Name: マウス乳房上皮HC11細胞とEpH4細胞の分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶマウス乳房上皮細胞HC11とEpH4の分化誘導法。3次元マンモスフェア培養とシグナル伝達解析により、がん治療標的の発見と分化・腫瘍化の関連性を解明する。

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HC11細胞株はD.メディナ博士(テキサス州ヒューストン)によって親切に提供された。著者らは、多くの試薬と貴重な提案のためにクイーンズ大学のアンドリュー・クレイグ博士に感謝しています。EpH4細胞は、C.ロスケリー博士(バンクーバーのUBC)からの贈り物でした。コリーン・シックは、3D文化研究のための優れた技術支援を提供しました。
カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)、カナダ健康研究所(CIHR)、カナダ乳癌財団(CBCF、オンタリオ支部)、カナダ乳癌研究同盟の資金援助オンタリオ・センター・オブ・エクセレンス、乳がんアクションキングストン(BCAK)、クレア・ネルソンのLRへの助成金による遺贈基金は、感謝の念をうっていいます。CIHR、CBCF、BCAK、がん研究協会から助成金を受けたPTGは、カナダイノベーション財団、CIHR、NSERC、カナダ癌学会のカナダ研究委員長が支援しています。MNは、NCICの学際的がん研究におけるテリー・フォックス・トレーニング・プログラムの学生シップ、大学院賞(QGA)、クイーンズ大学の学部長賞によって支援されました。MGは、アメリカ陸軍乳がんプログラム、オンタリオ州の研究イノベーション省、クイーンズ大学の諮問研究委員会の博士研究員によって支援されました。VHは、CIHRと提携して、学際癌研究におけるテリー・フォックス財団研修プログラムのCBCF博士フェローシップと博士研究員によって支援されました。ハナド・アダンはNSERCの夏の学生シップの受給者でした。BSはクイーンズ大学の大学院賞に支えられていました。

1. HC11細胞のめっき
<ol><li>無菌技術を用いた層流フードでは、HC11細胞培地の50mLのボトルを準備します:10%のウシ胎児血清(FBS)、5 μg/mLインスリン、および10 ng/mL EGFを備えたRPMI-1640(材料表参照)。</li>
	<li>プレート 3 cm ペトリ皿あたり約 400,000 セル: HC11 培地で 20 3 cm の皿に 2 つの 10 cm、50% コンフルエントペトリ皿を渡します。細胞はよく広がらなければならないが、乾燥は避けなければならない。<ol>
<li>真空ポンプを使用してフラスコに培地を吸引します。</li>
		<li>10 cmプレートあたり250μLのトリプシン(材料表を参照)を加えます。トリプシンを広げ、取り付けられた細胞を取り除くために水平に保ちながら、プレートを横から回転させ、打つ</li>
		<li>位相コントラスト顕微鏡下で4倍の目的を観察し、ピペット処理の前に細胞がエッジから切り離し始めたことを確認します。</li>
		<li>滅菌、9インチパスツールピペットにHC11培地の約1.5 mLを吸引し、細胞に対して垂直に噴出します。すべての細胞を取り除くために潮吹きしながらペトリ皿を回転させます。細胞の乾燥を避けるために、速く働かなければなりません。</li>
		<li>HC11培地と渦巻きでボトルにすべての細胞を移します。</li>
		<li>ピペット2 mLの細胞懸濁液を各3cmペトリ皿に入れます。ペトリ料理を横に揺らし、均等に広げます。細胞を37°C、5%CO2インキュベーターに入れる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>翌日、または細胞が〜90〜100%コンフルエントである場合、培地を吸引し、培地をFBSおよびインスリンと培地に置換するが、EGFを欠いている。</li>
</ol>2. HC11細胞の分化誘導・モニタリング・定量
<ol><li>24時間のEGFを欠いている培地で細胞を成長させた後、分化培地(HIP培地)を10個の3cmプレートに加えます:10%FBSを添加したRPMI-1640、1μg/mL Hイドロコルチゾン(材料表を参照)、5 μg/mL P rolactin(材料の表を参照)。</li>
	<li>他の10個の3cmプレートをコントロールとして保管する:10%FBSと5 μg/mLインスリンがEGFおよびHIPを欠いている媒体に変更します。</li>
	<li>HIP 処理セルとコントロールの両方に 2 ~ 3 日ごとにメディアを変更します。細胞が剥離しないように慎重に培地をピペット。</li>
	<li>分化(すなわち、「ドーム」の形成)を監視するために、位相コントラスト顕微鏡下の細胞を観察する(図1A、左パネル)。細胞が緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現している場合、蛍光顕微鏡(励起= 485/20;放出= 530/25;倍率240倍;20倍の目的)で観察する(図1A、右パネル)。</li>
	<li>分化の程度を定量するには、HIP処理細胞およびコントロールの各々のペトリ皿からタンパク質を抽出し、1日1回、βカゼイン用のプローブウェスタンブロット(材料表を参照)(図1B)。<ol>
<li>1.8 mlのプラスチック遠心分離管に1.5 mL氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を削ります。</li>
		<li>350 x g、1分、4 °C で細胞をペレットします。</li>
		<li>氷冷PBSでペレット2xを素早く洗います。残留物を排水します。</li>
		<li>リシスバッファーを作る:50 mM HEPES (pH = 7.4)、150 mM NaCl、 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7,1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4,0.5 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF), 10 μg/mL アプロチニン, 10 μg/mL レプテプチン16.3cmペトリ皿あたり100μLを加えます。</li>
		<li>寒さの中で10分の10,000×gで遠心分離によってライセートを明確にします。</li>
		<li>タンパク質濃度を決定し(材料表を参照)、各サンプルから10%ポリアクリルアミド-SDSゲルに10~20μgのタンパク質をロードします。</li>
		<li>45 Vで15時間、~2~2.5hの場合は100 Vの電気phorese。</li>
		<li>電気ブロッティング転写装置を用いてニトロセルロースまたはPVDF膜に転写する(材料表参照)。</li>
		<li>トリス緩衝生理液中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)と0.1%Tween-20(TBST)でブロックします。</li>
		<li>一次抗体を加えて、ヤギの抗βカゼイン希釈1:2,000またはマウス抗βアクチン希釈1:1,000(材料表参照)。</li>
		<li>TBSTで3倍、毎回5分洗います。</li>
		<li>二次抗体を加えて、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ロバ抗ヤギ1:2,500、またはHRPリンク馬抗マウス抗体を1:10,000希釈した。</li>
		<li>TBSTで3倍、毎回5分洗います。</li>
		<li>メーカーの指示に従って膜にECL試薬を追加します(材料表を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHSマトリックスにおけるEpH4細胞のめっきと3D成長
注: マトリックスは温度 <10 °C で液体で、上記の温度では固体です。80 °Cで保管してください。使用前の夜に4°Cで解凍します。取り扱い前に-20°Cで組織培養プレートとピペットチップを前冷させ、マトリックス、プレート、ピペットチップを氷の上に置いて固化を防ぎます。
<ol><li>10% FBS および 5 μg/mL インスリンを用いて、RPMI-1640 培地で EpH4 細胞を 2D で成長させます (EGF は必要ありません)。</li>
	<li>10%(v/v,3,500 μL)または20%(v/v 2,000 μL)のマトリックスを2つの50 mL円錐形チューブに添加したEpH4成長培地を調製します。使用する準備ができるまで氷の上に保管してください。</li>
	<li>150 μLの未希釈マトリックスを備えた24ウェルプレートの10ウェル(各1cm2)をコートします。ピペットチップを使用してマトリックスを広げます。泡を作成しないでください。プレートを水平に保持したまま、プレートの側面を軽くタップして、マトリックスがウェルの底面に均等に分布していることを確認します。</li>
	<li>24ウェルプレートを37°Cで1時間インキュベートし、マトリックスが固化できるようにします。</li>
	<li>HC11細胞について上記のようにEpH4細胞をトリプシン化し、それらをヘモサイトメーターでカウントする。ウェルあたり5 x 104細胞を1.5 mLの無菌円錐形遠心チューブに移し、250 x gで5分間スピンします。</li>
	<li>慎重に媒体を吸引し、氷の上にチューブを置きます。</li>
	<li>氷上の円錐管を維持しながら、1 mLピペットチップを使用して20%マトリックスを添加したEpH4成長培地の350μLで細胞を再懸濁します。泡を避けてください。単一細胞懸濁液を確保することが重要である。</li>
	<li>底層マトリックスが固まったら(マトリックスはウェルの初期コーティングと比較して半透明で明るい色に見える)、各コーティングされた井戸に350μLの細胞懸濁液を加え、20%マトリックス層が固化できるように37°CのCO2インキュベーターに〜1時間置きます。<ol>
<li>4xの目的と位相コントラストの下で細胞を微小観察する。単一のセルが表示されている必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>20%マトリックスに懸濁した350μLの細胞の上に10%マトリックスを含む200μLのEpH4培地を加える。37 °Cでインキュベート。</li>
</ol>4. 3Dで増殖したEpH4細胞の分化誘導 (図2)
注:分化に加えて、EpH4細胞は、3D培養でHGF(肝細胞増殖因子)で刺激された場合、尿細管形成を受けることもできます。管外増殖はHIPおよびHGF刺激の10日後に見ることができる。
<ol><li>マトリックス内でめっき後1日目にEpH4細胞の分化誘導を開始する。プラスチックピペットチップを使用して、10%マトリックスを含む150μLの上部培地をウェルから慎重に取り除きます。HIPと10%マトリックスを含むEpH4培地を200μL追加します。</li>
	<li>最大 10 日間、2 日ごとに 10% マトリックス HIP 培地を交換してください。HIPを使用せずに、同じ10%マトリックス培地でコントロールセルを成長させます。</li>
	<li>位相コントラストの下でマモスフィアの形成を監視します(図3A、下部パネル)。</li>
</ol>5. 3Dで増殖したEpH4細胞の卵管形成誘導 (図3Aおよび3C)
<ol><li>ステップ 3.1 ~3.9 で詳しく説明されているように、24 個のウェルプレートと EpH4 細胞をマトリックスで成長させる準備をします。マトリックス内の細胞をめっきした翌日、プラスチックピペットチップを用いて10%マトリックスを含むEpH4培地の150μLをウェルから除去する。10% マトリックス、HIP、および 20 ng/mL HGF を含む EpH4 培地を 200 μL 追加します (材料表を参照)。</li>
	<li>10% マトリックス/HIP/HGF 培地を 2 日ごとに 12 ~14 日まで交換します。</li>
	<li>20x または 40x の目的を使用して細管の形成を顕微鏡的に監視します (図 3A、 右パネル)。</li>
</ol>6. 分化の定量:β-カゼイン用ウェスタンブロッティング
<ol><li>井戸から10%マトリックスHIP培地を慎重にピペットオフ。20%マトリックス層2xを350μLの氷冷PBSでリンスします。回転楕円体は、マトリックス層に存在している必要があります。</li>
	<li>1 mMエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を備えた700~1,000μLの氷冷PBSを直接ウェルに加えます。ピペットチップでウェルから100%マトリックスの底層を静かに取り外し、その層に存在する回転楕円体を回収します。4°Cで30分間やさしく振ります。</li>
	<li>回転楕円管の懸濁液を円錐形の管に注意深く移します。500 μLのPBS-EDTAでウェルをリンスし、ウェル内の残りの回転楕円体を回収し、円錐形のチューブに加えます。</li>
	<li>さらに30分間氷上でロックします。マトリックスが完全に溶解していることを確認してください。可視マトリックスの束が見られる場合は、PBS-EDTA を追加するか、長く振ります。</li>
	<li>350 x gで 5 分間回転楕円体をペレットにする溶液を遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、氷冷リシス緩衝液中のスフェロイドをリスピー化し、および16以上のステップ2.5のようにウェスタンブロッティングによりβカゼイン、サイクリンD1、およびp120RasGAP用プローブを用いる。一次抗体として、ヤギの抗β-カゼイン希釈1:2,000、ウサギ抗サイクリンD1希釈1:2,000、マウス抗p120希釈1:2,000を使用してください。二次抗体の場合は、HRPリンクロバ抗ヤギ希釈1:2,500、HRPリンクロバ抗ウサギ希釈1:2,500、HRPリンク馬抗マウス希釈1:10,000を使用してください。</li>
</ol>

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著者らは開示する競合はありません。

HC11細胞は、新生物の形質転換と共に分化の研究に理想的に適しています。さらに、HC11細胞はMo-MLVベースのレトロウイルスベクターに容易に感染し、様々な遺伝子を発現できることが利点です。私たちの手では、EpH4細胞はHC112よりも同じレトロウイルスベクターに感染することがより困難であった。
細胞間接触および増殖停止は、HC11細胞分化のための重要な前提条件である。したがって、細胞層全体で均一な分化を達成するためには、播種時のペトリ皿における細胞の均一な分布を達成することが重要である。これは、差別化の定量が望ましい場合に特に重要です。トリプシン処理は、単一細胞の懸濁液が達成され、細胞が操作のために生存率を失わないように最適化されなければならない。
トリプシン化される細胞は、高密度に成長した細胞が互いに強く付着する傾向があり、それらを分離することは困難であるため、サブコンフルエント(50〜70%)でなければならない。細胞の乾燥を避けるために、層流フードの床に平らなペトリ皿で吸...

正常な組織や腫瘍では、細胞は3次元組織で隣人との接着の広範な機会を有し、これは高密度細胞増殖によって培養中に模倣される。細胞間接着は、主にカドヘリン受容体を介して媒介され、細胞および組織の構造を定義する。興味深いことに、カドヘリンは、特に生存シグナル伝達1において、シグナル伝達においても強力な役割を果たしていることを最近実証した。逆説的に、カドヘリンから発せられるこれらの細胞間接着シグナルの一部は、最近、分化と新生物2の両方によって共有されることがわかった。ここでは、マウス胸上皮細胞株の2つの代表的なタイプHC11およびEpH4における分化誘導および評価の方法を記載する。
HC11マウスの胸上皮細胞株は、上皮細胞分化の研究に有用なモデルを提供することができる。HC11細胞は、妊娠中のバルブ/cマウスの乳腺由来のCOMMA-1D由来細胞株である3。他のCOMMA−1D誘導体クローンとは対照的に、HC11クローンは、発泡性ホルモン3による内因性β-カゼイン遺伝子のインビトロ誘導のために他の細胞型と外因性付加された細胞外マトリックスまたは共培養のための要件を有さない。この細胞株は、正常乳上皮の重要な特徴を保持しているため分化試験で広く使用されている:HC11細胞は、乳腺脂肪パッド4をクリアして、そのダクト上皮を部分的に再構成することができる。また、Hイドロコルチゾンやデキサメタゾンなどのステロイドの存在下でプラスチックペトリ皿表面に結合して成長した場合に2次元(2D)培養で分化することができ、さらに、表皮成長因子(EGF)を欠く上皮成長因子(EGF)に加えて、5、6、7の異化阻害薬である。これらの条件下では、HC11細胞はβカゼインやWAPなどの乳タンパク質を産生し、これは誘導後4日以内にウェスタンブロッティングによって検出可能である。同時に、HC11細胞の一部は、ストカスティックな方法で「ドーム」と呼ばれている初歩的な乳腺様構造を形成する。ドームは、誘導後4〜5日目に見え、徐々に10日目までサイズが増加し、βカゼイン産生の増加に伴って8.興味深いことに、HC11細胞は変異型p539を有し、したがって前生性状態を表す。このため、HC11モデルは、同じ細胞系の新生物と組み合わせて分化のシグナリングネットワークを研究するのに理想的です。
EPH4細胞は、IM−2細胞の誘導体であり、元来、妊娠中のバルブ/cマウス10から単離された自発的に不死化マウス乳腺上皮細胞に由来する非腫瘍性細胞株である。EpH4細胞は2D培養で連続上皮単層を形成するが、腺様構造10,11に分化しない。しかし、EHSマウス肉腫細胞12によって産生される細胞外マトリックスタンパク質の混合物からなる材料での3D増殖に続いて(EHSマトリックス、マトリックス、またはマトリゲル、材料の表を参照)、HIPによる刺激に加えて、EpH4細胞は乳腺分化の初期段階を再現することができる。これらの条件下では、EpH4細胞は、吸盤基底極性および中空腔を示す回転楕円体(マンモスフィアとも呼ばれる)を形成し、乳タンパク質β-カゼインおよびWAPを産生し得る。未分化化しているHC11細胞とは対照的に、幾つかは間葉マーカー13を発現するが、EpH4細胞は純粋に発光形態14を示す。EpH4細胞はまた、デキサメタゾン、インスリン、およびプロラクチン15による刺激を通じて2D培養で乳タンパク質を産生することが報告されている。しかし、このアプローチは、3D培養における乳腺微小環境を模倣する調節効果の研究を妨げる。

<table><tbody><tr><td>30% アクリルアミド/0.8% Bis Solution</td><td>Bio Rad</td><td>1610154</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-Cyclin D1 antibody</td><td>rabbit, Santa Cruz</td><td>sc-717</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-p120 antibody</td><td>mouse, Santa Cruz</td><td>sc-373751</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&β; actin antibody</td><td>mouse, Cell Signalling technology</td><td>3700</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>アンチベータ;カゼイン抗体</td><td>ヤギ、サンタクルーズバイオテクノロジーsc-17971</td><td></td>ウェ<td>スタンブロッティング</td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>バイオショップ</td><td>APR600</td>溶解<td>バッファー</td></tr><tr><td>ビシンコニン酸溶液</td><td>シグマ</td><td>B9643-1L-KC</td><td>タンパク質測定ウ</td></tr><tr><td>シ血清アルブミン</td><td>バイオショップ</td><td>ALB007.500</td>タンパク質<td>測定</td></tr><tr><td>クラリティウェスタンECL基質</td><td>バイオラッド</td><td>170-5061</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Copper(II) sulphate</td><td>Sigma</td><td>C2284-25ML</td><td>Protein Determination</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>Staining</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>HC11細胞用培地</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ヤギ-抗ウサギ-HRP</td><td>サンタクルーズ</td><td>SC-2004</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>肝細胞増殖因子組換え</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>馬 抗マウスHRP</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>7076</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td></td><td>Σ H0888</td><td>HIP 中</td></tr><tr><td>型インスリン</td><td>Σ</td><td>I6634</td><td>HIP 中</td></tr><tr><td>層流フード</td><td>BioGard Hood</td><td></td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>バイオショップ</td><td>LEU001.10</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>マトリックス (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヤギHRP</td><td>サンタクルス</td><td>sc-8360</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 試薬</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>染色</td></tr><tr><td>多光子共焦点顕微鏡</td><td>ライカ TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>バイオショップ</td><td>SOV850</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>Na4P207</td><td>シグマ</td><td>125F-0262</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Shop</td><td>SOD001.1</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Nikon デジタルカメラ</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース</td><td>Bio Rad</td><td>1620112</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Fisher科学</td><td>30525-89-4</td><td>染色</td></tr><tr><td>位相コントラスト顕微鏡</td><td>オリンパス IX70</td><td></td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>フェニルメチルスフォニル フッ化物</td><td>シグマ</td><td>329-98-6</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>プロラクチン</td><td>シグマ</td><td>L6520</td><td>HIP 培地</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>シグマ</td><td>R8758</td><td>細胞培養媒体</td></tr><tr><td>組織培養皿35</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900。</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>組織培養プレート-24ウェル</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836.300</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>トランスファー装置</td><td>CBSサイエンティフィック株式会社</td><td>EBU-302</td>ウェ<td>スタンブロッティング</td></tr><tr><td>トリスアセテート</td><td>バイオショップ</td><td>TRA222.500</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマ</td><td>9002-07-7。</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>Veritical ゲル電気泳動システム</td><td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr></tbody></table>

マウス乳房上皮hc11細胞とeph4細胞の分化

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

カドヘリンは、細胞分化および腫瘍の調節において重要な役割を果たす。ここでは、2つのマウス胸上皮細胞株HC11とEpH4の分化誘導の起源と方法、および乳腺の発達と腫瘍性形質転換の相補的段階を研究するためのその使用について説明する。
HC11マウスの乳房上皮細胞系は、妊娠中のバルブ/cマウスの乳腺に由来する。これは、胎児の子牛血清およびHイドロコルチゾン、InsulinおよびPロラクチン(HIP培地)を含む培地中のプラスチックペトリ皿表面に結合するように成長した場合に分化する。これらの条件下で、HC11細胞は乳タンパク質βカゼインおよび乳清酸性タンパク質(WAP)を産生し、乳腺上皮細胞の授乳と同様に、初歩的な乳腺様構造を形成し、「ドーム」と呼ばれます。
EpH4細胞株は、妊娠中のバルブ/cマウスから単離された自発的に不死化したマウス乳腺上皮細胞に由来した。HC11とは異なり、EPH4細胞はHIP培地で3次元(3D)増殖条件下で培養すると、スフェロイド(マンモスフィアとも呼ばれる)に完全に分化することができます。細胞はトリプシン化され、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム(EHS)マウス肉腫細胞によって産生される細胞外マトリックスタンパク質の混合物からなる20%マトリックスで懸濁し、プラスチックペトリ皿またはマルチウェルプレートをコーティングする濃縮マトリックスの層の上にメッキし、10%マトリックス含有HIP培地の層で覆われる。これらの条件下で、EpH4細胞は、尖面基底極性、中空ルーメンを示し、βカゼインおよびWAPを産生する中空回転楕円体を形成する。
これらの技術を用いて、我々の結果は、カドヘリン/Racシグナルの強度がHC11細胞の分化に重要であることを実証した。Rac1は分化に必要であり、活性化されたRacV12の低レベルは分化を増加させるが、高いRacV12レベルは新生物を誘導しながら分化をブロックする。対照的に、EpH4細胞は乳腺上皮分化における初期段階を表し、これは低レベルのRacV12によっても阻害される。

上皮細胞とアディポサイトの分化にはカドヘリン2の合流と関与が必要とすることが長い間知られている。我々および他の人々は、E-またはN-カドヘリンおよびカドヘリン-11の細胞間接着および関与を実証した。 培養細胞の合流と同様に、小さなGTPases Racおよび細胞分裂制御タンパク質42(Cdc42)の活性の劇的な増加を引き起こし、このプロセスはインターロイキン6(IL6)ファミリーサイトカインとStat3(転写-316、17)1の活性化をもたらす。カドヘリン/Rac/IL6/Stat3経路の多くの成分は、分化と腫瘍性の両方の形質転換に関与する可能性があるため、これら2つの正反対プロセスの相互関係の研究のための分子ハンドルを提供する。
上...

我々は、2つの胸上皮線HC11およびEpH4の分化誘導のための技術を記述する。どちらも乳タンパク質を産生するために胎児の子牛血清、インスリン、プロラクチンを必要としますが、EpH4細胞は3次元培養でマンモスフィアに完全に分化することができます。これらの相補モデルは、分化および新生物のシグナル伝達研究に有用である。

マウス乳房上皮HC11細胞とEpH4細胞の分化

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

HC11およびEpH4細胞は、培養中に分化し得るマウス乳房上皮細胞株である。同時に、これらの細胞は、多数の腫瘍遺伝子によって形質転換され得る。これらの細胞は、分化と腫瘍性の形質転換との相互関係の研究に最適です。これらの技術は、がん治療の標的を発見するためにシグナル伝達研究で使用することができる。例えば、小さなGTPase Racおよび他の分子は、高レベルに発現すると乳房上皮細胞の形質転換を引き起こす可能性があるが、驚くべきことに低レベルでは分化を誘発する可能性がある。他の信号トランスデューサも同様の動作をする場合があります。この原理は、細胞合流が重要な役割を果たす他のタイプの分化(例えば、有数細胞または筋管の分化)にも適用される。この技術を初めて行う人は、HC11細胞のめっきが重要であることを覚えておいてください。これは、細胞間接触が分化に重要であるためである。注意すべきもう一つのポイントは、任意の残基がタンパク質の決定に影響を与えるので、マトリックスからのEpH4細胞の適切な抽出がタンパク質定量に重要であるということです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、プロトコルの一部の詳細を紙に記述することが困難であるため、便利です。原稿の指示に従ってHC11細胞培地の50ミリリットルのボトルを準備することによって開始します。細胞をプレートするには、5つの6センチメートル50%コンフルエントペトリ皿から培地を吸引し、無菌9インチの綿を差し込んだパスツールピペットを使用して約1.8ミリリットルのトリプシンで細胞を洗います。その後、プレートあたり200マイクロリットルのトリプシンを加え、プレートを旋回して取り付けられた細胞を取り除きます。4Xの目的で位相対視下の細胞を観察し、外れ始めたことを確認します。その後、無菌9インチのパスツールピペットで約1.5ミリリットルのHC11培地を吸引し、飛び散らないように皿を回転させながら細胞に対して垂直に噴出します。すべての細胞をHC11培地でボトルに移し、渦巻いてボトルに均等に分散させます。その後、1皿あたり2ミリリットルの細胞をピペット処理することによって、細胞懸濁液を20の3センチメートルのペトリ皿にアリコートする。ペトリ皿を揺らし、細胞を広げ、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。次の日に細胞が90〜100%コンフルエントである場合、培地を吸引し、それをFBSで培地に置き換えますが、EGFを使用しない。24時間EGFなしで培地で細胞を成長させた後、10皿に分化培地を追加し、コントロールとして他の10の料理を維持するために最大10日間細胞を成長させます。HIP処理細胞とコントロールセルの両方で、2~3日ごとに培地を交換します。分化を監視するには、位相コントラスト顕微鏡で細胞を観察します。細胞が緑色蛍光タンパク質を発現している場合は蛍光顕微鏡を使用してください。さらに、HIP処理細胞からタンパク質を抽出し、細胞を1日1回コントロールし、ウェスタンブロット分析を行うことで、分化の程度を定量化します。EpH4成長培地、EHSマトリックス、および2つの円錐50ミリリットルチューブを氷の上に集めて配置します。マイナス20°Cのピペットチップを備えた組織培養プレートをプレチルし、2つの50ミリリットル円錐形チューブで10または20%マトリックスを添加したEpH4成長培地を準備し、使用する準備ができるまで氷の上に保管します。プレチルド組織培養プレートをマイナス20度で取り出した後、ピペットでマトリックスを広げ、希釈されていないマトリックスの150マイクロリットルで24ウェルプレートのウェル10をコーティングします。マトリックスを広げるときには、バブルを作成しないようにします。その後、プレートの側面をそっとタップし、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートし、マトリックスを固めます。一方、先に述べたEpH4細胞をトリプシン化し、トリプシン化細胞の再懸濁後に単細胞懸濁液を確保することにより、分化に備える。次に、ヘモサイトメーターで懸濁液中の細胞を数える。1.5ミリリットルの無菌円錐型遠心分離管にウェルあたり4つの細胞に5回10回移し、5分間gの250倍でそれらを回転させます。上清媒体を慎重に吸引し、チューブを氷の上に置きます。1ミリリットルのピペットチップを使用して、20%マトリックスを補充したEpH4成長培地の350マイクロリットルの細胞を再懸濁し、氷上のチューブを気泡を避けるようにします。底層が固まったら、コーティングされた各ウェルに350マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、20%マトリックス層を固化させるために1時間摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに入れます。位相コントラスト顕微鏡で細胞を観察し、単一の細胞が見えるようにします。その後、上に10%マトリックスを持つEpH4培地の200マイクロリットルを加え、37°Cでプレートをインキュベートします。マトリックス内の細胞をめっきした翌日に分化誘導を開始する。慎重にトップ10%マトリックス培地の150マイクロリットルを除去し、HIPと10%マトリックスを含むEpH4培地の200マイクロリットルを追加し、コントロールのためにHIPなしの10%マトリックス培地を追加します。位相コントラスト顕微鏡で最大10日間の監視用の培地を2日ごとに交換します。分化を定量化するには、10%マトリックスHIP培地をウェルから慎重にピペットオフし、氷冷PBSの350マイクロリットルで20%マトリックス層をすすいだ。その後、1ミリモルEDTAを持つ氷冷PBSの70〜100マイクロリットルを直接井戸に加え、ピペットチップで100%マトリックスの底層を静かに取り外します。プレートを摂氏4度で30分間軽く振ります。慎重に円錐形のチューブにスフェロイド懸濁液を移し、残りのスフェロイドを回復するためにPBS EDTAの500マイクロリットルでウェルをすすいだ。さらに30分間氷の上でチューブを揺らし、マトリックスが完全に溶解することを確認します。可視マトリックスの塊が見られる場合は、PBS EDTAを追加するか、長く振ります。溶液を350倍gで遠心分離し、スフェロイドをペレットする。次いで上清を吸引し、スフェロイドをライスし、ウェスタンブロッティングによりβカゼイン、サイクリンD1、およびp120RasGAPの細胞をプローブする。HC11細胞のRacシグナルの強さに対する分化の顕著な依存性がある。内因性CRAC1は分化に必要であり、変異活性化RacV12の低レベルは分化能力の増加を引き起こすが、高いRacV12レベルは分化のブロックを誘発し、新生物を誘導する。EpH4細胞の分化特性を3Dマトリックス培養で調べたところ、βカゼイン産生は8~10日でピークに達し、CYCLIN D1発現はHIP刺激後4~6日で最大であったことがわかりました。個々の細胞の位置を決定するために、それらはDAPIで染色され、共焦点顕微鏡でイメージングした。内部細胞死および中空腔の形成はマンモスフィアで観察され、HGFの添加は管状構造の形成をもたらした。この技術を初めて行う人は、HC11細胞のめっきが重要であることを覚えておいてください。また、任意の残基がタンパク質の決定に影響を与えるので、マトリックスからのEpH4細胞の適切な抽出は、タンパク質定量のために重要です。この手法を使用して、同様の方法で動作する他の信号トランスデューサを調べることができます。癌にドライバー突然変異がある場合、残りの低レベルが実際に分化を誘発するので、その完全な阻害は必要ありません。

differentiation-of-mouse-breast-epithelial-hc11-and-eph4-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

HC11乳腺刺激分化はmammospheresと呼ばれるドーム型の構造体の形成によって特徴づけすることができます。構造は、乳腺刺激分化を定量化を支援するために、位相差顕微鏡で列挙することができます。...

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マウス乳房上皮HC11細胞とEpH4細胞の分化

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