肝臓の中央値および左横葉は、70%の肝臓質量を切除するために除去され、さらに、アセトアミノフェンがALFを引き起こすために与えられる。このモデルにおけるALFの開発は、生化学的および組織学的分析と肝臓損傷の可逆性を特徴とし、同種性健常ラット肝細胞の移植によって確認された。体重が180〜250グラムの範囲内にあるウィスターラットが現在の研究で使用された。以下のステップは、ラットにおけるALFの誘導のための外科的処置を説明する。動物は、腹腔内にケタミンキシラジン混合物を注入することによって麻酔を行う。完全麻酔は動物のつまみで確認され、ペダル反射がない場合にのみさらなる手順が行われる。角膜乾燥を防ぐために、両方の目にカルボキシメチルセルロースベースの目滴が適用されます。動物は白いテープを使用して外科用板に拘束される。髪は電気クリッパーを使用して右上腹部の外科領域から取り除かれます。70%エタノールとポビトンヨウ素の3つの交互スクラブで、円形の動きで滅菌綿パッドを使用して外科部位を消毒する。切断される皮膚は、胸骨のすぐ下に、西フォイドに垂直で胸部に平行にマークされています。約3センチメートル、1センチの開口部を有する滅菌ドレープシートは、マークされた皮膚の上に配置される。約2〜3センチメートルの横断切開は、メスの助けを借りてマークされた線に沿って行われます。切開部付近の下層筋層を有する皮膚の付着は、滅菌湿潤した綿の先端によって穏やかに除去される。次に、横切りは、xiphoidプロセスのすぐ下の腹膜層を通して行われます。肝臓の左葉は、2つの生理的湿潤した綿の先端の助けを借りて胸郭に穏やかな圧力を与えることによって露出される。無菌ナイロン糸ループは、露出した肝臓の葉の周りに滑り込む。ループは慎重にマイクロ解剖鉗子または綿棒の助けを借りて葉の基部に取られる。マイクロサージャリー針ホルダーとマイクロ鉗子の助けを借りて、ループの両端は結ばされ、結び目を可能な限りローブの基部の近くに置きます。これは、血管を収縮させ、肝臓の葉が除去された後の出血を軽減するためである。2 つの追加の結び目は反対側に結ばれています。結ばれたローブは、虚血性の切り株を残すマイクロサージャスを使用して結び目のすぐ上に切断されます。同様に、肝臓の中央値葉は綿の先端を使用して持ち上げられる。肝臓の中型葉の独特な形を認識する。ローブの上にナイロン糸ループを置き、しっかりとその端を結びます。2つの追加の結び目が反対側に結ばれ、ローブを分け替える。ローブを除去した後、腹葉は、吸収性のcatgutクロミック4/0吸収性縫合糸を使用して縫合され、続いて皮膚は単純な縫合糸を中断して縫合する。皮膚閉鎖後、ポビドネヨウ素溶液が外科部位の周囲に適用される。ドレープシートを取り外し、動物を手術台から取り除きます。5%グルコース溶液の1mlで12ミリグラムのセフォタキシムの抗生物質用量は、術後感染のリスクからそれを保護するために動物に腹腔内投与される。手術後の疼痛軽減のために、鎮痛性メロキシカムは、典型的には1kg体重当たり1mgが動物に皮下に与えられ、その後2日間毎日用量が投与される。動物は暖かい回復ケージに移動されます。動物は30〜40分以内に意識し、動き始めます。手術した動物は、外科的創傷が完全に治癒するまで隔離され、3〜4日かかる場合があります。ALFを誘導するために、アセトアミノフェンの体重当たり750ミリグラムおよびメロキシカムの第2の用量は、部分的な肝切除術後24時間腹腔内に注入される。この用量レジメンは、24時間後に繰り返される。ALFの誘導後、動物の生存率は著しく低下することが分かった。ALFの開発を特徴付けるために、操作動物はアセトアミノフェンの2回目の投与後に安楽死させ、様々な生化学的および組織学的研究が行われた。結果はビデオで先に説明されています。ALF誘導群における生存率は、アセトアミノフェンの2回目の投与の24時間以内に80%まで著しく減少し、最大80%の死亡率が観察された。肝臓の損傷は、ALF誘導群において形態学的レベルで明らかであり、わずか70%分肝切除グループであった。対照群および唯一のアセトアミノフェン処置群は健康な外観を有していた。アラニンアミノトランスレポラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスファーゼおよびアルカリホスファターゼの酵素レベルは、他の群と比較してALF誘導群において高く上昇することが判明した。qPCRによる遺伝子発現プロファイルの分析は、アポトーシス、炎症および肝臓損傷の進行に関与する遺伝子の発現の上昇を示した。肝組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、対照群において主に正常な肝細胞を明らかにした。ALF群では、主に中程度のマクロ小胞性脂肪変性が観察された。プロトロンビン時間および国際正規化比はALF誘導群において上昇することが判明し、血液凝固過程の妨げを示す。生存率は、同系の健常性ラット肝細胞の移植後にALF誘導群で回復することが判明した。アラニンアミノトランスレポラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスファーゼおよびアルカリホスファターゼの血清レベルは、細胞移植後のALF誘導動物において回復することが明らかになった。ラットでALFを誘導するこの方法は再現性があり、良好な可逆性を示し、新しい治療法をテストするのに適した時間枠を提供する。したがって、このモデルは、ALFを治療するための潜在的な治療アプローチの評価のための効率的な疾患モデルとして役立つことができる。

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再門脈部分肝移植のラット体内血管指向 70% 肝切除

肺葉切除: 形態学的肝再生手術モデル

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マウス手術モデルにおける拡張78%肝切除術

学ぶ急性肝不全ラットモデルの作製法。70%部分肝切除術とアセトアミノフェン投与を組み合わせた再現性の高い肝障害誘導法で、治療介入の効果評価に適した時間枠を提供し、新規治療法開発に貢献します。

70%部分肝切除術とアセトアミノフェンを組み合わせた急性肝不全ラットモデルの生成

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